Summary
יש לנו מסונתז אנלוגי הרומן של pancratistatin עם פעילות נוגדת סרטן דומה כמו pancratistatin יליד; מעניין, טיפול הקומבינטורית עם טמוקסיפן הניב שיפור דרסטי אינדוקציה אפופטוטיים ו autophagic ידי המיטוכונדריה מיקוד עם השפעה מזערית על fibroblasts סרטני. לכן, JCTH-4 בשילוב עם טמוקסיפן יכול לספק טיפול בטוח נגד סרטן.
Abstract
סרטן השד הוא אחד מסוגי הסרטן השכיחים ביותר בקרב נשים בצפון אמריקה. רבים כיום טיפולים נגד סרטן, כולל קרינה מייננת, לעורר אפופטוזיס באמצעות נזק לדנ"א. למרבה הצער, טיפולים כאלה הם לא סלקטיבית לתאים הסרטניים מייצרים רעילות דומה תאים נורמליים. דיווחנו אינדוקציה סלקטיבית של אפופטוזיס של תאים סרטניים על ידי pancratistatin מרכיב טבעי (PST). לאחרונה, PST רומן אנלוגי, נגזרת C-1 acetoxymethyl של 7-deoxypancratistatin (JCTH-4), הופק על ידי סינתזה דה נובו והוא מציג התרמה דומה סלקטיבית פעילות אפופטוזיס של שורות תאים סרטניים שונים. לאחרונה, autophagy היה מעורב ממאירות כמו ההישרדות-Pro וגם תומכי המוות מנגנוני בתגובה כימותרפיה. טמוקסיפן (TAM) הוכיחה תמיד אינדוקציה של autophagy הפרו הישרדות סוגי סרטן רבים. במחקר זה, יעילותם של JCTH-4 לבד או ביחד עם TAM לגרום מותם של תאים cance השד האנושיR (MCF7) ו נוירובלסטומה (SH-SY5Y) תאים הוערך. TAM לבד המושרה autophagy, אבל מוות של תאים חסר משמעות בעוד JCTH-4 לבדה גרמה לזירוז משמעותי של אפופטוזיס עם אינדוקציה חלק autophagy. מעניין לציין, כי הטיפול הקומבינטורית הניבו עלייה דרסטית אינדוקציה אפופטוטיים ו autophagic. אנחנו במעקב זמן תלויי שינויים מורפולוגיים MCF7 תאים שעברו TAM-Induced autophagy, JCTH-4-induced אפופטוזיס ו autophagy, ומוות תאים מואצת עם טיפול קומבינטורית באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ. אנחנו הוכיחו התרכובות הללו כדי לגרום לאפופטוזיס / autophagy ידי מיקוד המיטוכונדריה אלה תאים סרטניים. חשוב לציין, טיפולים אלה לא השפיעו על ההישרדות של fibroblasts אדם סרטניים. לפיכך, תוצאות אלה מצביעות על כך JCTH-4 בשילוב עם TAM יוכל לשמש כטיפול נגד סרטן בטוח חזק מאוד מפני סרטן השד תאים neuroblastoma.
Protocol
הקדמה
אפופטוזיס, או הקלד אני מוות תאים מתוכנת, הוא תהליך פיזיולוגי שיכול לפעול extrinsically, באמצעות קשירה של ליגנד לקולטן מוות מוות, או באופן מהותי. מסלול הפנימי של אפופטוזיס הוא שיזם מתח תאיים כמו נזק לדנ"א ואת תפקוד המיטוכונדריה, זה מוביל בסופו של דבר permeabilization של פיזור, המיטוכונדריה של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה (MMP), שחרור של גורמים apoptogenic מהחלל intermembrane המיטוכונדריה, וביצוע הבאים של אפופטוזיס 1.
Autophagy הוא תהליך שבו התא הפסקות, מבזה, ו ממחזר מרכיבים תאיים שלה, תוך שמירה על שלמות קרום הפלזמה, היא מופעלת על ידי סוגים שונים של לחצים הסלולר כולל היפוקסיה לחץ חמצוני, אגרגטים חלבון, מחסור תזונתי, מחסור גורם צמיחה, אברונים פגומים 2. בשלבים הראשוניםבתהליך זה, החומר cytosolic נבלע על ידי autophagosomes, פעמיים membraned שלפוחית, אשר מתחברות lysosomes כדי ליצור autolysosomes. הודעה היתוך lysosomal, חומרים cytosolic שננקטו בעבר על ידי autophagosomes מפורקים על ידי אנזימי lysosomal 2. הפעלה נרחבת של מסלול זה מניב השפלה נרחב של מרכיבים תאיים דבר שעלול להוביל למוות התא autophagic או סוג ב 'מוות מתוכנת התא 3.
ההתחמקות של מוות של תאים נחשב לאחד מסימני ההיכר של סרטן 4. סרטן היא מחלה המאופיינת על ידי גידול תאים בלתי מבוקרת ועל ריבוי 5. בפרט, neuroblastoma נובעת פיתוח בתאי העצב של מערכת העצבים הסימפתטית מן הרכס העצבי 6. זהו הגידול המוצק השכיח ביותר המתרחשים אצל ילדים צעירים, המהווה כ -9% ממקרי סרטן בילדות 7. למרות ההתקדמות הרבה שנעשתה עד היום, מחלה זו נותרה בעייתיתלשני מדענים ורופאים. מצד שני, סרטן השד הוא הסרטן השכיח ביותר בקרב נשים 8. טמוקסיפן (TAM) נעשה שימוש לעתים קרובות הורמונים תגובה סרטן שד לטיפול כמו קולטן אסטרוגן (ER) אנטגוניסט 9. עם זאת, דיווחים אחרים לספק ראיות של מנגנונים עצמאיים נוספים של אינדוקציה אפופטוזיס תם. בפרט, TAM אינטראקציה עם קומפלקס אני שרשרת הנשימה במיטוכונדריה (MRC) בשעה mononucleotide שלה פלבין (FMN) אתר 10.
