Summary
우리는 네이티브 pancratistatin 같은 비교 안티 - 암 활동과 pancratistatin의 소설 아날로그를 합성했습니다, 흥미롭게도, tamoxifen과 조합 치료 noncancerous 섬유아 세포에 대한 최소한의 효과와 대상 mitochondrial에 의한 apoptotic 및 autophagic 유도의 급격한 향상이 나왔고. 따라서, tamoxifen와 함께 JCTH-4는 안전한 안티 암 치료를 제공할 수 있습니다.
Abstract
유방암은 북미에서 여인 중에 가장 흔한 암 중 하나입니다. 이온화 방사선 등 많은 현재의 안티 - 암 치료, DNA 손상을 통해 apoptosis를 유도. 불행히도, 이러한 치료는 암세포가 아닌 선택이며, 정상 세포에서 유사한 독성을 생산하고 있습니다. 우리는 천연 복합 pancratistatin (PST)에 의해 암 세포에서 apoptosis의 선택적 유도를보고했습니다. 최근 소설 태평양 표준시 아날로그, 7 deoxypancratistatin (JCTH-4)의 C-아세 톡시 메틸 유도체는 드 노보 합성에 의해 생산과 몇 가지 암 세포 라인에 비교 선택적 apoptosis를 유도하는 활동을 전시했다. 최근 autophagy는 화학 요법에 대한 반응으로 프로 생존과 프로 사망 메커니즘 양쪽으로 malignancies에 연루되었습니다. Tamoxifen (TAM)는 결국에 수많은 암의 프로 생존 autophagy의 유도를 보여주었다. 본 연구에서는 혼자와 TAM와 함께 JCTH-4의 효능은 인간의 유방 cance에서 세포 죽음을 유도하는R (MCF7)과 neuroblastoma (SH-SY5Y) 전지 평가되었다. 혼자 JCTH-4 autophagy의 일부 유도와 apoptosis의 상당 유도를 일으킨 반면 혼자 TAM은 autophagy 유도하지만, 볼품없는 세포의 죽음. 흥미롭게도, 조합 치료 apoptotic과 autophagic 유도의 급격한 증가를 굴복. 우리는 촬영된 현미경을 사용하여 조합 치료 TAM 유발 autophagy를 겪고 MCF7 세포에서는 시간 의존 형태학의 변화, JCTH-4-유도된 apoptosis와 autophagy 및 가속 세포 죽음을 모니터링. 우리는이 암 세포의 mitochondrial 타겟팅을 사용하여 apoptosis / autophagy를 유도하기 위해 이러한 화합물을 증명하고있다. 중요한 것은 이러한 치료 noncancerous 인간 섬유아 세포의 생존에 영향을주지 않았다. 따라서 이러한 결과는 JCTH-4 TAM과 결합된이 유방암과 neuroblastoma 세포에 대한 안전하고 매우 강력한 항정 암 치료로 사용될 수 있음을 나타냅니다.
Protocol
소개
Apoptosis, 또는 프로그램된 세포 죽음을 입력한은 사망 수용체에 사망 리간드의 바인딩 또는 본질적 통해 extrinsically 작동할 수 생리적 과정이다. apoptosis의 본질적인 경로는 같은 DNA의 손상과 mitochondrial 기능 장애로 세포내 스트레스에 의해 시작되며 이것이 궁극적으로 mitochondrial 막 잠재력 mitochondria, 방산 (MMP), mitochondrial intermembrane 공간에서 apoptogenic 요인 출시 permeabilization로 연결하고, 후속 실행 apoptosis 1.
Autophagy는 세포 휴식이 저하하고, 플라즈마 막 무결성을 유지하면서 독자적인 세포 내 구성 요소를 재활용하는 과정이며 그것은 산화 스트레스, hypoxia, 단백질을 합산, 영양소 부족, 성장 인자가 결핍되어서 포함한 세포 스트레스의 다른 유형에 의해 실행하고있다 손상된 organelles 2. 초기 단계에서이 과정에서, cytosolic 자료 autolysosomes을 형성 lysosomes에 융합 autophagosomes 두 번 membraned vesicles에 의해 가득 채우고있다. lysosomal 융합을 게시, 이전 autophagosomes 의해 촬영 cytosolic 자료는 lysosomal 효소 2에 의해 저하입니다. 이 통로의 광범위한 활성화 autophagic 세포 사망 또는 유형 II 프로그램된 세포 사망 3 이어질 수있다 세포 내 구성 요소의 광범 저하를 얻을.
세포 죽음의 회피는 암 4의 특징 중 하나로 여겨왔다. 암은 통제 세포 성장과 증식 5 특징으로 질병입니다. 특히, neuroblastoma는 각각의 문장 6에서 교감 신경계의 신경 세포를 개발으로부터 나옵니다. 다 어린 시절 암 7 약 9%에 대한 회계, 어린 아이에서 발생하는 가장 일반적인 고체 종양이다. 많은 진전이 날짜로 만든되었지만,이 질병은 문제가 남아있다기초 과학자와 임상 모두에게. 한편, 유방암은 여성 8 속에서 가장 흔한 암입니다. Tamoxifen (TAM)은 주로 에스 트로겐 수용체 (ER) 길항제 9로 호르몬 반응 유방 암의 치료에 사용되고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 다른 리포트는 TAM에 의한 apoptosis 유도의 추가 독립적인 메커니즘에 대한 증거를 제공합니다. 특히, TAM은 플라빈의 mononucleotide (FMN) 사이트 10시 mitochondrial 호흡 사슬 (MRC)의 단지 내와 상호 작용합니다.
태평양 표준시은 Hymenocallis littoralis 공장으로부터 격리 천연 화합물이다. 현재 사용중인 많은 chemotherapeutics에서 대조, 그것은 mitochondrial가 11-15 타겟팅을 통해 다양한 암 세포 유형에 선택적으로, 비 genotoxic 방식으로, apoptosis을 유발을 보여줘왔다. 그러나, 잠복기 및 임상 작업은 그 가용성에 의해 방해되고, 그것은 자연의 소스와 여러 complic의 매우 낮은 금액에 존재ations는 부담은 화학 합성합니다. 우리는 합성 및 상영 7 deoxypancratistatin의 합성 analogues하고 C-1 아세 톡시 메틸 유도체 유사한 안티 암 활동, JC-TH - 아세테이트 - 4 (JCTH-4) 16을 관찰했습니다. 우리는 지금 손에 강력한 항정 암 활동과 합성 태평양 표준시의 아날로그 있습니다. 그 합성이 표준화되어 왔으며 잠복기 및 임상 업무에 대한 충분한 수량을 생산하도록 확장할 수 있습니다. 이후 자연 PST 및 TAM 모두 대상 mitochondria, 그것은 TAM와 함께 인간의 유방암과 neuroblastoma 세포에서 태평양 표준시의 합성 아날로그의 결합 효과를 조사 흥미로울 것입니다.
