Summary
Мы синтезировали новый аналог pancratistatin с сопоставимыми противораковой активностью, как родной pancratistatin, интересно, комбинаторного лечения тамоксифеном дало резкое повышение в апоптозе и autophagic индукции митохондриальной ориентации с минимальным влиянием на доброкачественные фибробластов. Таким образом, JCTH-4 в сочетании с тамоксифена может обеспечить безопасное противораковой терапии.
Abstract
Рак молочной железы является одной из самых распространенных видов рака среди женщин в Северной Америке. Многие современные анти-лечения рака, в том числе ионизирующих излучений, индуцируют апоптоз через повреждения ДНК. К сожалению, такое лечение неселективными для раковых клеток и производят аналогичные токсичность в нормальных клетках. Мы сообщили селективной индукции апоптоза в раковых клетках естественным pancratistatin соединения (PST). В последнее время новые PST аналог, C-1 ацетоксиметил производных 7-deoxypancratistatin (JCTH-4), был произведен синтез заново, и это показывает сопоставимые избирательную активность вызывающих апоптоз в нескольких линиях раковых клеток. В последнее время аутофагии был вовлечен в злокачественные опухоли и как про-выживания и про-смерть механизмов в ответ на химиотерапию. Тамоксифен (TAM) неизменно продемонстрировала индукции про выживания аутофагии в многочисленных раковых заболеваний. В данном исследовании эффективность JCTH-4 отдельно и в сочетании с ТАМ, чтобы вызвать гибель клеток в человеческом cance грудиг (MCF7) и нейробластомы (SH-SY5Y) клеток оценивали. ТАМ только индуцированные аутофагии, но незначительная гибель клеток, тогда как JCTH-4 только нанесен значительный индукции апоптоза с некоторыми индукции аутофагии. Интересно, что комбинаторная лечение дало резкое увеличение апоптоза и autophagic индукции. Мы следили зависящих от времени морфологические изменения в клетках, подвергающихся MCF7 ТАМ-индуцированной аутофагии, JCTH-4-индуцированного апоптоза и аутофагии и ускоренной гибели клеток с комбинаторной лечения с использованием замедленной микроскопии. Мы показали этих соединений индуцировать апоптоз / аутофагии по митохондриальной таргетинга в этих раковых клеток. Важно отметить, что эти процедуры не влияют на выживание доброкачественные человеческие фибробласты. Таким образом, эти результаты показывают, что JCTH-4 в сочетании с ТАМ может быть использован в качестве безопасной и очень мощным анти-раковой терапии против рака молочной железы и клетки нейробластомы.
Protocol
Введение
Апоптоз, или введите я запрограммированная смерть клетки, представляет собой физиологический процесс, который может работать внешне, через связывание лигандов смерти к смерти рецептором, или внутренне. Внутренние пути апоптоза инициируется внутриклеточных стресса, таких как повреждение ДНК и митохондриальная дисфункция, это в конечном итоге приводит к пермеабилизации митохондрий, диссипации митохондриального мембранного потенциала (ММП), выпуск апоптогенное факторов с митохондриальной пространство межмембранного и последующего выполнения апоптоза 1.
Аутофагия это процесс, в котором клетки-брейки, деградирует, и перерабатывает свои внутриклеточных компонентов, сохраняя при этом целостность плазматической мембраны, она вызвана различными типами клеточных стрессов, включая окислительный стресс, гипоксия, белковых агрегатов, питательные лишения, лишение фактор роста, и поврежденных органелл 2. На начальных этапахэтого процесса, цитозольной материал охвачен autophagosomes дважды membraned пузырьки, которые сливаются в лизосомы сформировать autolysosomes. Сообщение лизосомальных синтеза, цитозольной материалы, ранее рассмотрен autophagosomes разлагаются под действием лизосомальных ферментов 2. Обширные активации этого пути дает обширный деградацию внутриклеточных компонентов, которые могут привести к гибели клеток autophagic или типа II запрограммированной клеточной смерти 3.
Уклонение от гибели клеток считается одним из признаков рака 4. Рак это болезнь, характеризуется неконтролируемым ростом клеток и распространение 5. В частности, нейробластома возникает из развивающихся нервных клеток симпатической нервной системы, из нервного гребня 6. Это наиболее распространенный солидных опухолей, происходящих у детей раннего возраста, что составляет около 9% всех раковых заболеваний у детей 7. Хотя значительный прогресс был достигнут на сегодняшний день, это заболевание остается проблематичнымкак основной ученых и клиницистов. С другой стороны, рак молочной железы является наиболее распространенным видом рака среди женщин 8. Тамоксифен (TAM) неоднократно использовались для терапии гормон аспекты рака молочной железы в качестве рецептора эстрогена (ER) антагонист 9. Тем не менее, другие отчеты свидетельствуют о дополнительных независимых механизмов индукции апоптоза TAM. В частности, ТАМ взаимодействует со сложной Я в дыхательной цепи митохондрий (MRC) на своем флавинмононуклеотида (ФМН) место 10.
PST это природное соединение, выделенный из растения Hymenocallis littoralis. Контрастные от многих химиотерапии используется в настоящее время, было показано, вызывают апоптоз, не в генотоксического образом, избирательно в различных типах клеток рака через митохондриальную ориентации 11-15. Тем не менее, доклинических и клинических работ препятствуют ее доступности, он присутствует в очень малых количествах в естественных источников и многие complicфлуктуации бремя его химического синтеза. Мы синтезировали и скрининг синтетических аналогов 7-deoxypancratistatin и наблюдал подобные противораковой активностью в С-1 ацетоксиметил производной, JC-TH-ацетат-4 (JCTH-4) 16. Теперь у нас в руках синтетический аналог PST с мощной противораковой активностью. Его синтез был стандартизирован и может быть расширена, чтобы произвести достаточное количество для проведения доклинических и клинических работ. Поскольку природные PST и ТАМ как цель митохондриях, было бы интересно изучить совместное действие синтетического аналога PST на человеческий рак молочной железы и клетки нейробластомы в сочетании с TAM.
