Повышение апоптоза и Autophagic после индукции Новые синтетические C-1 Аналог 7-deoxypancratistatin в человеческой аденокарциномы молочной железы и клетки нейробластомы с Тамоксифен
Summary
Мы синтезировали новый аналог pancratistatin с сопоставимыми противораковой активностью, как родной pancratistatin, интересно, комбинаторного лечения тамоксифеном дало резкое повышение в апоптозе и autophagic индукции митохондриальной ориентации с минимальным влиянием на доброкачественные фибробластов. Таким образом, JCTH-4 в сочетании с тамоксифена может обеспечить безопасное противораковой терапии.
Abstract
Рак молочной железы является одной из самых распространенных видов рака среди женщин в Северной Америке. Многие современные анти-лечения рака, в том числе ионизирующих излучений, индуцируют апоптоз через повреждения ДНК. К сожалению, такое лечение неселективными для раковых клеток и производят аналогичные токсичность в нормальных клетках. Мы сообщили селективной индукции апоптоза в раковых клетках естественным pancratistatin соединения (PST). В последнее время новые PST аналог, C-1 ацетоксиметил производных 7-deoxypancratistatin (JCTH-4), был произведен синтез заново, и это показывает сопоставимые избирательную активность вызывающих апоптоз в нескольких линиях раковых клеток. В последнее время аутофагии был вовлечен в злокачественные опухоли и как про-выживания и про-смерть механизмов в ответ на химиотерапию. Тамоксифен (TAM) неизменно продемонстрировала индукции про выживания аутофагии в многочисленных раковых заболеваний. В данном исследовании эффективность JCTH-4 отдельно и в сочетании с ТАМ, чтобы вызвать гибель клеток в человеческом cance грудиг (MCF7) и нейробластомы (SH-SY5Y) клеток оценивали. ТАМ только индуцированные аутофагии, но незначительная гибель клеток, тогда как JCTH-4 только нанесен значительный индукции апоптоза с некоторыми индукции аутофагии. Интересно, что комбинаторная лечение дало резкое увеличение апоптоза и autophagic индукции. Мы следили зависящих от времени морфологические изменения в клетках, подвергающихся MCF7 ТАМ-индуцированной аутофагии, JCTH-4-индуцированного апоптоза и аутофагии и ускоренной гибели клеток с комбинаторной лечения с использованием замедленной микроскопии. Мы показали этих соединений индуцировать апоптоз / аутофагии по митохондриальной таргетинга в этих раковых клеток. Важно отметить, что эти процедуры не влияют на выживание доброкачественные человеческие фибробласты. Таким образом, эти результаты показывают, что JCTH-4 в сочетании с ТАМ может быть использован в качестве безопасной и очень мощным анти-раковой терапии против рака молочной железы и клетки нейробластомы.
Protocol
Discussion
PST и аналогичных соединений было показано, что противораковыми свойствами 11-15,21. Ранее мы уже сообщали природных PST дестабилизировать митохондрии выборочно в раковых клетках, которые тем самым вызывает апоптоз выделением апоптогенное факторов 12,14. Вполне вероятно, что JCTH-4 д…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Рыцари Колумба Глава 9671 (Виндзор, Онтарио), и CIHR Фредерик Бантинг и Чарльз Лучший Канаде Высшее стипендия присуждена Денис Ма. Спасибо Роберт Ходж и Элизабет Fidalgo да Силва за помощь с покадровой микроскопии. Спасибо Кэти Facecchia для редактирования покадровой видео микроскопии. Мы также хотели бы поблагодарить Sudipa июня Чаттерджи и Филипп Tremblay для критического обзора этой рукописи. Данная работа посвящена памяти Кевин Couvillon, который потерял борьбе против рака в 2010 году.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C |
| Fetal bovine serum | Gibco BRL | 16000-044 |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Scientific | SH30022.01 |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-014-C |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A |
| Hoechst 33342 dye | Molecular Probes | H3570 |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| WST-1 reagent | Roche Applied Science | 11644807001 |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer | 1420-011 |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | Gibco BRL | T-668 |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 |
| BioRad protein assay | Bio-Rad Laboratories | 500-0001Bottom of Form |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
References
- Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
- Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
- Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
- Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
- Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
- Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
- Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
- McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
- Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
- Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
- Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
- Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
- Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
- Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
- Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. a. n., Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
- Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).