여기, 우리는 선택적 인간 neuroblastoma의 JCTH-4 세포 독성 (SH-SY5Y)와 유방 선암 (MCF7) 세포를보고합니다. JCTH-4는 mitochondrial 타겟팅을 사용하여 두 세포 라인에서 apoptosis를 유도 할 수있다; JCTH-4는 MMP의 소실과 반응성 산소 종의 증가 격리된 mitoch의 (ROS) 생산의 원인이러한 암 세포에서 ondria. 또한, autophagy는 MCF7 세포에 JCTH-4에 의해 유도되었다. 흥미롭게도 JCTH-4 모욕 TAM의 추가는 SH-SY5Y와 MCF7 세포의 JCTH-4의 상기 효과를 향상. JCTH-4 및 TAM 혼자와 함께 MCF7 세포에 의해 유도된 형태학의 변경은 위상 대조 또는 명시야 사진이 촬영된 현미경을 통해 감시했다. 정상적인 인간 태아 섬유아 세포 (NFF)는 둘 다 혼자와 TAM와 함께 JCTH-4에 감도에 표시된 감소 전시. 따라서 이러한 관찰은 유방암과 neuroblastoma에 대한 안전하고 효과적인 chemotherapeutic 요원, TAM과 JCTH-4, 혼자 관련 좋습니다.
재료 및 방법
1. 세포 배양
- 성장과 2 개의 MM과 보완 Dulbecco의 수정일 이글스 중 F-12 햄 (시그마 - 올드 리치, Mississauga, ON, 캐나다)와 문화는 SH-SY5Y 인간 neuroblastoma 세포 (ATCC, 고양이. 번호 CRL-2266, 매나 사스, VA, 미국) L-glutamin전자 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 10 밀리그램 / ML gentamicin (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, 캐나다). 37 ° C 5 % CO 2에서 세포를 유지합니다.
- 성장와 10 % FBS 표준 (써모과 보완 RPMI-1640 배지 (시그마 - 올드 리치 캐나다, Mississauga, ON, 캐나다)의 문화 MCF7 인간 유방 선암 세포 (ATCC, 고양이. 번호 HTB-22, 매나 사스, VA, 미국) 과학, Waltham, MA) 및 10 밀리그램 / ML gentamicin (캐나다, ON Gibco BRL, VWR, Mississauga). 37 ° C 5 % CO 2에서 세포를 유지합니다.
- Dulbecco의 수정일 이글의 중간, 높음 포도당 (써모 과학, Waltham, MA, 미국 분명히 정상적인 인간 태아의 fibroblast (NFF) 셀 라인 (의학 연구를위한 Coriell 연구소, 고양이. 번호 AG04431B, 캠든, 뉴저지, 미국)의 성장과 문화 ) 15% FBS 및 10 밀리그램 / ML gentamicin (캐나다, ON Gibco BRL, VWR, Mississauga,)로 보충. 37 ° C 5 % CO 2에서 세포를 유지합니다.
2. 약물 준비
- tamoxifen을 무게 (TAM) 구연산 염 (시그마 - 올드 리치, 고양이. 번호 T9262, Mississauga, 캐나다, ON)와 10 밀리미터 주식 솔루션을 준비하는 DMSO에 용해. 사용할 때까지 -20 ° C에서 매장 재고 솔루션입니다. 모든 차량 미만 0.5 %에서 DMSO를 포함한 본 연구에서 사용되는 컨트롤.
- 이전 16 설명된대로 bromobenzene에서 chemoenzymatic 합성 제작한 JC-TH - 아세테이트 - 4 (JCTH-4)의 DMSO에 녹아있는 1 ㎜ 주식 솔루션을 준비하고 2.1 단계를 반복합니다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 매장 재고 솔루션입니다. 모든 차량 미만 0.5 %에서 DMSO를 포함한 본 연구에서 사용되는 컨트롤.
3. 시간 경과 현미경
- 플레이트 약 2.0 X 클래스 II biosafety 캐비닛의 멸균 조건에서 35mm 유리 바닥 문화 요리 (MatTek 공사, 고양이. 번호 P35G-014-C, 애쉬 랜드, MA, 미국)의 10 5 MCF7 세포와 그들로 성장할 수 있도록 37 ° C 5 % CO 2.
- 세포이 60에서 70 %의 합류점에 도달하면, 1 ㎜를 사용하여 1 μm의 JCTH-4와 함께 그들을 치료DMSO와 혼자와 함께 클래스 II biosafety 캐비닛, DMSO에 녹아있는 10 밀리미터 주식 솔루션을 사용하여 10 μm의 탐 '에 녹아있는 주식 솔루션입니다.
- 48시간, 37시 온수 챔버에서 적절한 세포 ° C Leica DMI6000 형광 현미경의 무대 (Leica 이크로, Wetzlar, 독일)에 5 % CO 2.를위한 세포 치료 후
- 마이크로 AF6000 소프트웨어를 사용하여 400x 배율에서 18 시간 동안 5 분마다 위상 대조 또는 명시야 micrographs을 위해 현미경을 설정합니다.
4. 핵 염색법
- 플레이트 약 2.0 각 클래스 II biosafety 캐비닛에 6 잘 맑은 아래 조직 배양 플레이트 잘들을 ° C 5 % CO 2 37 성장할 수 있도록 관련 X 10 5 MCF7 또는 SH-SY5Y 세포.
- 세포이 60에서 70 %의 합류점에 도달하면, DMSO에 녹아있는 10 밀리미터 주식 솔루션을 사용하여 1 ㎜의 DMSO에 녹아있는 주식 용액 및 10 μm의 탐 사용하여 1 μm의 JCTH-4, 모두 그들을 치료혼자와 클래스 II biosafety 캐비닛의 조합 인치
- 37시 상기 치료와 세포를 품어 ° C ~ 5 % 48시간 (SH-SY5Y 세포) 또는 72시간 (MCF7 세포)에 대한 CO 2.