Здесь мы сообщаем селективной цитотоксичности JCTH-4 в человеческой нейробластомы (SH-SY5Y) и аденокарциномы молочной железы (MCF7) клеток. JCTH-4 был способен индуцировать апоптоз в обеих клеточных линий митохондриальной таргетинг; JCTH-4 вызваны диссипацией ПММ и увеличение активных форм кислорода (АФК) производства в отдельных mitochondria из этих раковых клеток. Кроме того, аутофагии было вызвано JCTH-4 в MCF7 клеток. Интересно, что добавление к JCTH ТАМ-4 оскорбление усиливается вышеупомянутыми последствиями JCTH-4 SH-SY5Y и MCF7 клеток. Морфологические изменения, вызванные JCTH-4 и ТАМ самостоятельно и в комбинации MCF7 клетки контролируется с помощью покадровой микроскопии фазового контраста или яркие картины поля. Нормальные человеческие фибробласты плода (NFF) показали заметное снижение чувствительности к JCTH-4 как в одиночку, а в сочетании с TAM. Таким образом, эти наблюдения позволяют предположить, JCTH-4, в одиночку и с ТАМ, быть безопасным и эффективным химиотерапевтическое средство против рака молочной железы и нейробластомы.
Материалы и методы
1. Культуре клеток
- Расти и культуры SH-SY5Y человеческих клеток нейробластомы (АТСС, Кат. CRL-2266, Манассас, Вирджиния, США) с изменения Дульбеко орлы среднего F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Канада) с добавлением 2 мМ L-глутамине, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 10 мг / мл гентамицина (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Канада). Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% CO 2.
- Расти и культуры MCF7 человека аденокарциномы молочной железы клетки (АТСС, Кат. HTB-22, Манассас, Вирджиния, США) в RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Канада, Mississauga, ON, Канада) с добавлением 10% FBS стандарт (Thermo Научные, Waltham, MA) и 10 мг / мл гентамицина (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Канада). Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% CO 2.
- Расти и культуры, казалось бы, нормальных человеческих эмбриональных фибробластов (NFF) клеточной линии (Coriell института медицинских исследований, Кат. AG04431B, Камден, штат Нью-Джерси, США) в средней Дульбеко изменения Орла, высокий уровень глюкозы (Thermo Scientific, Waltham, Массачусетс, США ) с добавлением 15% FBS и 10 мг / мл гентамицина (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Канада). Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% CO 2.
2. Подготовка наркотиков
- Взвесить тамоксифен (TAM) цитрат соль (Sigma-Aldrich, Кат. T9262, Mississauga, ON, Канада) и растворить его в ДМСО подготовить 10 мМ маточного раствора. Магазин маточного раствора при температуре -20 ° C до использования. Все элементы управления транспортным средством, используемые в этом исследовании, содержащиеся ДМСО при менее 0,5%.
- Повторите шаг 2.1 подготовить 1 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО из JC-TH-ацетат-4 (JCTH-4), производства chemoenzymatic синтеза из бромбензол, как описано выше 16. Магазин маточного раствора при температуре -20 ° C до использования. Все элементы управления транспортным средством, используемые в этом исследовании, содержащиеся ДМСО при менее 0,5%.
3. Time-Lapse микроскопии
- Плиты приблизительно 2,0 х 10 5 MCF7 клеток в 35 мм со стеклянным дном культуры блюд (Маттек Corporation, Кат. P35G-014-C, Ashland, штат Массачусетс, США) в стерильных условиях кабинета класса II биобезопасности и позволить им расти 37 ° С и 5% CO 2.
- Когда клетки достигают от 60 до 70% слияния, относиться к ним с 1 мкМ JCTH-4 с помощью 1 мМматочного раствора растворяют в ДМСО и 10 мкМ ТАМ помощью 10 мМ маточного раствора, растворенного в ДМСО, самостоятельно и в комбинации в классе II биобезопасности кабинета.
- После обработки клеток в течение 48 часов, место клеток в камере с подогревом при температуре 37 ° C с 5% CO 2 на стадии Leica DMI6000 флуоресцентного микроскопа (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия).
- Использование ЛАГ AF6000 программное обеспечение, установить микроскоп принять фазового контраста или яркие снимки поле 400x увеличением каждые 5 минут в течение 18 часов.
4. Ядерная Окрашивание
- Плиты приблизительно 2,0 х 10 5 MCF7 или SH-SY5Y клеток в каждой лунке 6 подальше нижней культуре ткани пластины в классе II биобезопасности кабинета и дать им возможность расти при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Когда клетки достигают от 60 до 70% слияния, относиться к ним с 1 мкМ JCTH-4 с помощью 1 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО и 10 мкМ ТАМ помощью 10 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО, каксамостоятельно и в комбинации в классе II биобезопасности кабинета.
- Инкубируйте клетки с вышеупомянутой процедуры при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 48 часов (SH-SY5Y клеток) или 72 часов (MCF7 клеток).