PST הוא תרכובת טבעית בודד מצמח Hymenocallis littoralis. בניגוד מ chemotherapeutics רבים כיום בשימוש, הוכח לגרום אפופטוזיס, באופן בלתי genotoxic, סלקטיבי תאים מסוגים שונים סרטן באמצעות המיטוכונדריה מיקוד 11-15. עם זאת, העבודה פרה קליניים התעכבה בשל זמינותו, אלא נוכח כמויות נמוכות מאוד במקור הטבעי complic רביםations נטל סינתזה כימית שלה. יש לנו מסונתז ולא הוקרן אנלוגים סינתטיים של deoxypancratistatin-7 ו נצפתה פעילות דומה נגד סרטן נגזרת C-1 acetoxymethyl, JC-TH-acetate-4 (JCTH-4) 16. עכשיו יש לנו ביד אנלוגי סינתטי PST עם פעילות נוגדת סרטן עוצמה. הסינתזה שלו היה סטנדרטי וניתן לשנותם עד כדי לייצר כמויות מספיקות לעבודה פרה קליניים. מאז PST טבעי TAM הן היעד המיטוכונדריה, זה יהיה מעניין לחקור את ההשפעה המשולבת של באנלוג סינתטי של PST על סרטן השד אנושי בתאי נוירובלסטומה בשילוב עם TAM.
במסמך זה אנו מדווחים cytotoxicity סלקטיבית של JCTH-4 ב neuroblastoma האנושי (SH-SY5Y) ו אדנוקרצינומה של השד (MCF7) תאים. JCTH-4 הצליח לגרום אפופטוזיס בשתי שורות תאים על ידי מיקוד המיטוכונדריה; JCTH-4 נגרם בזבוז של MMP וגידול מינים החמצן מגיב (ROS) ייצור מבודד mitochondria אלה תאים סרטניים. יתר על כן, autophagy היה המושרה על ידי JCTH-4 ב MCF7 תאים. מעניין לציין, כי תוספת של TAM לפגיעה-4 JCTH לשפר את ההשפעות הנ"ל של JCTH-4 ב SH-SY5Y ו MCF7 תאים. שינויים מורפולוגיים הנגרמת על ידי JCTH-4 ו TAM לבד או ביחד ב MCF7 תאים נוטרו באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות של ניגוד שלב או תמונות שדה בהירים. רגיל fibroblasts העובר אדם (NFF) הציג ירידה ניכרת רגישות JCTH-4 הן לבד והן בשילוב עם TAM. לכן, מקרים אלה מצביעים על JCTH-4, לבד, עם TAM, להיות סוכן כימותרפיות בטוח ויעיל מפני סרטן השד נוירובלסטומה.
חומרים ושיטות
1. תא תרבות
- לגדול תרבות SH-SY5Y neuroblastoma תאים אנושיים (ATCC, חתול. ארה"ב לא CRL-2266, Manassas, VA,) עם המדיום שינוי הנשרים של Dulbecco F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, קנדה) בתוספת 2 מ"מ L-glutaminאלקטרוני, 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו - 10 מ"ג / מ"ל גנטמיצין (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, קנדה). לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לגדול בתרבות MCF7 אדם אדנוקרצינומה בשד תאים (ATCC, חתול. לא HTB-22, Manassas, וירג 'יניה, ארה"ב) בשנת 1640 RPMI בינוני (Sigma-Aldrich קנדה, Mississauga, ON, קנדה) בתוספת 10% FBS סטנדרטי (Thermo מדעי, Waltham, MA) ו 10 מ"ג / מ"ל גנטמיצין (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, קנדה). לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לגדול בתרבות פיברובלסטים נורמליים ככל הנראה העובר האנושי (NFF) שורת תאים (Coriell המכון למחקר רפואי, חתול. לא AG04431B, קמדן, ניו ג'רזי, ארה"ב) ב בינוני שינוי Dulbecco של הנשרים, גלוקוז גבוהות (Thermo Scientific, Waltham, MA, ארצות הברית ) השלימו עם 15% FBS ו 10 מ"ג / מ"ל גנטמיצין (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, קנדה). לשמור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
2. התרופה הכנה
- לשקול את טמוקסיפן (TAM) מלח ציטרט (Sigma-Aldrich, חתול. לא T9262, Mississauga, ON, קנדה) לפזר אותו DMSO להכין פתרון המניה 10 מ"מ. במלאי החנות פתרון ב -20 ° C עד השימוש. הרכב כל הפקדים השתמשו במחקר זה הכיל DMSO על פחות מ -0.5%.
- חזור על שלב 2.1 להכין פתרון המניה 1 mM מומס DMSO של JC-TH-acetate-4 (JCTH-4), המיוצר על ידי סינתזה chemoenzymatic מ bromobenzene כפי שתואר קודם לכן 16. במלאי החנות פתרון ב -20 ° C עד השימוש. הרכב כל הפקדים השתמשו במחקר זה הכיל DMSO על פחות מ -0.5%.
3. זמן לשגות מיקרוסקופית
- צלחת כ 2.0 x 10 5 MCF7 תאים 35 מ"מ זכוכית התחתונה הכלים תרבות (MatTek Corporation, חתול. לא P35G-014-C, אשלנד, מסצ'וסטס, ארה"ב) בתנאים סטריליים של הממשלה השנייה biosafety בכיתה ולאפשר להם לגדול 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- כאשר התאים מגיעים מפגש 60-70%, להתייחס אליהם עם 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות 1 מ"מהמניות פתרון מומס DMSO ו TAM 10 מיקרומטר באמצעות פתרון המניה 10 mM מומס DMSO, לבד או ביחד השנייה בכיתה ב biosafety הממשלה.
- לאחר הטיפול התאים למשך 48 שעות, תאים מקום בתא מחומם על 37 מעלות צלזיוס עם CO 5% 2 על הבמה של מיקרוסקופ הלייקה DMI6000 ניאון (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה).
- שימוש LAS AF6000 תוכנה, להגדיר את המיקרוסקופ לקחת בניגוד שלב או micrographs שדה בהירים בהגדלה 400x כל 5 דקות במשך 18 שעות.
4. הגרעין מכתים
- צלחת כ 2.0 x 10 5 MCF7 או SH-SY5Y התאים של כל אחד 6 ברור גם צלחת רקמת התרבות התחתונה השנייה בכיתה biosafety הממשלה ולאפשר להם לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- כאשר התאים מגיעים מפגש 60-70%, להתייחס אליהם עם 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות פתרון המניה 1 mM מומס DMSO ו TAM 10 מיקרומטר באמצעות פתרון המניה 10 mM מומס DMSO, הןלבד או ביחד ב ב בכיתה biosafety הממשלה.