- 마약 치료 및 세포 배양 후, 직접 핵 얼룩이 10 μm의의 최종 농도로 처리된 세포의 미디어에 Hoechst 33342 염색을 (분자 프로브, 유진, OR, 미국)에 추가합니다.
- 빛으로부터 보호 5-10분 위해 Hoechst 염색과 세포를 품어.
- Leica DM의 IRB 간접 형광 현미경 (Leica 이크로, Wetzlar, 독일)의 무대에서 접시를 놓습니다.
- 400x 배율의 형광 및 위상 micrographs를 가져가라.
5. Annexin V 바인딩 분석
- 플레이트 약 5.0 × 10 5 MCF7, SH-SY5Y, 또는 NFF 전지 클래스 II biosafety 캐비닛 10 ML 조직 배양 접시에서들을 ° C 5 % CO 2 37 성장할 수 있습니다.
- 승암탉 세포이 60에서 70 %의 합류점에 도달, DMSO 및 10 μm의 탐 '은 클래스 II biosafety에 DMSO에 녹아있는 10 밀리미터 주식 솔루션, 둘 다 혼자와 조합을 사용하여에 녹아있는 1 ㎜ 주식 솔루션을 사용하여 1 μm의 JCTH-4와 함께 그들을 치료 캐비닛.
- 37시 상기 치료와 세포를 품어 ° C ~ 5 % 48시간 (SH-SY5Y 세포) 또는 72시간 (MCF7 및 NFF 세포)에 대한 CO 2.
- 10 밀리미터 HEPES, 사용까지 10 밀리미터 NaOH, 140 MM NaCl, 4시 산도 7.6 및 매장에서 1 ㎜ CaCl 2 ° C로 ddH 2 O에서 Annexin V 구속력 버퍼를 준비합니다.
- 치료와 마약으로 세포의 부화 후 정지 세포를 포함하는 접시에서 미디어를 제거하고 적절한 치료와 라벨이 각기 다른 치료 그룹에 대해 별도의 15 ML 원뿔 튜브에 넣습니다.
- 트립신을 사용하는 접시에서 점착 성의 세포를 분리합니다.
- 트립신의 결과로 판에서 채취한 세포 후 15 ML 원뿔 곡선에 배치 미디어 기음알 단계 5.4의 튜브하고 트립신 정지 세포로 원래 접시에 다시 놓으십시오.
- 전자 피펫 필러 및 serological pipettes으로 트립신 전지 솔루션 미디어를 믹스 앤 해당하는 15 ML 원뿔 튜브에 다시이 혼합물을 추가하십시오.
- 4에서 5 분 600 XG에서 세포를 원심 ° C, 각 튜브의 표면에 뜨는을 제거하고 PBS에서 resuspend 세포.
- 15 분 600 XG에 세포를 원심 분리기, 각 튜브의 표면에 뜨는을 제거하고, Annexin V 바인딩 버퍼의 70-50에 대한 μL으로 표시 microfuge 튜브에 resuspend 세포.
- 10 μm의의 최종 농도로 Annexin V AlexaFluor-488 (1시 50분) (시그마 - 올드 리치, Mississauga, ON, 캐나다)와 Hoechst 염색을 추가하고 빛으로부터 보호 15 분 동안 품어.
- 아래 인큐베이션, microfuge 튜브의 소용돌이 하나가, 현미경 슬라이드에 세포 혼합물 중 7-10 μL를 추가 microscop에서 세포 혼합물의 coverslip에 ...의 위에 높이 솟다 배치형광 현미경을 거꾸로 Leica DM의 IRB에서 400x 배율 (Leica 이크로, Wetzlar, 독일)에서 각보기에 대한 전자 슬라이드와 형광 micrographs 가지고, Annexin V 및 Hoechst 모두 이미지. 나머지 microfuge 튜브의 각 각 실험 시료에 대해 반복합니다.
6. 세포 생존에 대한 수용성 Tetrazolium 소금 (서부 표준시-1) 분석
- 합류 T75 플라스크 또는 클래스 II biosafety 캐비닛 10 MCF7의 cm 조직 문화 요리, SH-SY5Y, 또는 NFF 세포를 Trypsinize.
- 세포이 해제되고 나면, 트립신에 미디어의 5-10 ML을 추가하고 15 ML 원뿔 튜브 미디어 세포 현탁액을 배치.
- 15 분 600 XG에 세포를 원심 분리기, biosafety 캐비닛에 다시 튜브를 삽입, 각 튜브의 표면에 뜨는을 제거하고 세포 펠렛의 크기에 따라 미디어의 3-1에 대한 ML에서 셀을 resuspend.
- microfuge 튜브에 세포 현탁액의 장소 10 μL은 Trypan 청색 염료 (S 10 μL를 추가할) 캐나다, ON igma - 올드 리치, Mississauga, 그리고 micropipette 함께 섞는다.
- 혈구계 (Hausser 과학, 미국)에서 Trypan 블루 정지 세포의 10 μL를로드 세포를 세고, 그리고 원래 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액의 세포의 농도를 계산합니다.
- MCF7 및 SH-SY5Y 및 도금에 필요한 NFF 전지 5.0 × 10 4 1.5 × 10 5 세포 / ML의 농도로 희석 세포 현탁액을 만드는 데 필요한 원래의 세포 현탁액의 볼륨을 확인하려면이 집중력을 사용합니다.
- 판 15 희석 세포 현탁액을 사용하여 X 10 3 MCF7 또는 SH-SY5Y 세포 /도 또는 5.0 X 10 3 NFF 전지 /도 96 잘 맑은 아래 조직 배양 플레이트의 각도에 희석 세포 현탁액의 μL 100을 추가하여.에게 37 ° C 5 % CO 2 하룻밤 사이에 세포를 품어.
- 72시간 대해 1 μm의 JCTH-4 및 10 μm의 탐 모두 혼자와 클래스 II biosafety 캐비닛에 조합과 세포를 치료MCF7 및 NFF 전지, 그리고 SH-SY5Y 세포에 대한 48 시간 동안의.