- После обработки и инкубации клеток с препаратами, непосредственно добавить краситель Hoechst 33342 (Molecular Probes, Юджин, Орегон, США) в средствах массовой информации обработанные клетки до конечной концентрации 10 мкМ для окрашивания ядер.
- Инкубируйте клетки с Hoechst красителя от 5 до 10 минут, защищенном от света месте.
- Поместите пластину на этапе IRB Leica DM перевернутой флуоресцентного микроскопа (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия).
- Возьмите люминесцентные и фазы микрофотографии на 400x увеличением.
5. Аннексин V связывания
- Плиты около 5,0 х 10 5 MCF7, SH-SY5Y или NFF клеток в 10 мл культуры тканей пластин в классе II биобезопасности кабинета и дать им возможность расти при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Wкурица клетки достигают от 60 до 70% слияния, относиться к ним с 1 мкМ JCTH-4 с помощью 1 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО и 10 мкМ ТАМ помощью 10 мМ маточного раствора, растворенного в ДМСО, как самостоятельно, так и в комбинации в классе II биобезопасности шкафу.
- Инкубируйте клетки с вышеупомянутой процедуры при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 48 часов (SH-SY5Y клеток) или 72 часов (MCF7 и NFF клеток).
- Подготовить Аннексин V буфера для связывания в DDH 2 O 10 мМ HEPES, 10 мМ NaOH, 140 мм NaCl и 1 мМ CaCl 2 при рН 7,6 и хранить при 4 ° C до использования.
- После обработки и инкубации клеток с препаратами, удаление информации из пластин, содержащих взвешенные клетки и поместить его в отдельную 15 мл коническую трубку для каждой отдельной группе лечения помечены надлежащего лечения.
- Снимите прилипшие клетки из пластины с использованием трипсина.
- После того как клетки сняты с пластинки в результате трипсина, аспирации средствах массовой информации размещены в 15 мл коническуюАль трубку в пункте 5.4 и поместить его обратно в оригинальной пластины с трипсином приостановлено клеток.
- С электронным наполнитель пипетки и серологические пипетки, перемешать средствах массовой информации с решением клетки трипсином и поместить эту смесь обратно в соответствующие 15 мл конические пробирки.
- Центрифуга клеток при 600 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° С, удалить супернатант из каждой пробирки и ресуспендирования клеток в PBS.
- Центрифуга клеток при 600 мкг в течение 5 минут, удалить супернатант из каждой пробирки, и ресуспендируют меченых клеток в трубах микроцентрифужную с 50 до 70 мкл Аннексин V связывающим буфером.
- Добавить Аннексин V AlexaFluor-488 (1:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Канада) и красителя Hoechst конечной концентрации 10 мкМ и инкубировать в течение 15 минут защищенном от света месте.
- После инкубации вихрь одну из микроцентрифужную трубы, добавить от 7 до 10 мкл клетки смеси предметное стекло микроскопа, поместите возвышаться покровное клетки смесь на микротрещинслайд электронной и флуоресцентной микроскопии принимать, как Аннексин V и Hoechst изображений для каждого вида, в 400x увеличение на IRB Leica DM перевернутой флуоресцентного микроскопа (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия). Повторите эти действия для каждого экспериментального образца в каждой из оставшихся труб отцентрифугировать.
6. Водорастворимые соли тетразолия (WST-1) Анализ на жизнеспособность клеток
- Trypsinize сливной T75 колбу или 10 см культуре ткани блюдо MCF7, SH-SY5Y или NFF клеток в классе II биобезопасности кабинета.
- После того, как клетки были сняты, добавить от 5 до 10 мл СМИ трипсина и поместить подвески СМИ ячейки в 15 мл коническую трубку.
- Центрифуга клеток при 600 мкг в течение 5 минут, положите трубку обратно в шкаф биобезопасности, удалить супернатант из каждой пробирки и ресуспендирования клеток от 1 до 3 мл средства массовой информации в зависимости от размера ячейки гранул.
- Место 10 мкл суспензии клеток в микроцентрифуге трубки, добавляют 10 мкл Трипановый синий краситель (SIGMA-Aldrich, Mississauga, ON, Канада) и смешайте его с пипетки.
- Загрузить 10 мкл Трипановый Синий приостановлено клеток на гемоцитометра (Хауссер Scientific, США), подсчитать клетки, и рассчитать концентрацию клеток в суспензии клеток оригинальные 15 мл коническую трубку.
- Использование этой концентрации для определения объема оригинального суспензии клеток, необходимых для создания разбавленных суспензий с концентрацией 1,5 · 10 5 клеток / мл для MCF7 и SH-SY5Y и 5.0 × 10 4 клеток NFF необходимых для покрытия.
- Использование разбавленных суспензий для пластины 15 х 10 3 MCF7 или SH-SY5Y клеток / лунку или 5,0 х 10 3 клеток NFF / а путем добавления 100 мкл разбавленных суспензий в каждую лунку 96-луночного ясно пластины культуры тканей дна. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO 2 в одночасье.
- Относитесь к клеткам с 1 мкМ JCTH-4 и 10 мкМ ТАМ как самостоятельно, так и в комбинации в классе II биобезопасности шкафу в течение 72 часовс для MCF7 и NFF клеток, и в течение 48 часов для SH-SY5Y клеток.
- После обработки и инкубации препаратов, добавляют 10 мкл WST-1 реагент (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана, США) в каждую лунку и инкубировать пластину в течение 4 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Возьмите оптической плотности при 450 нм на Wallac Victor 3 1420 Multilabel Счетчик (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Канада) и выразить их в процентах от растворителя контрольных групп.