- דגירה תאים עם הטיפולים הנ"ל ב 37 ° C ו - 5% CO 2 למשך 48 שעות (SH-SY5Y תאים) או 72 שעות (MCF7 תאים).
- לאחר טיפול הדגירה של תאים עם תרופות, להוסיף ישירות Hoechst 33342 צבע (בדיקות מולקולריות, יוג'ין, או, ארה"ב) לתקשורת של תאים שטופלו לריכוז סופי של 10 מיקרומטר להכתים גרעינים.
- דגירה של תאים עם צבע Hoechst במשך 5 עד 10 דקות מוגנים מפני אור.
- מניחים את הצלחת על במת המיקרוסקופ DM Leica IRB הפוך הקרינה (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה).
- קח micrographs הניאון בשלב בהגדלה 400x.
5. Annexin V Assay עקידת
- צלחת כ 5.0 x 10 5 MCF7, SH-SY5Y או תאים NFF ב 10 מ"ל רקמות צלחות תרבות ב II בכיתה biosafety הממשלה ולאפשר להם לגדול ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- Wתאים תרנגולת להגיע מפגש 60-70%, להתייחס אליהם עם 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות פתרון המניה 1 mM מומס DMSO ו TAM 10 מיקרומטר באמצעות 10 המניות mM פתרון מומס DMSO, הן לבד והן בשילוב של הכיתה השנייה biosafety הקבינט.
- דגירה תאים עם הטיפולים הנ"ל ב 37 ° C ו - 5% CO 2 למשך 48 שעות (SH-SY5Y תאים) או 72 שעות (MCF7 ותאי NFF).
- הכן Annexin חיץ V מחייב DDH 2 O עם 10 HEPES מ"מ, 10 mM NaOH, 140 מ"מ NaCl, ו 1 mM CaCl 2 ב-pH 7.6 וחנות ב 4 ° C עד השימוש.
- לאחר טיפול הדגירה של תאים עם סמים, להסיר את מדיה לוחות המכילים תאים המרחפים ולמקם אותו לתוך צינור נפרד מ"ל 15 חרוטי לכל קבוצת טיפול שונה שכותרתו עם הטיפול הנכון.
- ניתוק תאים חסיד מהצלחות באמצעות טריפסין.
- אחרי התאים הרים מהצלחת כתוצאה טריפסין, לשאוב התקשורת להציב 15 מ"ל חרוטיצינור אל בשלב 5.4 ולמקם אותו בחזרה צלחות המקוריים עם התאים המרחפים טריפסין.
- עם מילוי פיפטה אלקטרונית סרולוגיות בטפי להחדרת נוזלים, לערבב את התקשורת עם פתרון התא טריפסין ומניחים את התערובת בחזרה -15 צינורות המתאימים חרוטי מ"ל.
- בצנטריפוגה תאים ב XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° C, להסיר את supernatant מהצינור זה, ותאי resuspend ב PBS.
- בצנטריפוגה תאים ב XG 600 במשך 5 דקות, להסיר את supernatant מהצינור זה, ותאי resuspend בשפופרות microfuge תווית עם μL על 50-70 של המאגר V Annexin מחייב.
- הוסף Annexin V AlexaFluor-488 (1:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, קנדה) Hoechst צבע לריכוז סופי של 10 מיקרומטר ו דגירה במשך 15 דקות מוגנים מפני אור.
- הדגירה הבאה, מערבולת אחד הצינורות microfuge, להוסיף 7-10 μL של התערובת בתא לשקופית מיקרוסקופ, מקם מעליהן coverslip תערובת תאים על microscopשקופיות דואר ולקחת micrographs ניאון, הן וולט Annexin ו Hoechst תמונות עבור כל תצוגה, בהגדלה 400x על IRB Leica DM הפוך מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה). חזור על הפעולה עבור כל דגימה הניסוי בכל אחד הצינורות microfuge הנותרים.
6. Tetrazolium מסיס במים מלח (WST-1) Assay על כדאיות התא
- Trypsinize בקבוק confluent T75 או 10 ס"מ רקמות תרבות צלחת MCF7, SH-SY5Y או תאים NFF ב II בכיתה biosafety הממשלה.
- אחרי התאים הוסרו, מוסיפים 5-10 מ"ל של התקשורת טריפסין ומניחים ההשעיה תא התקשורת בצינור מ"ל 15 חרוטי.
- בצנטריפוגה תאים ב XG 600 במשך 5 דקות, מניחים את הצינור לתוך ארון בטיחות ביולוגית, הסר supernatant מהצינור כל אחד, resuspend התאים מ"ל בערך 1 עד 3 מתוך התקשורת בהתאם לגודל התא גלולה.
- מקום 10 μL ההשעיה תא צינור microfuge, להוסיף 10 μL של Trypan צבע כחול (Sigma אולדריץ, Mississauga, ON, קנדה), ומערבבים עם micropipette.
- טען 10 μL של תאים Trypan כחול מושעה על haemocytometer (האוסר מדעי, ארה"ב), לספור את התאים, ולחשב את ריכוז התאים של השעיה תא הצינור המקורי חרוטי 15 מ"ל.
- השתמש ריכוז כדי לקבוע את עוצמת הקול של ההשעיה התא המקורי צורך ליצור השעיות סלולריים מדולל בריכוז של 1.5 x 10 5 תאים למ"ל עבור MCF7 ו SH-SY5Y ו 5.0 x 10 4 עבור תאים NFF הדרושים ציפוי.
- השתמש השעיות סלולריים מדולל לצלחת 15 x 10 3 MCF7 או SH-SY5Y תאים / טוב או 5.0 x 10 3 תאים NFF / גם על ידי הוספת 100 μL של המתלים סלולריים מדולל היטב כל אחד 96 גם רקמות ברור הצלחת התחתונה התרבות. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך הלילה.
- פנקו את התאים עם 1 מיקרומטר JCTH-4 ו 10 מיקרומטר תם הן לבדן או ביחד השנייה בכיתה ב biosafety ארון שעה 72s עבור MCF7 ותאי NFF, ובמשך 48 שעות SH-SY5Y תאים.