- 치료 및 약물 부화 후 10 μL를 추가 서부 표준시-1 각 잘으로 시약 (IN 로슈 응용 과학, 인디애나, 미국)와 37에 4 시간 동안 접시를 품어 ° C에서 5 % CO 2.
- Wallac 빅터 3 1420 Multilabel 카운터 (PerkinElmer, 우드 브리지, ON, 캐나다)에서 450 nm의 흡광도에서 판독을 가지고 용매 컨트롤 그룹의 비율로 표현.
7. Tetramethylrhodamine 메틸 에스테르 (TMRM) 염색법
- 6 잘 맑은 아래 조직 배양 플레이트와 클래스 II biosafety 캐비닛에 6 잘 조직 배양 플레이트의 각 음의 플레이트 MCF7 세포를 각각 잘으로 coverslip를 놓습니다. 그들이 37 ° C에서 5 % CO 2를 성장하도록 허용합니다.
- 세포이 60에서 70 %의 합류점에 도달하면, DMSO에 녹아있는 10 밀리미터 주식 솔루션을 사용하여 1 ㎜의 DMSO에 녹아있는 주식 용액 및 10 μm의 탐 사용하여 1 μm의 JCTH-4와 함께 그들을 치료,클래스 II biosafety 캐비닛에 혼자와 함께 모두.
- 37시 상기 치료와 세포를 품어 ° C와 72 시간 5% CO 2.
- 마약 치료 및 세포 배양 후, 직접 핵뿐만 아니라 tetramethylrhodamine 메틸 에스테르 (TMRM을 착색하는 데 10 μm의의 최종 농도로 처리된 세포의 미디어에 Hoechst 33342 염색을 (분자 프로브, 유진, OR, 미국) 추가 ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, 캐나다) 200 NM의 최종 농도에서.
- 빛으로부터 보호 45 분 동안 5% CO 2와 37 ° C에서 염료와 세포를 품어.
- 피펫 8 현미경 슬라이드를 향해 미디어 또는 PBS의 μL하고 6 잘 접시에서 coverslip을 가지고 핀셋으로 아래쪽으로 직면하고있는 세포와 현미경 슬라이드에 미디어 또는 PBS의 상단에 배치하십시오.
- (Leica DM의 IRB 거꾸로 형광 현미경과 형광 micrographs, Hoechst와 각보기에 대한 TMRM의 micrographs 모두를 타고Leica 이크로, 400x 배율의 Wetzlar, 독일).
8. Mitochondrial 절연
- 10 hypotonic 버퍼의 ML (1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5 MM 트리스-HCL, 210 MM mannitol, 70 밀리미터 자당, 10 μm의 레우 - 응원, 10 μm의 펩-, 100 μm의 PMSF)과 반응 버퍼에 대해 준비하고 두 솔루션을 유지 얼음에 다가요.
- SH-SY5Y 세포 10 ~ 약 8 합류 T75 조직 문화 flasks으로, 세포를 trypsinize 트립신을 무력화하기 위해 미디어를 추가, 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 수집 및 4에서 5 분 600 XG에 튜브를 원심 분리기 ° C.
- 차가운 PBS의 20-10에 대한 ML의 표면에 뜨는 및 resuspend 세포 알약을 제거, 4 ° C에서 5 분 600 XG에 튜브를 원심 분리기, 그리고 한번 세탁 과정을 반복합니다.
- 표면에 뜨는를 제거하고 차가운 hypotonic 버퍼에 세포를 resuspend. 유리 조직 분쇄기로 수동으로 세포를 Homogenize 4시 5 분 600 XG에 세포 lysate를 원심 분리기 ° C.
9. Amplex 레드 분석
- 세포의 mitochondria 분리 후 BioRad 단백질 분석 (바이오 방사선 연구소, 헤라클레스, CA 미국)와 1mg/mL BSA의 알려진 농도 (소 혈청 알부민)의 표준 곡선을 사용하여 격리된 mitochondria의 샘플의 단백질의 농도를 추정 .
- 고립된 mitochondria 솔루션의 단백질의 예상 농도를 사용하여, 단백질 20 μg를 제공하기 위해이 솔루션의 볼륨을 계산합니다. 단백질 /도 20 μg을 읽어 불투명 96 - 웰 플레이트의 각도에이 볼륨을 피펫.
- 반응 버퍼, 약물 치료 (1 μm의 JCTH-4 및 / 또는 10 μm의 탐, 또는 250 μm의 PQ (시그마 - 올드 리치, Mississauga, ON의 최종 농도 100 μL의 총 볼륨 판의 각 우물을 기입 , C6 U/200 μL의 비율에 긍정적인 제어로 사용 anada)), 50 μm의의 최종 농도에서 Amplex 레드 시약 및 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (HRP) (시그마 - 올드 리치, Mississauga, ON, 캐나다).
- 2 시간 배양 후, 전 (前)에 형광 판독 가져가라. 560 nm의와 엠마. 590 spectrofluorometer (SpectraMax 제미 나이 XPS, 분자 디바이스, 서니 베일, 캘리포니아, 미국)의 NM.
10. 셀룰러 Lysate 준비
- 10cm 조직 배양 접시에 60-70%의 합류로 MCF7 세포를 성장.
- 1 μm의 JCTH-4 및 10 μm의 탐 홀로 및 치료 그룹당 10 ~ 15 접시와 72 시간 조합으로 세포를 드셔보세요.
- 10 μm의 레우 - 응원, 10 μm의 펩-, 100 μm의 PMSF, (산도 7.2에서 10 밀리미터 트리스 HCL, 5 밀리미터 KCl, 1 밀리미터 MgCl 2, 1 ㎜ EGTA, 1 % 트리톤-X-100 세포 용해 완충액 준비 4 번)와 매장 ° 사용까지 C #.
- 기계 셀 스크레이퍼로 판 표면에서 세포를 이동시키다와 라벨 50 세포를 수집ML 원뿔 튜브.
- 4 ° C에서 5 분 600 XG에 튜브를 원심 분리기, 4 ° C에서 5 분 동안 차가운 PBS, 원심 분리기 600 XG에 튜브 20-10 약 ML에 뜨는 및 resuspend 세포 알약을 제거하고 세탁 과정을 반복 한.
- 표면에 뜨는를 제거하고 차가운 세포 용해 완충액으로 세포를 resuspend. 유리 조직 분쇄기로 수동으로 세포를 Homogenize 4시 5 분 600 XG에 세포 lysate를 원심 분리기 ° C.