7. Tetramethylrhodamine метиловый эфир (TMRM) Окрашивание
- Поместите покровное в каждую лунку 6 подальше нижней плиты культуре ткани и пластину MCF7 клеток в каждую лунку с 6 лунками культуры ткани в классе корпус II биобезопасности. Позвольте им расти при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Когда клетки достигают от 60 до 70% слияния, относиться к ним с 1 мкМ JCTH-4 с помощью 1 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО и 10 мкМ ТАМ помощью 10 мМ маточного раствора, растворенного в ДМСО,как самостоятельно, так и в комбинации в классе II биобезопасности кабинета.
- Инкубируйте клетки с вышеупомянутой процедуры при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 72 часов.
- После обработки и инкубации клеток с препаратами, непосредственно добавить краситель Hoechst 33342 (Molecular Probes, Юджин, Орегон, США) в средствах массовой информации обработанные клетки до конечной концентрации 10 мкМ для окрашивания ядер, а также tetramethylrhodamine метиловый эфир (TMRM ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Канада) в конечной концентрации 200 нМ.
- Инкубируйте клетки с красителями на 5% CO 2 и 37 ° C в течение 45 минут защищенном от света месте.
- Внесите 8 мкл PBS СМИ или на предметном стекле микроскопа и принять покровное с 6 лунками и поместите его на верхнюю часть средств массовой информации или PBS на предметное стекло микроскопа с клетками вниз с помощью пинцета.
- Возьмите люминесцентные микрофотографии, как Hoechst и TMRM микрофотографии для каждого вида, с IRB Leica DM перевернутой флуоресцентного микроскопа (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия) в 400x увеличением.
8. Митохондриальная изоляции
- Подготовить около 10 мл гипотонического буфера (1 мМ ЭДТА, 5 мМ Трис-HCl, 210 мМ маннит, 70 мМ сахарозы, 10 мкМ Leu-ППК, 10 мкМ Пеп-и 100 мкм PMSF) и реакционного буфера и сохранить оба решения на льду.
- С 8 до 10 сливной T75 культуры тканей колбы SH-SY5Y клеток, trypsinize клетки, добавляют средства массовой информации для нейтрализации трипсина, собирать клеточные суспензии в 50 мл конические пробирки и центрифуги трубы 600 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° C.
- Удалить супернатант и ресуспендируют клетки гранулы примерно от 10 до 20 мл холодного PBS, центрифуги трубы 600 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° С, и повторить этот процесс мытья один раз.
- Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в холодной гипотонического буфера. Однородный клетки вручную с помощью мясорубки ткани стекла и центрифуги Клеточный лизат 600 мкг в течение 5 минут при 4 ° C.
9. Amplex Красной Пробирной
- После выделения митохондрий из клеток, оценить концентрацию белка в образце изолированных митохондриях с использованием стандартной кривой известных концентраций 1mg/mL BSA (бычий сывороточный альбумин) с BioRad анализа белка (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния, США) .
- Используя оценку концентрации белка в изолированных митохондриях решение, рассчитать объем этого решения, чтобы дать 20 мкг белка. Пипетировать этот объем в каждую лунку непрозрачной 96-луночного планшета, чтобы загрузить 20 мкг белка / а.
- Заполните каждую лунку в тарелку общим объемом 100 мкл с реакцией буфера, лечение от наркозависимости (с конечной концентрации 1 мкМ JCTH-4 и / или 10 мкМ ТАМ, или 250 мкМ PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON , СANADA), используемых в качестве положительного контроля), Красная Amplex реагента в конечной концентрации 50 мкМ, и пероксидазой хрена (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Канада) в соотношении 6 U/200 мкл.
- После 2 часов инкубации, взять показания флуоресценции на Ex. 560 нм и Em. 590 нм на spectrofluorometer (SpectraMax Близнецы XPS, Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США).
10. Сотовые Подготовка лизата
- Рост MCF7 клеток от 60 до 70% слияния в 10 см пластины тканевой культуры.
- Лечить клеток с 1 мкМ JCTH-4 и 10 мкМ ТАМ самостоятельно и в комбинации в течение 72 часов с 10 до 15 пластин в группе лечения.
- Подготовить буфер лизиса клеток (10 мМ Трис-HCl при рН 7,2, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1 мМ EGTA, 1% Triton-X-100, 10 мкМ Leu-ППК, 10 мкМ Пеп-и 100 мкм PMSF ) и хранить при температуре 4 ° C до использования.
- Механически выбить клеток с пластинки поверхности клетки скребок и собирают клетки меченых 50мл конических труб.
- Центрифуга труб при 600 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° C, удалите супернатант и ресуспендируют гранулы ячейки от 10 до 20 мл холодного PBS, центрифуги трубы 600 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° С, и повторить этот процесс стирки один раз.
- Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в холодной буфера для лизиса клеток. Однородный клетки вручную с помощью мясорубки ткани стекла и центрифуги Клеточный лизат 600 мкг в течение 5 минут при 4 ° C.
- Откажитесь от таблеток и хранения клеточных лизатов при температуре -20 ° C до использования.
11. Анализ западных Blot
- Определение концентрации белка клеточных лизатов использованием BioRad анализа белка (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния, США). Предмет белка образцов SDS-PAGE и переводят белок в нитроцеллюлозных мембран.
- После передачи, блок мембраны с 5% вес / объем молока TBST (трис-буферном растворе Твин-20) решение в течение 1 часа.