- לאחר טיפול הדגירה של תרופות, להוסיף 10 μL של WST-1 מגיב (Roche Applied Science, אינדיאנפוליס, אינדיאנה, ארה"ב) זה טוב דגירה הצלחת במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- קח קריאות ספיגת ב 450 ננומטר על ויקטור Wallac 3 1420 Multilabel מונה (PerkinElmer, וודברידג', על, קנדה) ולהביע בהם אחוז בקבוצת הביקורת ממס.
7. Tetramethylrhodamine מתיל אסתר (TMRM) מכתים
- מניחים coverslip לבאר כל אחד 6 ברור גם צלחת רקמת התרבות התחתונה צלחת MCF7 התאים של כל אחד צלחת 6 התרבות גם רקמות ארון בכיתה biosafety השנייה. לאפשר להם לגדול ב 37 ° C ו-CO 5% 2.
- כאשר התאים מגיעים מפגש 60-70%, להתייחס אליהם עם 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות פתרון המניה 1 mM מומס DMSO ו TAM 10 מיקרומטר באמצעות פתרון המניה 10 mM מומס DMSO,הן לבד והן בשילוב של Class II biosafety הממשלה.
- דגירה תאים עם הטיפולים הנ"ל ב 37 ° C ו - 5% CO 2 למשך 72 שעות.
- לאחר טיפול הדגירה של תאים עם תרופות, להוסיף ישירות Hoechst 33342 צבע (בדיקות מולקולריות, יוג'ין, או, ארה"ב) לתקשורת של תאים שטופלו לריכוז סופי של 10 מיקרומטר להכתים גרעינים כמו גם tetramethylrhodamine מתיל אסתר (TMRM ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, קנדה) בריכוז הסופי של 200 ננומטר.
- דגירה של תאים עם צבעים ב 5% CO 2 ו - 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות מוגנים מפני אור.
- פיפטה 8 μL של התקשורת או PBS לשקופית מיקרוסקופ ולקחת coverslip מהצלחת 6 היטב ומניחים אותו על גבי מדיה או PBS בשקופית מיקרוסקופ עם התאים פונה כלפי מטה עם פינצטה.
- קח micrographs ניאון, הן Hoechst ו micrographs TMRM עבור כל תצוגה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי IRB DM Leica הפוכה (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה) בהגדלה 400x.
8. מיטוכונדריאלי בידוד
- הכן על 10 מ"ל של חיץ hypotonic (1 mM EDTA, 5 מ"מ טריס-HCl, 210 מ"מ מניטול, סוכרוז 70 מ"מ, 10 מיקרומטר Leu-PEP, 10 מיקרומטר פפ-A, ו 100 מיקרומטר PMSF) ו - חיץ התגובה לשמור על שני פתרונות על קרח.
- עם כ 8-10 confluent T75 תרבות צלוחיות של רקמות SH-SY5Y תאים, trypsinize את התאים, להוסיף מדיה לנטרל את טריפסין, לאסוף את המתלים סלולריים ב -50 צינורות חרוטי מ"ל, ו בצנטריפוגה צינורות ב XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° ג
- מוציאים את כדורי סלולריים supernatant ו resuspend מ"ל כ -10 עד 20 מתוך קר PBS, בצנטריפוגה צינורות ב XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° C, לחזור על תהליך זה לשטוף פעם אחת.
- הסר את supernatant ו resuspend התאים במאגר hypotonic קר. Homogenize התאים באופן ידני עם מטחנת רקמת זכוכית בצנטריפוגה lysate התא XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° C.
9. Amplex Assay האדום
- אחרי בידוד המיטוכונדריה מהתאים, להעריך את הריכוז של חלבון המדגם של המיטוכונדריה מבודד באמצעות עקומת תקן של ריכוזים ידועים של BSA (1mg/mL שור אלבומין סרום) עם assay חלבון BioRad (Bio-Rad Laboratories, הרקולס, קליפורניה ארה"ב) .
- באמצעות ריכוז מוערך של חלבון הפתרון המיטוכונדריה מבודד, לחשב את עוצמת הקול של פתרון זה לתת 20 מיקרוגרם של חלבון. פיפטה זה נפח לבאר כל צלחת 96-גם אטום כדי לטעון 20 מיקרוגרם של חלבון / טוב.
- ממלאים כל טוב בצלחת לנפח כולל של 100 μL עם חיץ התגובה, טיפול תרופתי (עם הריכוז הסופי של 1 מיקרומטר JCTH-4, ו / או TAM 10 מיקרומטר, או 250 מיקרומטר PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON , גanada) משמש כביקורת חיובית), מגיב Amplex האדום בריכוז סופי של 50 מיקרומטר, ואת חזרת peroxidase (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, קנדה) ביחס של μL U/200 6.
- לאחר דגירה 2 שעה, לקחת קריאות הקרינה על אקס. 560 ננומטר ו אם. 590 ננומטר על spectrofluorometer (SpectraMax XPS ג'מיני, התקנים מולקולריים, Sunnyvale, קליפורניה, ארה"ב).
10. הכנה נייד lysate
- לגדול MCF7 התאים מפגש 60-70% ב -10 רקמות צלחות ס"מ תרבות.
- פנקו את התאים עם 1 מיקרומטר JCTH-4 ו 10 מיקרומטר תם לבד או ביחד במשך 72 שעות עם כ 10-15 צלחות בכל קבוצת טיפול.
- הכן תמוגה חיץ התא (10 mM Tris HCl ב-pH 7.2, 5 מ"מ KCl, 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100, 10 מיקרומטר Leu-PEP, 10 מיקרומטר פפ-A, ו - 100 מיקרומטר PMSF ) ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
- מכנית לסלק תאים משטחי צלחת עם מגרד תא ולאסוף תאים 50 שכותרתומ"ל צינורות דמויי קונוס.
- בצנטריפוגה צינורות ב XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° C, להסיר את כדורי סלולריים supernatant ו resuspend מ"ל כ -10 עד 20 מתוך קר PBS, צנטריפוגה צינורות ב XG 600 במשך 5 דקות 4 ° C, לחזור על תהליך הכביסה פעם אחת.