- 알약을 무시하고 사용하기 전까지 -20 ° C에서 세포 lysates를 저장합니다.
11. 서양 얼룩 분석
- BioRad 단백질 분석을 (바이오 방사선 연구소, 헤라클레스, CA 미국)를 사용하여 세포 lysates의 단백질 농도를 확인합니다. nitrocellulose 막에 대한 SDS-PAGE 및 전송 단백질로 단백질 샘플을 따라 다릅니다.
- 후 전송, 5 % W / V 우유 TBST (십대 초반-20 식염수 트리스 버퍼) 1 시간 동안 솔루션 블록 점막.
- 개미와 프로브 점막토끼에서 제기된 I-LC3 항체 (1:500) (Novus 체액, 고양이. 번호 NB100-2220, Littleton, CO, 미국) 또는 방지 β-Actin 항체는 마우스 (1:1000) (산타 크루즈에서 제기된 생명 공학 주식, 고양이 4.에서 잠을 자면 번호 SC-81178, 파소 Robles, CA, 미국) ° C.
- 안티 마우스 (1:2000) 또는 안티 - 토끼 (1:2000) 양고추냉이 퍼옥시데이즈 - 복합 이차 항체 (Abcam, & 캣. 번호 ab6728과 하나가 십오분하고 TBST와 부화 두 오분 세차장에 따라 세포막 4에 1 시간 ab6802, 캠브리지, MA, 미국) ° C.
- 제목 세포막 TBST에 세 연속 5 분 세차장 및 향상된 chemiluminescence 시약 (시그마 - 올드 리치, CPS160, Mississauga, ON, 캐나다)와 단백질 밴드를 시각화.
- ImageJ 소프트웨어를 사용 densitometry 분석을 수행했습니다.
12. Monodansylcadaverine (MDC) 염색법
- 6 각 우물에 여섯 잘 맑은 아래 조직 배양 플레이트와 플레이트의 각 잘 MCF7 세포로 coverslip 놓으십시오클래스 II biosafety 캐비닛에 잘 맑은 아래 조직 배양 플레이트. 그들이 37 ° C에서 5 % CO 2를 성장하도록 허용합니다.
- 세포이 60에서 70 %의 합류점에 도달했을 때, 클래스 II biosafety에 DMSO에 녹아있는 10 밀리미터 주식 솔루션, 둘 다 혼자와 조합을 사용하여 1 ㎜의 DMSO에 녹아있는 주식 용액 및 10 μm의 탐 사용하여 1 μm의 JCTH-4와 함께 그들을 치료 캐비닛.
- 37시 상기 치료와 세포를 품어 ° C와 72 시간 5% CO 2.
- 마약 세포의 치료 및 부화 후 직접 15 분 각도에 0.1 mm의 최종 농도로 Monodansylcadaverine (MDC) (시그마 - 올드 리치, Mississauga, ON, 캐나다)을 추가합니다.
- 빛으로부터 보호 15 분 동안 5% CO 2와 37 ° C에서 염색과 세포를 품어.
- 피펫 30 현미경 슬라이드를 향해 미디어 또는 PBS의 μL하고 6 잘 접시에서 coverslip을 타고 세포 faci과 현미경 슬라이드에 미디어 또는 PBS의 상단에 배치족집게로 NG 아래쪽.
- Leica DM의 IRB는 400x 확대 (Leica 이크로, Wetzlar, 독일) 형광 현미경을 거꾸로으로 각보기에 대해 형광 MDC와 위상 micrographs를 가져가라.
13. 대표 결과
JCTH-4에 의한 인간 유방 선암과 Neuroblastoma 전지에서 Apoptosis의 선택적 유도 : TAM에 의한 활동 향상
apoptosis의 선택적 유도는 천연 태평양 표준시 (그림 1A) 11-13 의해 다양한 암세포에 표시되었다. 때문에 태평양 표준시의 낮은 가용성, 우리는 7 deoxypancratistatin (JCTH-4, 그림. 1B)의 analogues을 합성하고 인간 유방 선암 (MCF7)과 neuroblastoma 세포 (SH-SY5Y)에서 유사한 안티 - 암 활동을 검사. 실험의 첫 단계에서 우리는 MCF7 세포에 JCTH-4 및 TAM 혼자와 치료에 따라 시간이 지남에 따라 형태학의 변화를 모니터링하고 함께하고 싶었의. MCF7 세포는 48 시간 동안 용매 처리 (제어)와 같은 위상 콘트라스트 사진과 함께 촬영된 현미경 제작한 비디오 1 본, 18 시간 동안 감시했다, 이들 세포는 형태에는 큰 변화를 전시 없습니다. 대조적으로, 1 μm의 JCTH-4 치료 48 시간 후,이 세포는 같은 수축 등의 apoptosis와 관련된 형태학의 변화를 전시 비디오 2에서 본대로 blebbing, apoptotic 몸의 형성. 한편, 홀로 MCF7 세포의 TAM 치료는 autophagy (비디오 3)과 관련된 autophagosomes 나타내는 작은 반점이있는 흠도 포함하여 매우 독특한 형태를 만들었습니다. 아주 최소한의 apoptotic 형태가 준수하고 세포는 일반적으로 MCF7 세포를 치료 솔벤트 컨트롤과 비교 건전한 형태를 전시했다. illustrat 등 48 시간 후 MCF7 세포의 증가 apoptotic 형태로 표시대로 흥미롭게 TAM의 면전에서, JCTH-4에 의한 apoptotic 유도가 크게 향상되었다동영상 4 에드.