- Зонд мембран с муравьемя-LC3 антител, поднятые в кролика (1:500) (Novus биологические, Кат. NB100-2220, Литтлтон, Колорадо, США), или анти-β-актин антител, поднятые в мышь (1:1000) (Санта-Крус биотехнологии, Inc Кат. SC-81178, Пасо Роблес, Калифорния, США) в течение ночи при 4 ° C.
- Тема мембраны одного 15 минут и два 5 минут моет в TBST и инкубировать с анти-мышь (1:2000) или анти-кролик (1:2000) пероксидазы хрена конъюгированных вторичных антител (Abcam, Кат. Ab6728 и ab6802, Кембридж, Массачусетс, США) в течение 1 часа при температуре 4 ° C.
- Тема мембран для трех последовательных 5 минут моет в TBST и визуализировать белки группы с повышенной реагент хемилюминесценции (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Канада).
- Исполняет денситометрия анализа с использованием ImageJ программного обеспечения.
12. Monodansylcadaverine (MDC) Окрашивание
- Поместите покровное в каждую лунку 6 подальше нижней плиты культуре ткани и пластину MCF7 клеток в каждой лунке 6подальше нижней культуре ткани пластины в классе II биобезопасности кабинета. Позвольте им расти при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Когда клетки достигают от 60 до 70% слияния, относиться к ним с 1 мкМ JCTH-4 с помощью 1 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО и 10 мкМ ТАМ помощью 10 мМ маточного раствора, растворенного в ДМСО, как самостоятельно, так и в комбинации в классе II биобезопасности шкафу.
- Инкубируйте клетки с вышеупомянутой процедуры при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 72 часов.
- После обработки и инкубации клеток с препаратами, непосредственно добавить Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Канада) до конечной концентрации 0,1 мм в каждую лунку в течение 15 мин.
- Инкубируйте клеток с красителем на 5% CO 2 и 37 ° C в течение 15 минут защищенном от света месте.
- Внесите 30 мкл PBS СМИ или на предметном стекле микроскопа и принять покровное с 6 лунками и поместите его на верхнюю часть средств массовой информации или PBS на предметное стекло микроскопа с клетками ВВСКИнг вниз с помощью пинцета.
- Возьмите люминесцентные MDC и фазы микрофотографии, для каждого вида, с IRB Leica DM перевернутой флуоресцентного микроскопа (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия) в 400x увеличением.
13. Представитель Результаты
Селективный индукции апоптоза в человека Аденокарцинома молочной железы и клетки нейробластомы на JCTH-4: Повышение активности на ТАМ
Селективный индукции апоптоза была показана в различных раковых клетках естественным PST (рис. 1а), 11-13. Из-за низкой доступности PST, мы были синтезированы аналоги 7-deoxypancratistatin (JCTH-4, рис. 1б) и отбор их для подобных противораковой активностью в человеческой аденокарциномы молочной железы (MCF7) и клеток нейробластомы (SH-SY5Y). На первом этапе экспериментов, мы хотели контролировать морфологические изменения в течение долгого времени после лечения JCTH-4 и ТАМ самостоятельно и в комбинации MCF7 клеткис. MCF7 клеток наблюдали в течение 18 часов, как видно на видео 1 производства покадровой микроскопии с изображением фазового контраста, с растворителем лечения (контроль) в течение 48 часов, эти клетки выставлены никаких серьезных изменений в морфологии. С другой стороны, после 48 часов 1 мкМ JCTH-4 лечение, эти клетки выставлены морфологических изменений, связанных с апоптозом, таких как усадка, blebbing, апоптоза формирование тела, как показано на видео 2. С другой стороны, ТАМ лечение только в MCF7 клетки произвели очень четкие морфологии в том числе точечных включений свидетельствуют о autophagosomes связанные с аутофагии (видео 3). Очень минимальный апоптоза морфологией наблюдается и клетки в целом выставлены здоровый морфологии сопоставимы с растворителем контроль рассматривается MCF7 клеток. Интересно, что при наличии ТАМ, индукции апоптоза JCTH-4 резко повышается, как это указано на повышение апоптоза морфологией в MCF7 клеток после 48 часов, иллюстрирующихред в видео 4.
На втором этапе эксперимента мы использовали флуоресцентные красители для оценки индукции апоптоза. После 72 часов и 48 часов 1 мкМ JCTH-4 лечение в MCF7 и SH-SY5Y клеток, соответственно, Hoechst краска была использована и для контроля ядерных морфологии. Результаты показали, сгущенное, ярко окрашенных ядер сопровождается апоптотических тел в MCF7 и SH-SY5Y клеток, что свидетельствует о апоптоза индукции (рис. 2а, б). ТАМ лечением дали минимальный апоптоза ядерных морфологии MCF7 и SH-SY5Y клеток ядер были большие, круглые, и тускло окрашенных Hoechst сопоставимы с растворителем контрольной группе (рис. 2, б). В соответствии с Видео 4 ядра MCF7 и SH-SY5Y клетки имеют заметное увеличение апоптоза морфологией с комбинированной терапии после 72 часов (рис. 2, б).
Чтобы проверить апоптоза индукции, клетки были оценены на рhosphatidylserine экстернализации, маркером апоптоза, через Аннексин V связывания 17. MCF7 и SH-SY5Y клетках, обработанных в течение 72 и 48 часов соответственно с 1 мкМ JCTH-4 отдельно и в сочетании с 10 мкМ ТАМ были положительными Аннексин V обязательными, указывает зеленая флуоресценция, подтверждающие индукции апоптоза (рис. 3а, б ). Не очевидно экстернализации фосфатидилсерина наблюдался в MCF7 и SH-SY5Y клетках, обработанных только ТАМ, а также в клетках, обработанных NFF со всеми вышеупомянутыми группами лечения после 72 часов (рис. 3в). Таким образом, JCTH-4 отдельно и в сочетании с TAM выборочно вызывает апоптоз в MCF7 и SH-SY5Y клеток.