- הסר את supernatant ו resuspend התאים במאגר תא קר תמוגה. Homogenize התאים באופן ידני עם מטחנת רקמת זכוכית בצנטריפוגה lysate התא XG 600 במשך 5 דקות על 4 ° C.
- מחק את כדורי ולאחסן את lysates סלולריים ב -20 ° C עד השימוש.
11. מחי ניתוח המערב
- לקבוע את ריכוז החלבון של lysates סלולריים באמצעות assay חלבון BioRad (Bio-Rad Laboratories, הרקולס, קליפורניה ארה"ב). להכפיף את דגימות חלבון עמוד SDS וחלבון העברה קרום nitrocellulose.
- לאחר ההעברה, ממברנות לחסום עם 5% w / v חלב TBST (טריס שנאגרו מלוחים Tween-20) פתרון לשעה 1.
- בדיקה ממברנות עם נמלהi-LC3 נוגדנים וגדל ארנב (1:500) (נובוס ביולוגיות, חתול. לא NB100-2220, ליטלטון, CO, ארה"ב), או נוגדנים נגד β-אקטין וגדל העכבר (1:1000) (סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, Inc, חתול. לא SC-81178, פאסו רובלס, קליפורניה, ארה"ב) לילה ב 4 ° C.
- ממברנות נושא עד דקה 15 1 ושני 5 שוטף דקה TBST ו דגירה עם העכבר נגד (1:2000) או ארנבת אנטי (1:2000) חזרת peroxidase-מצומדות נוגדנים משני (Abcam, חתול. לא ab6728 & ab6802, קיימברידג', מסצ'וסטס, ארה"ב) במשך שעה 1 ב 4 ° C.
- ממברנות נושא שלושה שוטף 5 דקות רצופות TBST ולדמיין להקות חלבון מגיב chemiluminescence משופרת (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, קנדה).
- בביצוע ניתוחים צפיפות באמצעות ImageJ התוכנה.
12. Monodansylcadaverine (MDC) מכתים
- מניחים coverslip לבאר כל אחד 6 ברור גם צלחת רקמת התרבות התחתונה צלחת MCF7 התאים של כל אחד 6גם התחתונה ברורה רקמת התרבות הצלחת השנייה בכיתה biosafety הממשלה. לאפשר להם לגדול ב 37 ° C ו-CO 5% 2.
- כאשר התאים מגיעים מפגש 60-70%, להתייחס אליהם עם 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות פתרון המניה 1 mM מומס DMSO ו TAM 10 מיקרומטר באמצעות 10 המניות mM פתרון מומס DMSO, הן לבד והן בשילוב של הכיתה השנייה biosafety הקבינט.
- דגירה תאים עם הטיפולים הנ"ל ב 37 ° C ו - 5% CO 2 למשך 72 שעות.
- לאחר טיפול הדגירה של תאים עם סמים, להוסיף ישירות Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, קנדה) לריכוז סופי של 0.1 מ"מ היטב כל 15 דקות.
- דגירה תאים עם צבע 5% CO 2 ו - 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות מוגנים מפני אור.
- פיפטה 30 μL של התקשורת או PBS לשקופית מיקרוסקופ ולקחת coverslip מהצלחת 6 היטב ומניחים אותו על גבי מדיה או PBS בשקופית מיקרוסקופ עם תאים faciמטה נג עם פינצטה.
- קח ניאון MDC ו micrographs שלב, עבור כל תצוגה, עם IRB DM Leica הפוך מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה) בהגדלה 400x.
13. נציג תוצאות
אינדוקציה סלקטיבית של אפופטוזיס אדנוקרצינומה השד האדם תאים neuroblastoma ידי JCTH-4: שיפור של פעילות על ידי TAM
אינדוקציה סלקטיבית של אפופטוזיס הוצגה על ידי תאים סרטניים שונים טבעית PST (איור 1 א) 11-13. בשל זמינות נמוכה של PST, יש לנו מסונתז אנלוגים של 7-deoxypancratistatin (JCTH-4, איור. 1B) ו הוקרן אותם לפעילות נגד סרטן השד דומה אדנוקרצינומה האנושי (MCF7) ותאי נוירובלסטומה (SH-SY5Y). בשלב הראשון של ניסויים, רצינו לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים לאורך זמן לאחר טיפול JCTH-4 ו TAM לבד או ביחד בתא MCF7s. MCF7 התאים היו במעקב במשך 18 שעות, כפי שניתן לראות וידאו 1 מיוצר על ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות עם תמונות בניגוד שלב, עם טיפול ממס (שליטה) על 48 שעות; תאים אלה הציג שום שינויים משמעותיים המורפולוגיה. לעומת זאת, לאחר 48 שעות של טיפול 1 מיקרומטר JCTH-4, תאים אלו הוצגו שינויים מורפולוגיים הקשורים אפופטוזיס כגון התכווצות, blebbing, במבנה הגוף אפופטוטיים כמו לראות וידאו 2. מצד שני, טיפול TAM לבד MCF7 תאים המיוצרים המורפולוגיה שונה מאוד כולל תכלילים punctate המעידים על autophagosomes הקשורים autophagy (Video 3). מורפולוגיה אפופטוטיים מאוד מינימלי נצפתה ותאים בריאים בדרך כלל בתערוכות מורפולוגיה דומה לשליטה ממס טיפול MCF7 תאים. מעניין, בנוכחותו של TAM, אינדוקציה אפופטוטיים ידי JCTH-4 היה משופר בצורה דרסטית כפי שצוין על ידי המורפולוגיה אפופטוטיים מוגברת MCF7 תאים לאחר 48 שעות, כמו illustratאד וידאו 4.
בשלב השני של הניסויים השתמשנו צבעי ניאון כדי להעריך את אינדוקציה של אפופטוזיס. לאחר 72 שעות ו 48 שעות של טיפול 1 מיקרומטר JCTH-4 ב MCF7 ו SH-SY5Y תאים בהתאמה, Hoechst צבע היה בשימוש, כדי לפקח על מורפולוגיה גרעינית. התוצאות הצביעו על גרעין מרוכז, מוכתם בהיר מלווה גופים אפופטוטיים ב MCF7 ו SH-SY5Y תאים, המעידים על אינדוקציה אפופטוטיים (איור 2 א ', ב). טיפול TAM לבדו הניב מינימלית מורפולוגיה גרעינית אפופטוטיים ב MCF7 ו SH-SY5Y תאים, גרעינים גדולים, עגולים, ומוכתם במעומעם עם Hoechst להשוות את קבוצת הביקורת ממס (איור 2 א ', ב). בהסכם עם 4 וידאו, גרעינים של MCF7 ו SH-SY5Y תאים מוצגים עלייה ניכרת מורפולוגיה אפופטוטיים עם טיפול משולב לאחר 72 שעות (איור 2 א ', ב).