실험의 두 번째 단계에서는 apoptosis의 유도를 평가하기 위해 형광 염료를 이용. 72시간 각각 MCF7 및 SH-SY5Y 세포 1 μm의 JCTH-4 치료 48 시간 후, Hoechst 염색이 사용되었으며 핵 형태를 모니터링합니다. 결과 MCF7 및 apoptotic 유도 지표로 SH-SY5Y 세포, (그림 2A, B)에서 apoptotic 기관과 함께 농축, 밝게 스테인드 핵 지적했다. 혼자 TAM 치료는 MCF7 및 SH-SY5Y 세포에서 apoptotic 최소한의 핵 형태이 나왔고, 핵은 용매 제어 그룹 (그림 2A, B)에 비해 Hoechst와 함께, 대형 원형, 그리고 희미하게 물들어 있었다. 비디오 4, MCF7의 핵 및 SH-SY5Y 세포와 계약을 72 시간 후 조합 치료 (그림 2A, B)과 apoptotic 형태에 표시된 증가 표시됩니다.
apoptotic 유도를 확인하려면 전지는 P에 대한 평가되었다Annexin V 구속력을 분석을 통해 17 hosphatidylserine의 externalization, apoptosis를위한 마커. MCF7 및 SH-SY5Y 세포는 1 μm의 홀로 JCTH-4와 함께 조합에서 10 μm의 탐과 apoptosis의 유도를 (그림 3A, B 확인, 녹색 형광로 표시, Annexin V 구속력을 양성했다 각각 72 및 48 시간 동안 처리 ). phosphatidylserine의 어떠한 분명 externalization은 MCF7에서 관찰하지 않고 SH-SY5Y 세포 혼자 TAM로 치료뿐만 72시간 이후 상기 치료 그룹 (그림 3C)로 치료 NFF 세포에서와 같이되었다. 따라서, 혼자와 TAM와 함께 JCTH-4는 선택적으로 MCF7 및 SH-SY5Y 세포에서 apoptosis를 유도합니다.
혼자 JCTH-4의 효과를 계량하고 TAM와 함께,이 서부 표준시-1 세포 생존, 활성 세포 물질 대사의 지표를위한 기반 colorimetric 분석이 72시간 및 SH-SY5Y 세포에 대한 MCF7에서 수행하고 NFF 세포가 치료를 받았다고를 치료하려면 48 시간 동안.혼자 10 μm의 탐 '은 MCF7 및 SH-SY5Y 세포 (그림 4A, B) 양쪽에는 큰 차이를 전시하지 동안 용매 통제 집단에 비해, 1 μm의 JCTH-4는 50 % 이상에 의해 활성화된 세포 신진 대사를 감소. 흥미롭게도 MCF7 및 SH-SY5Y 세포에서 JCTH-4 모욕 TAM의 추가는 세포 대사의 시너지 감소 결과. NFF 전지는 TAM (그림 4c)와 JCTH-4 홀로 및 JCTH-4 모두에게 크게 덜 민감했다. 따라서 JCTH-4 MCF7 및 SH-SY5Y 세포에서 TAM과 선택적 시너지 활동을 보여줍니다.
Mitochondrial JCTH-4 타겟팅
JCTH-4는 절연 mitochondria에있는 전체 셀 및 ROS 생성에 apoptosis mitochondrial 막 잠재력을 유발하는 mitochondria를 목표로하고 있는지 확인하기 위해서는 감시되었다. MCF7 세포는 72 시간 동안 치료를 받고 TMRM 물들일되었다. 1 μm의 JCTH-4는 붉은 형광 (그림 5A)의 손실로 표시 MMP를 감소. 그러나, 함께 일혼자 10 μm의 탐 '은 MMP에는 분명 효과가 없었습니다 동안 10 μm의 탐의 전자 이외는 MMP의 큰 낭비가 관찰되었다.
증가할수록 ROS 생성이 mitochondrial 멤브레인 permeabilization 및 apoptosis 유도에 연결이되어있다면, ROS의 생산은 1 μm의 홀로 JCTH-4 및 10 μm의 탐, 대우 SH-SY5Y 세포에서 분리된 mitochondria의 Amplex 붉은 염료와 함께 조합 18에서 평가되었다 -20. 형광 판독은 상대 형광 단위 (RFU)으로 표현되었다. ROS 생성의 증가는 JCTH-4 및 혼자 TAM (그림의 5B)로 관찰되었다. 흥미롭게도, 조합 치료는 ROS 생산에 큰 증가를 굴복. mitochondria의 ROS 생산의 잘 알려진 유도, PQ는 긍정적인 제어로 활용되었다.
에 의한 Autophagy의 유도 JCTH-4 및 TAM
Autophagic 유도는 여러 가지 화합물에 의해 chemotherapeutic 모욕에 연결되었습니다
동안 autophagy 정상적으로 cytosol (LC3-I)에 위치 미세 소관 - 관련 단백질 1 라이트 체인 3 (LC3)는 phosphatidylethanolamine로 lipidated되고 autophagosomal 세포막 (LC3-II) 2 이후에 지역화된. autophagy의 유도를 확인하려면 LC3-II의 수준은 서양 얼룩 분석을 통해 72 시간 동안 치료를 MCF7 세포에서 평가되었다. 10 μm의 탐 '이 큰 autophagic 응답을 생산하면서 1 μm의 JCTH-4는 약간 (그림 LC3-II에 LC3-I의 전환 유도6B). 흥미롭게도, 조합 치료는 3보다 큰 LC3-I의 비율로 LC3-II를하였으며, autophagy의 가장 큰 유도 결과. 따라서 이러한 결과는 조합 치료로 세포의 가장 큰 응답으로 JCTH-4 및 TAM 혼자와 조합하여 MCF7 세포의 autophagic 유도를 보여줍니다.
보충 비디오 1. 용매 관리로 치료 MCF7 세포의 세포 형태. MCF7 세포은 48 분에서 66시간 위상 콘트라스트 사진으로 촬영된 현미경을 사용하여 포스트 솔벤트 제어 처리 (DMSO) 모니터링했다. 세포는 37에서 관리하고 있었다 ° C에서 5 % CO 2. 이미지 400x 배율에서 캡처했습니다. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .
보충 비디오 2. JCTH-4로 치료 MCF7 세포에서 apoptotic 세포 형태학의 유도. MCF7 세포은 48 66 시간 사후 처리 위트 사이 모니터링 있었다H 1 μm의 JCTH-4 위상 콘트라스트 사진으로 촬영된 현미경을 사용하여. 세포는 37에서 관리하고 있었다 ° C에서 5 % CO 2. 이미지 400x 배율에서 캡처했습니다. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .
보충 비디오 3. TAM 대우 MCF7 세포의 autophagic 세포 형태학의 유도. MCF7 세포는 48 위상 콘트라스트 사진으로 촬영된 현미경을 사용하여 10 μm의 탐과 66시간 포스트 트리 트먼트 사이 모니터링 있었다. 세포는 37에서 관리하고 있었다 ° C에서 5 % CO 2. 이미지 400x 배율에서 캡처했습니다. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .
보충 비디오 4. MCF7 세포의 TAM과 JCTH-4에 의해 향상된 apoptotic 형태. MCF7 세포은 48 분에서 66시간 모두 1 μm의 JCTH-4 및 위상 cont로 촬영된 현미경을 사용하여 10 μm의 탐과 사후 치료 모니터링되었습니다라스트 사진. 세포는 37에서 관리하고 있었다 ° C에서 5 % CO 2. 이미지 400x 배율에서 캡처했습니다. 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 1. 합성 7-데옥시 아날로그로 태평양 표준시의 구조 비교. pancratistatin의 () 화학 구조 (PST). JC-TH - 아세테이트 - 4 (JCTH-4)의 (B) 화학 구조.
그림 2. JCTH-4 TAM과 강화된 활동과 핵 apoptotic 형태를 유도합니다. 의 핵 형태 () Hoechst 염색과 지시 TAM의 농도와 JCTH-4 스테인드으로 각각 72 및 48 시간 동안 치료를 MCF7 및 (b) SH-SY5Y 세포. 컨트롤 그룹은 용제 (D로 치료했다MSO). 이미지는 형광 현미경에서 400x 배율에서 찍은되었다. 스케일 막대 = 15 μm의.
그림 3. JCTH-4 원인 externalization phosphatidylserine 혼자와 함께 암세포에 선택적으로 TAM과. externalized phosphatidylserine에 바인딩 Annexin V는 () MCF7 (72 시간), (B) SH-SY5Y (48 시간), 그리고 (c) NFF (72 시간) 세포가 JCTH-4로 치료에 apoptosis 유도의 유도를 확인하기 위해 평가되었다 지정된 농도에서와 TAM. 컨트롤 그룹은 용매 (DMSO)로 치료되었다. 이미지는 형광 현미경에서 400x 배율에서 찍은되었다. 스케일 막대 = 15 μm의.
그림 4. 탐 JCTH-4 선택적으로 암 세포에 의해 생존 감소를 향상시킵니다. 96 - 웰 플레이트는 씨앗을 품고 있었다 WI일 () MCF7, (B) SH-SY5Y, 그리고 (c) NFF 세포와 JCTH-4 및 지정된 농도에서 TAM로 치료. MCF7 및 NFF 세포는 72 시간 동안 치료를했는데, SH-SY5Y는 48 시간 동안 치료를했다. 약물 치료 및 인큐베이션을 게시, 서부 표준시-1 시약은 각도 추가되었고, 흡광도 수치가 450 NM에서 찍은 것들과 컨트롤의 비율 (DMSO)으로 표현. 통계는 GraphPad 프리즘 버전 5.0을 사용하여 수행되었다. 값은 의미 ± SD가 셋 독립적인 실험 quadruplicates에서로 표현됩니다. MCF7 : * P <0.001, ** P <0.0001 제어 대, # P <0.05 대 1 μm의 JCTH-4, † P <0.0001 대 10 μm의 탐. SH-SY5Y : * P <0.0005 제어 대, # P <0.005 대 1 μm의 JCTH-4, † P는 <0.005 대 10 μm의 탐. NFF : * P <0.005 대 10 μm의 탐 + MCF7 세포 1 μm의 JCTH-4, # P <0.01 대 10 μm의 탐 + 1 μm의 JCTH-SH-SY5Y 세포에서 4.
그림 5. JCTH-4 및 mitochondria에 TAM 행동. () MCF7 세포 coverslips에서 성장하고 약물의 지정된 농도로 치료 72 시간 및 MMP을 평가 TMRM 물들일되었다. 컨트롤 그룹의 세포 용매 (DMSO)로 치료되었다. 이미지는 형광 현미경에서 400x 배율로 촬영된되었다. 스케일 바는 = 15 μm의. (b)는 SH-SY5Y 세포의 mitochondria 절연이 지정된 농도에 JCTH-4 및 TAM로 치료되었으며 ROS 생산은 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (HRP)의 존재에 Amplex 붉은 기판으로 평가되었다. 제어 그룹 세포 용매 (DMSO)로 치료되었다. Paraquat는 (PQ) 긍정적인 제어로 250 μm의의 농도로 사용되었다. 형광 수치는 전 치료 2 시간 후 취득했다. 560 nm의와 엠마. 590 nm의 및 상대 fluorescenc으로 표현전자 단위 (RFU). 통계는 GraphPad 프리즘 버전 5.0을 사용하여 획득했다. 데이터와 유사한 트렌드 3 개의 독립적인 실험의 대표이다. 가치는 1 독립적인 실험 quadruplicates의 ± 평균 SD로 표현됩니다. * P <0.05, ** P <0.005, *** P <0.001 제어 대, # P <0.05 대 1 μm의 JCTH-4, † P <0.05 대 10 μm의 탐; @ P <0.05 대 250 μm의 PQ.
그림 6. 탐 JCTH-4 autophagic 유도을 향상시킵니다. () MCF7 세포 coverslips에서 성장, 72 시간 동안 지정된 농도에서 JCTH-4 및 TAM 모욕을 받게되었다. 제어 그룹 세포 용매 (DMSO)로 치료되었다. 치료를 게시, MCF7 세포 autophagic vacuoles을 감지하기 위해 MDC 물들일되었다. 이미지는 형광 현미경에서 400x 배율로 촬영된되었다. 스케일 막대 = 15 μm의. (B) 서양 얼룩 분석은 72 시간 동안 약물의 지정된 농도로 치료 MCF7 세포의 세포 lysates에 LC3 및 β-Actin 위해 수행되었다. Densitometric 분석은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 통계는 GraphPad 프리즘 버전 5.0을 사용하여 수행되었다. 값은 의미 ± SD가로 표현됩니다. * P <0.05, ** P <0.005, *** P <0.0005 대 통제, # P <0.001 대 1 μm의 JCTH-4, † P <0.001 대 10 μm의 탐.
