Summary

Повышение апоптоза и Autophagic после индукции Новые синтетические C-1 Аналог 7-deoxypancratistatin в человеческой аденокарциномы молочной железы и клетки нейробластомы с Тамоксифен

Published: May 30, 2012
doi:

Summary

Мы синтезировали новый аналог pancratistatin с сопоставимыми противораковой активностью, как родной pancratistatin, интересно, комбинаторного лечения тамоксифеном дало резкое повышение в апоптозе и autophagic индукции митохондриальной ориентации с минимальным влиянием на доброкачественные фибробластов. Таким образом, JCTH-4 в сочетании с тамоксифена может обеспечить безопасное противораковой терапии.

Abstract

Рак молочной железы является одной из самых распространенных видов рака среди женщин в Северной Америке. Многие современные анти-лечения рака, в том числе ионизирующих излучений, индуцируют апоптоз через повреждения ДНК. К сожалению, такое лечение неселективными для раковых клеток и производят аналогичные токсичность в нормальных клетках. Мы сообщили селективной индукции апоптоза в раковых клетках естественным pancratistatin соединения (PST). В последнее время новые PST аналог, C-1 ацетоксиметил производных 7-deoxypancratistatin (JCTH-4), был произведен синтез заново, и это показывает сопоставимые избирательную активность вызывающих апоптоз в нескольких линиях раковых клеток. В последнее время аутофагии был вовлечен в злокачественные опухоли и как про-выживания и про-смерть механизмов в ответ на химиотерапию. Тамоксифен (TAM) неизменно продемонстрировала индукции про выживания аутофагии в многочисленных раковых заболеваний. В данном исследовании эффективность JCTH-4 отдельно и в сочетании с ТАМ, чтобы вызвать гибель клеток в человеческом cance грудиг (MCF7) и нейробластомы (SH-SY5Y) клеток оценивали. ТАМ только индуцированные аутофагии, но незначительная гибель клеток, тогда как JCTH-4 только нанесен значительный индукции апоптоза с некоторыми индукции аутофагии. Интересно, что комбинаторная лечение дало резкое увеличение апоптоза и autophagic индукции. Мы следили зависящих от времени морфологические изменения в клетках, подвергающихся MCF7 ТАМ-индуцированной аутофагии, JCTH-4-индуцированного апоптоза и аутофагии и ускоренной гибели клеток с комбинаторной лечения с использованием замедленной микроскопии. Мы показали этих соединений индуцировать апоптоз / аутофагии по митохондриальной таргетинга в этих раковых клеток. Важно отметить, что эти процедуры не влияют на выживание доброкачественные человеческие фибробласты. Таким образом, эти результаты показывают, что JCTH-4 в сочетании с ТАМ может быть использован в качестве безопасной и очень мощным анти-раковой терапии против рака молочной железы и клетки нейробластомы.

Protocol

Введение Апоптоз, или введите я запрограммированная смерть клетки, представляет собой физиологический процесс, который может работать внешне, через связывание лигандов смерти к смерти рецептором, или внутренне. Внутренние пути апоптоза инициируется внутриклеточных ст?…

Discussion

PST и аналогичных соединений было показано, что противораковыми свойствами 11-15,21. Ранее мы уже сообщали природных PST дестабилизировать митохондрии выборочно в раковых клетках, которые тем самым вызывает апоптоз выделением апоптогенное факторов 12,14. Вполне вероятно, что JCTH-4 д…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Рыцари Колумба Глава 9671 (Виндзор, Онтарио), и CIHR Фредерик Бантинг и Чарльз Лучший Канаде Высшее стипендия присуждена Денис Ма. Спасибо Роберт Ходж и Элизабет Fidalgo да Силва за помощь с покадровой микроскопии. Спасибо Кэти Facecchia для редактирования покадровой видео микроскопии. Мы также хотели бы поблагодарить Sudipa июня Чаттерджи и Филипп Tremblay для критического обзора этой рукописи. Данная работа посвящена памяти Кевин Couvillon, который потерял борьбе против рака в 2010 году.

Materials

Material Name Company Catalogue number
SH-SY5Y cell line ATCC CRL-2266
Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM Sigma-Aldrich 51448C
Fetal bovine serum Gibco BRL 16000-044
MCF7 cell line ATCC HTB-22
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R 0883
Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) Coriell Institute for Medical Research AG04431B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium Thermo Scientific SH30022.01
Tamoxifen citrate salt Sigma-Aldrich T9262
35 mm glass bottom culture dishes MatTek P35G-014-C
Leica DMI6000 B inverted microscope Leica Microsystems N/A
Hoechst 33342 dye Molecular Probes H3570
Leica DM IRB inverted fluorescence microscope Leica Microsystems N/A
Annexin V AlexaFluor-488 Invitrogen A13201
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-20ML
Haemocytometer Fisher Scientific 267110
WST-1 reagent Roche Applied Science 11644807001
Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter PerkinElmer 1420-011
Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) Gibco BRL T-668
Glass tissue grinder Fisher Scientific K8885300-0002
BioRad protein assay Bio-Rad Laboratories 500-0001Bottom of Form
Amplex Red Invitrogen A12222
Horseradish peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8125
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices 3126666
Anti-LC3 antibody raised in rabbit Novus Biologicals NB100-2220
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6728
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6802
Chemiluminescence peroxidase substrate Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

References

  1. Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
  2. Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
  3. Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
  6. Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
  7. Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
  8. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
  9. Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
  10. Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
  11. Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
  12. McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
  13. Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
  14. Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
  15. Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
  16. Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
  17. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
  18. Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  19. Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
  20. Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
  21. Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. a. n., Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
  22. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  23. Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
  24. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  25. Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
  26. Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).

Play Video

Cite This Article
Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).

View Video