כדי לוודא אינדוקציה אפופטוטיים, תאים הוערכו על עמ 'החצנה hosphatidylserine, סמן אפופטוזיס, באמצעות assay Annexin V מחייב 17. תאים MCF7 ו SH-SY5Y טיפול 72 ו 48 שעות בהתאמה עם 1 מיקרומטר JCTH-4 לבד או ביחד עם TAM 10 מיקרומטר נמצאו חיוביות Annexin V מחייב, שמסומן על ידי פלואורסצנטי ירוק, המאשר אינדוקציה של אפופטוזיס (איור 3 א ', ב' ). החצנה לא ברור של Phosphatidylserine נצפתה MCF7 ו SH-SY5Y תאים שטופלו TAM לבד, כמו גם בתאים שטופלו NFF כל הקבוצות הנ"ל טיפולים לאחר 72 שעות (איור 3 ג). לכן, JCTH-4 לבד או ביחד עם TAM סלקטיבי גורם אפופטוזיס MCF7 ו SH-SY5Y תאים.
כדי לכמת את ההשפעה של JCTH-4 לבד או ביחד עם TAM, WST-1 assay colorimetric מבוסס על כדאיות התא, המשקפת את חילוף החומרים בתא פעיל, בוצעה על MCF7 ותאי NFF טיפול במשך 72 שעות ו SH-SY5Y תאים מטופלים במשך 48 שעות.לעומת קבוצות הביקורת ממס, 1 מיקרומטר JCTH-4 ירידה במטבוליזם התא הפעיל על ידי% מעל 50, בעוד 10 מיקרומטר TAM לבד הציג הבדל משמעותי הן MCF7 ו SH-SY5Y התאים (איור 4 א, ב). מעניין לציין כי ב MCF7 ו SH-SY5Y תאים, תוספת של TAM לפגיעה JCTH-4 לירידה סינרגיסטי בחילוף החומרים בתא. תאים NFF היו באופן דרסטי פחות רגישים גם-4 JCTH לבד JCTH-4 עם TAM (איור 4C). לפיכך, JCTH-4 מראה פעילות סינרגטית סלקטיבית עם TAM ב MCF7 ו SH-SY5Y תאים.
מיטוכונדריאלי הכוונת של JCTH-4
כדי לראות אם JCTH-4 הוא מיקוד המיטוכונדריה לגרום פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה אפופטוזיס בתאים שלמים הדור ROS במיטוכונדריה מבודד היה פיקוח. MCF7 התאים טופלו במשך 72 שעות ו מוכתם TMRM. 1 מיקרומטר JCTH-4 ירד MMP, שמסומן על ידי אובדן של אדום פלואורסצנטי (איור 5 א). עם זאת, עם הבנוסף הדואר של TAM 10 מיקרומטר, פיזור גדול יותר של MMP נצפתה, בעוד 10 TAM מיקרומטר בלבד לא הייתה השפעה ניכרת על MMP.
עם העלייה הדור ROS נקשרו כדי permeabilization קרום המיטוכונדריה ואינדוקציה אפופטוזיס, ייצור של ROS הוערך עם צבע Amplex האדום המיטוכונדריה מבודד SH-SY5Y תאים שטופלו 1 מיקרומטר JCTH-4 ו 10 TAM מיקרומטר, לבד או ביחד 18 -20. קריאות הקרינה באו לידי ביטוי גם יחידות הקרינה יחסית (RFU). עליות ROS הדור נצפו עם JCTH-4 תם בלבד (איור 5 ב '). מעניין לציין, כי הטיפול המשולב הניב עלייה גדולה בייצור ROS. Inducer ידוע של ייצור ROS במיטוכונדריה, PQ, נוצל כביקורת חיובית.
אינדוקציה של autophagy ידי JCTH-4 ו TAM
אינדוקציה Autophagic קשור לפגיעה כימותרפיות על ידי תרכובות שונות
במהלך autophagy, microtubule הקשורים 1 חלבון לאור שרשרת 3 (LC3) הנמצאים בדרך כלל cytosol (LC3-I), היא lipidated עם phosphatidylethanolamine ואת מקומי לאחר מכן את הקרומים autophagosomal (LC3-II) 2. כדי לוודא את הגיוס של autophagy, רמות LC3-II נבדקו ב MCF7 תאים שטופלו במשך 72 שעות באמצעות ניתוח כתם המערבי. 1 מיקרומטר JCTH-4 המושרה מעט את ההמרה של LC3-I ל-II LC3 תוך 10 מיקרומטר TAM המיוצר בתגובה autophagic יותר (איור6 ב). מעניין לציין, כי הטיפול המשולב הביא הגיוס הגדול ביותר של autophagy, מניב LC3-II יחס LC3, אני עולה על 3. על כן, תוצאות אלו מראות אינדוקציה autophagic ב MCF7 תאים על ידי JCTH-4 ו TAM לבד או ביחד, עם התגובה הגדולה ביותר בתאים עם טיפול משולב.
משלימה וידאו 1. מורפולוגיה נייד של MCF7 תאים שטופלו עם שליטה ממס. MCF7 התאים נוטרו בין 48 ו - 66 שעות שלאחר הטיפול השליטה ממס (DMSO) באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ עם תמונות בניגוד שלב. תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תמונות נתפסו בהגדלה 400x. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .
משלימה וידאו 2. אינדוקציה של מורפולוגיה הסלולר אפופטוטיים ב MCF7 תאים שטופלו JCTH-4. MCF7 התאים נוטרו בין 48 לבין 66 שעות טיפול שנינות בהודעהח 1 מיקרומטר JCTH-4 באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ עם תמונות בניגוד שלב. תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תמונות נתפסו בהגדלה 400x. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .
משלימה וידאו 3. אינדוקציה של מורפולוגיה הסלולר autophagic ב MCF7 תאים שטופלו TAM. MCF7 התאים נוטרו בין 48 לבין 66 שעות טיפול תגובה עם TAM 10 מיקרומטר באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ עם תמונות בניגוד שלב. תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תמונות נתפסו בהגדלה 400x. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .
משלימה וידאו 4. מורפולוגיה אפופטוטיים משופרת על ידי JCTH-4 עם TAM ב MCF7 תאים. MCF7 התאים נוטרו בין 48 ו - 66 שעות טיפול תגובה עם מיקרומטר 1 הן JCTH-4 ו 10 TAM מיקרומטר באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ עם שלב המשךRAST תמונות. תאים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תמונות נתפסו בהגדלה 400x. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .
באיור 1. השוואה מבנית של PST כדי אנלוגי 7-deoxy סינתטי. (א) המבנה הכימי של pancratistatin (PST). (ב) המבנה הכימי של JC-TH-acetate-4 (JCTH-4).
איור 2. JCTH-4 גורם מורפולוגיה אפופטוטיים הגרעין עם פעילות משופרת עם TAM. המורפולוגיה של הגרעין (א) MCF7 ו (ב) SH-SY5Y תאים מטופלים במשך 72 ו - 48 שעות בהתאמה עם ריכוזים המצוין של TAM ו JCTH-4 צבעונית עם Hoechst צבע. בקבוצת הביקורת טופלו ממס (ד 'MSO). התמונות צולמו בהגדלה 400x על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר.
איור 3. JCTH-4 גורם Phosphatidylserine החצנה לבד או ביחד עם TAM סלקטיבי בתאים סרטניים. Annexin V מחייב Phosphatidylserine מוחצן הוערך לאמת אינדוקציה אינדוקציה של אפופטוזיס (א) MCF7 (72 שעות), (ב) SH-SY5Y (48 שעות), ו (ג) NFF (72 שעות) תאים שטופלו JCTH-4 תם על ריכוזי הצביע. בקבוצת הביקורת טופלו ממס (DMSO). התמונות צולמו בהגדלה 400x על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר.
TAM איור 4. משפר את יכולת הקיום של ירידה JCTH-4 סלקטיבי בתאים סרטניים. לוחות 96-Wi גם היו seededה (א) MCF7, (ב) SH-SY5Y, ו (ג) תאים NFF ומטופל עם JCTH-4 ו TAM על ריכוזי הצביע. MCF7 ותאי NFF טופלו במשך 72 שעות ו - SH-SY5Y טופלו במשך 48 שעות. הודעה טיפול תרופתי ו הדגירה, WST-1 מגיב נוספה כל טוב, קריאות ספיגת צולמו 450 ננומטר מבוטא באחוזים מכלל שליטה (DMSO). סטטיסטיקה בוצעו באמצעות הגרסה GraphPad פריזמה 5.0. ערכים באים לידי ביטוי כמו ממוצע ± סטיית תקן של 3 מ quadruplicates ניסויים בלתי תלויים. MCF7: * p <.001, ** p <0.0001 מול הביקורת, # p <0.05 לעומת 1 מיקרומטר JCTH-4; † p <0.0001 לעומת 10 מיקרומטר TAM. SH-SY5Y: * p <0.0005 מול הביקורת, # p <0.005 לעומת 1 מיקרומטר JCTH-4; † p <0.005 לעומת 10 TAM מיקרומטר. NFF: * p <0.005 לעומת 10 TAM מיקרומטר + 1 מיקרומטר JCTH-4 ב MCF7 תאים; # p <0.01 לעומת 10 TAM מיקרומטר + 1 מיקרומטר JCTH-4 ב SH-SY5Y תאים.
איור 5. JCTH-4 ולפעול TAM על המיטוכונדריה. (א) MCF7 התאים גדלו ב coverslips ומטופל עם ריכוזים המצוין של תרופות במשך 72 שעות ו מוכתם TMRM להעריך MMP. התאים של קבוצת הביקורת טופלו ממס (DMSO). תמונות נתפסו בהגדלה 400x על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. (ב) מבודדים המיטוכונדריה מ SH-SY5Y התאים טופלו JCTH-4 ו TAM על ריכוזי הצביע ייצור ROS הוערך עם המצע Amplex האדום נוכחות של peroxidase חזרת (HRP). קבוצת התאים שליטה טופלו ממס (DMSO). Paraquat (PQ) נעשה שימוש בריכוז של 250 מיקרומטר כביקורת חיובית. קריאות הקרינה התקבלו לאחר 2 שעות של טיפול אקס. 560 ננומטר ו אם. 590 ננומטר ו לידי ביטוי fluorescenc יחסיתיחידות דואר (RFU). סטטיסטיקה התקבלו באמצעות הגרסה GraphPad פריזמה 5.0. הנתונים הוא נציג של 3 ניסויים בלתי תלויים עם מגמות דומות. ערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן של quadruplicates של ניסוי 1 עצמאי. * P <0.05, ** p <0.005, *** p <0.001 לעומת שליטה; # p <0.05 לעומת 1 מיקרומטר JCTH-4; † p <0.05 לעומת TAM 10 מיקרומטר; @ p <0.05 לעומת 250 מיקרומטר PQ.
איור 6. TAM משפר אינדוקציה autophagic של JCTH-4. (א) MCF7 התאים גדלו ב coverslips ו נתון עלבון JCTH-4 ו TAM על ריכוזי הצביע עבור 72 שעות. בקבוצה תאים שליטה טופלו ממס (DMSO). נושא הטיפול, MCF7 תאים הוכתמו MDC לזהות vacuoles autophagic. תמונות נתפסו בהגדלה 400x על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר (.ב) ניתוח המערב למחוק בוצעו LC3 ו β-אקטין על lysates התא של MCF7 תאים שטופלו בריכוזים המצוין של תרופות במשך 72 שעות. ניתוחים Densitometric הוצאו להורג באמצעות תוכנת ImageJ. סטטיסטיקה בוצעו באמצעות הגרסה GraphPad פריזמה 5.0. ערכים באים לידי ביטוי כמו ממוצע ± SD. * P <0.05, ** p <0.005, *** p <0.0005 מול הביקורת, # p <0.001 לעומת 1 מיקרומטר JCTH-4; † p <0.001 לעומת 10 TAM מיקרומטר.