약어 목록.
| 응급실 | 에스 트로겐 수용체 |
| FMN | 플라 빈의 mononucleotide |
| JCTH-4 | JC-TH-아세테이트-4 |
| LC3 | 미세 소관 - 관련 단백질 1 라이트 체인 3 |
| MDC | monodansylcadaverine |
| MMP | mitochondrial 막 잠재력 |
| MRC | mitochondrial 호흡 사슬 |
| NFF | 정상적인 인간 태아의 fibroblast |
| PQ | paraquat |
| 태평양 표준시 | pancratistatin |
| RFU | 상대 형광 단위 |
| ROS | 반응성 산소 종 |
| TAM | tamoxifen |
| TMRM | tetramethylrhodamine 메틸 에스테르 |
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Discussion
PST 및 유사 화합물은 안티 - 암 속성에게 11-15,21을 가지고 보여왔다. 우리는 이전에이를 apoptogenic 요인 12,14의 릴리스에 의한 apoptosis를 유도 암세포에 선택적으로 mitochondria를 불안정하게하는 자연 PST를보고했습니다. 그것은 가능성이 높습니다 그 같은 메커니즘을 통해 JCTH-4 막으로, JCTH-4 (TMRM 염색법 (그림 5A)와 볼, 그리고 SH-SY5Y 세포 격리 mitochondria의 ROS의 생성을 증가로 MCF7 세포에서 MMP 붕괴의 원인 그림 5B), mitochondrial 부전을 나타내는. 따라서 JCTH-4에 의한 apoptosis의 유도가 암 세포의 mitochondrial 타겟팅을 통해 대부분의 경우입니다.
많은 차이가 JCTH-4에 의해 암 선택성의 기반으로 사용할 수 noncancerous 및 암 세포 사이에 존재합니다. 암 세포는 고도의 작용에 의존하고 에너지 생산을위한 mitochondria에 적고,이 현상이라고합니다의 Warburg 효과 22. 암 세포에 이와 같은 신진 대사 활동은 cytosol에서 높은 산도로 안내합니다. 따라서 산성 cytosolic 환경 23 apoptosis 공격해서 회피하는 향상된 능력에 연결된되어 암 세포 mitochondria hyperpolarization에 기여하고 있습니다. mitochondria 암 세포의 Hyperpolariztion 그러나, JCTH-4에 취약 암세포를 렌더링할 수 있으며, 한 셀에 촬영 JCTH-4는 효소 처리를 통해 긍정적인 요금을 취득할 수 있으며, 선택적으로 자신의 hyperpolarized 자연에 의한 mitochondria 암 세포로 데려가 수 있습니다. 또한, mitochondria 관련 antiapoptotic 단백질의 배열은 매우 mitochondrial 멤브레인 permeabilization 등 24-26 단백질 BCL-2 가족의 antiapoptotic 단백질 등 apoptosis의 후속 실행을 금지 암세포로 표현되는 표시되었습니다.
세포 스트레스 다양한 형태의 존재에서 autophagy과 같이 실행됩니다세포가 바람직하지 못한 조건 하에서 2 살아남을 수 있도록 프로 생존 반응. 이 통로의 자극에 걸쳐 단, autophagic 세포 사망 3 상승을주는 중요한 세포 내 구성 요소의 광범위한 붕괴로 이어질 수 있습니다. 프로 생존과 프로 사망 모두 autophagic 응답 chemotherapeutic 모욕 3으로 연결되었습니다. 산화 스트레스로 이어지는 JCTH-4에 의해 Mitochondrial 장애는 자동으로 기본 autophagic 응답을 실행할 수 있습니다. 실제로 우리는 JCTH-4 치료 (그림 2A, B 3A, B 6A, B)와 apoptosis와 함께 일부 autophagic 유도를 관찰 했어요. TAM 잘 ER 양성 유방암 세포에서 ER 길항제으로 자리매김하고 있지만 최근에는 단지 내 10 FMN 사이트에 mitochondria, 바인딩과 상호 작용을 보여줘왔다. 또한 TAM은 많은 암 세포 유형 3에 걸쳐 autophagy의 잘 알려진 유도 인자이다. 사실, TAM은 절연 mitoch에서 ROS 생성의 증가를 일으킬 한ondria (그림의 5B). 그러나 이러한 상호 작용은 MMP 붕괴 (그림 5A)하지만, 전형적인 프로 생존 autophagic 반응을 유발하기에 충분들을 자극하고 불충 분한 것으로 판명. JCTH-4 및 TAM은 프로 사망 autophagic 응답의 암시 향상된 세포 독성 반응 (그림 4A, B), 동반되었고, (그림 6A, B) 함께 사용했을 때 광범위한 autophagic 유도가 관찰되었다, 그럼에도 불구하고, mitochondrial permeabilization 및 apoptogenic 요소 릴리스의 결과로 암 세포는 결국 apoptosis으로 사망. JCTH-4 모욕하는 TAM하여 이러한 sensitization이 TAM에 의한 ROS 생성의 증가로 표시될 수 있습니다. TAM과 JCTH-4는 모두 산화 스트레스를 생성할 수 있기 때문에, 두 화합물과 같은 스트레스의 조합 생산 해로운 autophagic 응답 및 / 또는 다양한 mitochondrial permeabilization 이후 apoptosis에 상승을주는 광범위한 autophagic 유도 발생할 수 있습니다. 일결합 치료 noncancerous 섬유아 세포 (그림 4c)의 생존에 영향을주지 않습니다. 이러한 결과는 혼자와 TAM와 함께 JCTH-4 noncancerous 세포에 악영향을 초래하지 않고 유방암과 neuroblastoma 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타냅니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 콜럼버스 장 9671 (윈저, 온타리오), 그리고 CIHR 프레더릭 들소와 데니스 엄마에게 수여 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금의 기사에 의해 지원되었습니다. 촬영된 현미경으로 그들의 도움 로버트 호지와 엘리자베스 Fidalgo 다 실바에게 감사합니다. 촬영된 현미경 비디오를 편집 케이티 Facecchia에 감사합니다. 우리는 또한이 원고의 비판적 검토를 위해 Sudipa 6월 Chatterjee와 필립 Tremblay 감사드립니다. 이 작품은 2010 년 암 상대로 자신의 연이은 승전 케빈 Couvillon의 메모리에 전념하고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 | |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30022.01 | |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 | |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corp. | P35G-014-C | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| H–chst 33342 dye | Molecular Probes, Life Technologies | H3570 | |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| WST-1 reagent | Roche Group | 11644807001 | |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer, Inc. | 1420-011 | |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | GIBCO, by Life Technologies | T-668 | |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 | |
| BioRad protein assay | Bio-Rad | 500-0001Bottom of Form | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 | |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 | |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 | |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 | |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
References
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