Для количественной оценки влияния JCTH-4 отдельно и в сочетании с TAM, WST-1 на основе колориметрический тест для жизнеспособности клеток, показатель активного клеточного метаболизма, был выполнен на MCF7 и NFF клетках, обработанных в течение 72 часов и SH-SY5Y клетках, обработанных в течение 48 часов.По сравнению с контрольными группами растворителей, 1 мкМ JCTH-4 снизилась активный клеточный метаболизм на 50%, в то время как 10 мкМ ТАМ только выставлены никаких существенных различий в обеих MCF7 и SH-SY5Y клетки (рис. 4, б). Интересно, что в MCF7 и SH-SY5Y клеток, добавление к JCTH ТАМ-4 оскорбления в результате синергетического снижение клеточного метаболизма. NFF клеток были значительно менее чувствительны к JCTH-4 и один JCTH-4 с TAM (рис. 4в). Таким образом, JCTH-4 демонстрирует избирательный синергетический деятельности с ТАМ в MCF7 и SH-SY5Y клеток.
Митохондриальная Таргетинг JCTH-4
Чтобы убедиться, что JCTH-4 ориентирован на митохондрии индуцировать апоптоз митохондриального мембранного потенциала в целом и клетки ROS поколения в изолированных митохондриях наблюдение. MCF7 клетки обрабатывали в течение 72 часов и окрашивали TMRM. 1 мкМ JCTH-4 снизилась ММП, обозначенные потери красной флуоресценции (рис. 5а). Тем не менее, с-йэлектронной добавлением 10 мкМ ТАМ, большая диссипация ММП наблюдается, в то время как 10 мкМ ТАМ только не очевидно воздействие на ММП.
Как увеличивается ROS поколения были связаны с митохондриальной мембраны пермеабилизации и индукции апоптоза, производство АФК оценивали с Amplex Красная краска в изолированных митохондриях из SH-SY5Y клетки обрабатывали 1 мкМ JCTH-4 и 10 мкМ ТАМ, самостоятельно и в комбинации 18 -20. Флуоресценции показания были выражены как относительные единицы флуоресценции (РФС). Увеличение ROS поколения наблюдались JCTH-4 и один TAM (рис. 5б). Интересно, что комбинированное лечение дало большее увеличение производства АФК. Известный индуктором продукции АФК в митохондрии, PQ, был использован в качестве положительного контроля.
Индукция Аутофагия по JCTH-4 и ТАМ
Autophagic индукции был связан с химиотерапевтическими оскорбление различных соединений
В аутофагии, микротрубочек связанных белка 1 легкой цепи 3 (LC3) обычно находится в цитозоле (LC3-I), lipidated с фосфатидилэтаноламин, а затем локализованная для autophagosomal мембран (LC3-II) 2. Чтобы проверить индукцией аутофагии, уровни LC3-II были оценены в MCF7 клетках, обработанных в течение 72 часов с помощью западных анализов пятно. 1 мкМ JCTH-4 слегка индуцированные превращения LC3-я в LC3-II, а 10 мкМ ТАМ производится больше autophagic ответ (рис.6b). Интересно, что комбинированное лечение привело к наибольшей индукцией аутофагии, уступая LC3-II в LC3-I соотношение больше 3. Таким образом, эти результаты показывают, autophagic индукции в MCF7 клеток JCTH-4 и ТАМ самостоятельно и в сочетании с наибольший отклик в клетках с комбинированной терапии.
Справочная Видео 1. Сотовой морфологии MCF7 клетках, обработанных растворителем управления. MCF7 клеток наблюдали между 48 и 66 часов после обработки растворителем управления (ДМСО) с помощью покадровой микроскопии с изображением фазового контраста. Клетки при температуре 37 ° C и 5% CO 2. Изображения были захвачены в 400x увеличением. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео .
Справочная Видео 2. Индукции апоптоза в клеточной морфологии MCF7 клетках, обработанных JCTH-4. MCF7 клеток наблюдали между 48 и 66 часов после лечения остроумиеч 1 мкМ JCTH-4 с помощью покадровой микроскопии с изображением фазового контраста. Клетки при температуре 37 ° C и 5% CO 2. Изображения были захвачены в 400x увеличением. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео .
Справочная видео 3. Индукция autophagic клеточной морфологии в MCF7 клетках, обработанных TAM. MCF7 клеток наблюдали между 48 и 66 часов после лечения с 10 мкМ ТАМ использованием замедленной микроскопии с изображением фазового контраста. Клетки при температуре 37 ° C и 5% CO 2. Изображения были захвачены в 400x увеличением. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео .
Справочная Видео 4. Расширенные апоптоза морфологии JCTH-4 с ТАМ в MCF7 клеток. MCF7 клеток наблюдали между 48 и 66 часов после лечения как с 1 мкМ JCTH-4 и 10 мкМ ТАМ использованием замедленной микроскопа с фазовым продолжениераст фотографий. Клетки при температуре 37 ° C и 5% CO 2. Изображения были захвачены в 400x увеличением. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео .
Рисунок 1. Структурное сравнение PST для синтетических 7-дезокси аналог. (А) Химическая структура pancratistatin (PST). (Б) Химическая структура JC-TH-ацетат-4 (JCTH-4).
Рисунок 2. JCTH-4 вызывает ядерная апоптоза морфологией с повышенной активностью с TAM. Ядерная морфология (а) MCF7 и (б) SH-SY5Y клетках, обработанных в течение 72 и 48 часов соответственно с указанной концентрацией ТАМ и JCTH-4 окрашенных Hoechst красителя. Контрольные группы лечились с растворителем (DMSO). Изображения были приняты на 400x увеличение на флуоресцентный микроскоп. Шкала бар = 15 мкм.
Рисунок 3. JCTH-4 причины фосфатидилсерина экстернализации самостоятельно и в сочетании с TAM выборочно в раковых клетках. Аннексин V привязки к вовне фосфатидилсерина оценивали проверить индукции апоптоза в (а) MCF7 (72 часа), (б) SH-SY5Y (48 часов), и (с) NFF (72 часа) клетки, обработанные JCTH-4 и ТАМ в указанной концентрации. Контрольные группы лечились при помощи растворителя (ДМСО). Изображения были приняты на 400x увеличение на флуоресцентный микроскоп. Шкала бар = 15 мкм.
Рисунок 4. ТАМ повышает жизнеспособность снижение на JCTH-4 выборочно в раковых клетках. 96-луночных планшетах были засеяны шм (а) MCF7, (б) SH-SY5Y, и (с) NFF клеток и обрабатывают JCTH-4 и ТАМ в указанной концентрации. MCF7 и NFF клетки обрабатывали в течение 72 часов и SH-SY5Y лечились в течение 48 часов. Сообщение лечения наркозависимости и инкубации WST-1 реагента в каждую лунку добавляют и поглощения показания были приняты на длине волны 450 нм и выражали в процентах от контроля (ДМСО). Статистика проводились с использованием GraphPad Prism 5.0. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение от quadruplicates 3 независимых экспериментов. MCF7: * р <0,001, ** р <0,0001 по сравнению с контролем; # р <0,05 в сравнении с 1 мкМ JCTH-4, † р <0,0001 по сравнению с 10 мкМ TAM. SH-SY5Y: * р <0,0005 по сравнению с контролем; # р <0,005 в сравнении с 1 мкМ JCTH-4, † р <0,005 в сравнении с 10 мкМ TAM. NFF: * р <0,005 в сравнении с 10 мкМ ТАМ + 1 мкМ JCTH-4 в MCF7 клеток; # р <0,01 в сравнении с 10 мкМ ТАМ + 1 мкМ JCTH-4 SH-SY5Y клеток.
Рисунок 5. JCTH-4 и ТАМ действует на митохондрии. (А) MCF7 клетки, выращенные на покровных и обрабатывают указанной концентрации препаратов в течение 72 часов и окрашивали TMRM оценить ММП. Клетки контрольной группы лечили при помощи растворителя (ДМСО). Изображения были захвачены в 400x увеличение на флуоресцентного микроскопа. Шкала бар = 15 мкм. (Б) изолированных митохондрий с SH-SY5Y клетки обрабатывали JCTH-4 и ТАМ в указанной концентрации и АФК оценивали с Amplex Красной субстрата в присутствии пероксидазы хрена (HRP). Клетки контрольной группы лечили при помощи растворителя (ДМСО). Параквата (PQ) был использован в концентрации 250 мкМ в качестве положительного контроля. Флуоресценции показания были получены через 2 часа лечения в Ex. 560 нм и Em. 590 нм и выражали в относительных fluorescencэлектронных блоков (РФС). Статистика были получены с использованием GraphPad Prism 5.0. Данные представитель 3-х независимых экспериментов с подобными тенденциями. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение от quadruplicates 1 независимый эксперимент. * Р <0,05, ** р <0,005, *** р <0,001 в сравнении с контролем; # р <0,05 в сравнении с 1 мкМ JCTH-4, † р <0,05 в сравнении с 10 мкМ ТАМ, @ р <0,05 в сравнении с 250 мкМ PQ.
Рисунок 6. ТАМ повышает autophagic индукции JCTH-4. (А) MCF7 клетки, выращенные на покровных и подвергается JCTH-4 и ТАМ оскорбления в указанной концентрации в течение 72 часов. Клетки контрольной группы лечили при помощи растворителя (ДМСО). Начать лечение, MCF7 клетки окрашивали MDC для обнаружения autophagic вакуоли. Изображения были захвачены в 400x увеличение на флуоресцентного микроскопа. Шкала бар = 15 мкм. (б) анализ Вестерн-блот проводились для LC3 и β-актина на клеточных лизатов MCF7 клетках, обработанных с указанной концентрацией препаратов в течение 72 часов. Денсиметрический анализы были выполнены с помощью программного обеспечения ImageJ. Статистика проводились с использованием GraphPad Prism 5.0. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. * Р <0,05, ** р <0,005, *** р <0,0005 по сравнению с контролем; # р <0,001 в сравнении с 1 мкМ JCTH-4, † р <0,001 в сравнении с 10 мкМ TAM.
Список сокращений.
| ER | рецептора эстрогена |
| ФМН | флавинмононуклеотида |
| JCTH-4 | JC-TH-ацетат-4 |
| LC3 | микротрубочек связанных белков 1 легкой цепи 3 |
| MDC | monodansylcadaverine |
| ММП | mitochondrIAL мембранного потенциала |
| MRC | дыхательной цепи митохондрий |
| NFF | нормальных человеческих эмбриональных фибробластов |
| PQ | паракват |
| PST | pancratistatin |
| РФС | Относительная единицах флуоресценции |
| АФК | активных форм кислорода |
| ТАМ | тамоксифен |
| TMRM | tetramethylrhodamine метилового эфира |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PST и аналогичных соединений было показано, что противораковыми свойствами 11-15,21. Ранее мы уже сообщали природных PST дестабилизировать митохондрии выборочно в раковых клетках, которые тем самым вызывает апоптоз выделением апоптогенное факторов 12,14. Вполне вероятно, что JCTH-4 действует через тот же механизм, JCTH-4 вызвали крах ММП в MCF7 клетки, как видно с TMRM окрашивания (рис. 5а), и увеличение генерации АФК в митохондрии, изолированные от SH-SY5Y клетки (рис. 5б), что свидетельствует о митохондриальной дисфункции. Таким образом, индукции апоптоза JCTH-4, скорее всего, через митохондриальную таргетинга в раковых клетках.
Многочисленные различия между доброкачественные и раковые клетки, которые могут служить основой для рака селективности JCTH-4. Раковые клетки сильно зависят от гликолиза, а не на митохондрии для производства энергии, это явление называетсяс эффектом Варбурга 22. Такие метаболической активности в раковых клетках приводит к повышению кислотности в цитозоле. Следовательно, кислой среды способствует цитозольного раковые клетки митохондрии гиперполяризации, которая была связана с повышенной способностью к вторжению и избежать апоптоза 23. Hyperpolariztion раковых клеток митохондрии однако, может сделать раковые клетки уязвимыми для JCTH-4, после их принятия в клетку, JCTH-4 может получить положительный заряд в результате ферментативного обработки и может выборочно будут рассмотрены в раковой клетке митохондрии в связи с их гиперполяризации природы. Кроме того, множество митохондрий связанных антиапоптотических белков было показано, что высоко в раковые клетки, которые запрещают митохондриальной мембраны пермеабилизации и последующей реализации апоптоза, такие как антиапоптотического белков Bcl-2 семейства белков, 24-26.
При наличии различных форм клеточного стресса, аутофагии срабатывает какпро выживания ответ, что позволяет клеткам выживать в неблагоприятных условиях 2. За возбуждение этого пути однако, может привести к обширным пробой жизненно внутриклеточных компонентов порождает autophagic 3 клеточной смерти. И ответы про выживания и про-autophagic смерти были связаны с химиотерапевтическими оскорбление 3. Митохондриальная дисфункция по JCTH-4 приводит к окислительному стрессу может вызвать автоматическое умолчанию autophagic ответ. Действительно, мы сделали некоторые наблюдения autophagic индукции апоптоза, а также с JCTH-4 лечения (рис. 2а, б 3а, б 6а, б). Хотя ТАМ был также создан в качестве антагониста ЭР в ER-положительных клеток рака молочной железы, недавно было показано, что взаимодействие с митохондриями, привязка к ФМН сайте Комплекса я 10. Кроме того, ТАМ хорошо известный индуктор аутофагии во многих типов раковых клеток 3. Действительно, ТАМ было привести к увеличению в поколение ROS в изолированных mitochondria (рис. 5б). Тем не менее, такое взаимодействие оказалось недостаточно, чтобы вызвать коллапс MMP (рис. 5а), но достаточно, чтобы вызвать типичные про-выживание autophagic ответ. Обширные autophagic индукции наблюдается при JCTH-4 и TAM были использованы в комбинации (рис. 6, б), которое сопровождалось расширенной цитотоксической реакции (рис. 4, б), наводит на мысль о про-смерть autophagic ответ, тем не менее, раковые клетки в конечном итоге умирают от апоптоза, в результате митохондриального пермеабилизации и апоптогенное релиз фактор. Такая чувствительность к TAM к JCTH-4 оскорбление может быть связано с увеличением в поколение АФК TAM. Потому как ТАМ и JCTH-4 способны генерировать окислительного стресса, комбинаторной производство таких стресс с обоих соединений может привести к обширным autophagic индукции порождает отрицательное autophagic ответ и / или крупных митохондриальной пермеабилизации и последующего апоптоза. Thсочетается лечение не влияет на жизнеспособность доброкачественное фибробластов (рис. 4в). Эти результаты показывают, что JCTH-4 самостоятельно и в сочетании с ТАМ могут быть эффективно использованы для лечения рака молочной железы и нейробластомы, не вызывая побочных эффектов на доброкачественные клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Рыцари Колумба Глава 9671 (Виндзор, Онтарио), и CIHR Фредерик Бантинг и Чарльз Лучший Канаде Высшее стипендия присуждена Денис Ма. Спасибо Роберт Ходж и Элизабет Fidalgo да Силва за помощь с покадровой микроскопии. Спасибо Кэти Facecchia для редактирования покадровой видео микроскопии. Мы также хотели бы поблагодарить Sudipa июня Чаттерджи и Филипп Tremblay для критического обзора этой рукописи. Данная работа посвящена памяти Кевин Couvillon, который потерял борьбе против рака в 2010 году.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 | |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30022.01 | |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 | |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corp. | P35G-014-C | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| H–chst 33342 dye | Molecular Probes, Life Technologies | H3570 | |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| WST-1 reagent | Roche Group | 11644807001 | |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer, Inc. | 1420-011 | |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | GIBCO, by Life Technologies | T-668 | |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 | |
| BioRad protein assay | Bio-Rad | 500-0001Bottom of Form | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 | |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 | |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 | |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 | |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
References
- Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
- Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
- Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
- Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
- Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J.
- Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
- Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
- Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
- McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
- Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
- Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
- Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
- Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
- Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
- Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
- Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. an, Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
- Warburg, O.
- Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
- Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).