רשימת קיצורים.
| ER | קולטן אסטרוגן |
| FMN | פלבין mononucleotide |
| JCTH-4 | JC-TH-acetate-4 |
| LC3 | microtubule הקשורים 1 חלבון לאור שרשרת 3 |
| MDC | monodansylcadaverine |
| MMP | mitochondrקרום ial פוטנציאל |
| MRC | שרשרת הנשימה במיטוכונדריה |
| NFF | רגיל פיברובלסטים העובר האנושי |
| PQ | paraquat |
| PST | pancratistatin |
| RFU | יחידות הקרינה יחסית |
| ROS | מינים חמצן תגובתי |
| TAM | טמוקסיפן |
| TMRM | tetramethylrhodamine מתיל אסטר |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תרכובות PST ו דומה הוכחו יש תכונות נוגדות סרטן 11-15,21. דיווחנו בעבר PST טבעי לערער את המיטוכונדריה בתאים סרטניים באופן סלקטיבי, אשר ובכך גורם אפופטוזיס על ידי שחרורו של גורמים apoptogenic 12,14. סביר להניח כי JCTH-4 פועלת באמצעות אותו מנגנון, JCTH-4 איור גרם לקריסת MMP ב MCF7 תאים כפי שהם נראים עם כתמים TMRM (איור 5 א), והגדילה את הדור של ROS במיטוכונדריה מבודד SH-SY5Y תאים ( 5 ב '), מעידים על תפקוד המיטוכונדריה. לכן, אינדוקציה של אפופטוזיס על ידי JCTH-4 הוא ככל הנראה באמצעות מיקוד המיטוכונדריה בתאים סרטניים.
הבדלים רבים קיימים בין תאים סרטניים וסרטן שיכולים לשמש כבסיס סלקטיביות סרטן ידי JCTH-4. תאים סרטניים הם תלויים במידה רבה על הגליקוליזה ופחות על המיטוכונדריה לצורך ייצור אנרגיה, תופעה זו מכונהשל השפעה ורבורג 22. פעילות מטבולית כגון בתאי סרטן מוביל חומציות גבוהה cytosol. כתוצאה מכך, הסביבה cytosolic חומצי תורם תאים סרטניים hyperpolarization המיטוכונדריה אשר נקשר ליכולת משופרת לפלוש להתחמק אפופטוזיס 23. Hyperpolariztion של תאים סרטניים המיטוכונדריה עם זאת, עלול להפוך תאים סרטניים פגיעים JCTH-4, נלקח פעם אחת לתוך התא, JCTH-4 יוכל לרכוש מטען חיובי באמצעות עיבוד אנזימטי ועשוי להילקח באופן סלקטיבי לתוך תאים סרטניים המיטוכונדריה בשל אופי hyperpolarized שלהם. יתר על כן, מערך של חלבונים במיטוכונדריה antiapoptotic הקשורים הוכחו לידי ביטוי במיוחד בתאי סרטן האוסרים permeabilization קרום המיטוכונדריה וביצוע הבאות של אפופטוזיס כגון חלבונים antiapoptotic משפחת Bcl-2 של חלבונים 24-26.
בנוכחות של צורות שונות של מתח הסלולר, autophagy מופעלת כמובתגובה הפרו הישרדות, מה שמאפשר לתאים לשרוד בתנאים גרועים 2. על גירוי של מסלול זה לעומת זאת, יכול להוביל להתמוטטות נרחב של מרכיבים תאיים חיוניים והוליד 3 תאים autophagic מוות. שניהם הישרדות Pro-Pro-ומוות תגובות autophagic נקשרו כדי עלבון כימותרפיות 3. תפקוד המיטוכונדריה ידי JCTH-4 המוביל סטרס חמצוני יכול לעורר תגובה מחדל אוטומטית autophagic. ועוד איך יש לנו להתבונן כמה אינדוקציה autophagic יחד עם אפופטוזיס בטיפול JCTH-4 (איור 2 א ', ב' 3 א ', ב' 6 א, ב). למרות TAM הוקם גם יריבו ER בחדר מיון תאים סרטניים חיוביות השד, הוכח לאחרונה לתקשר עם המיטוכונדריה, מחייבת לאתר FMN אני קומפלקס של 10. יתר על כן, TAM היא inducer ידועה autophagy פני תאים רבים בסוגי סרטן 3. אכן, TAM לא לגרום לעלייה הדור ROS ב mitoch מבודדondria (איור 5 ב '). עם זאת, אינטראקציה זו הוכיח את עצמו מספיק כדי לגרום לקריסת MMP (איור 5 א), אבל מספיק כדי לגרום תגובה טיפוסית הפרו הישרדות autophagic. אינדוקציה autophagic נרחב נצפתה כאשר JCTH-4 ו TAM השתמשו בשילוב (איור 6 א, ב), אשר לוותה בתגובה ציטוטוקסיות משופרת (איור 4 א, ב), מרמז על התגובה מוות בעד autophagic, אף על פי כן, התאים הסרטניים מתים בסופו של דבר מן אפופטוזיס כתוצאה permeabilization המיטוכונדריה ושחרור גורם apoptogenic. רגישות כזו על ידי TAM לפגיעה JCTH-4 ניתן לייחס לגידול דור ROS תם. כי הן TAM ו JCTH-4 מסוגלים לייצר סטרס חמצוני, ייצור קומבינטורית של לחץ כזה עם שתי תרכובות עלול להוביל אינדוקציה autophagic רב והוליד בתגובה autophagic מזיק ו / או permeabilization המיטוכונדריה נרחב אפופטוזיס לאחר מכן. הטיפול משולב אינו משפיע על יכולת הקיום של fibroblasts סרטני 4C (איור). ממצאים אלה מצביעים על כך JCTH-4 לבד או ביחד עם TAM ניתן להשתמש באופן יעיל לטיפול בסרטן השד neuroblastoma מבלי לגרום השפעות שליליות על תאים סרטניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אבירי קולומבוס פרק 9671 (וינדזור, אונטריו), ו פרדריק בנטינג וצ'רלס CIHR הטוב ביותר בקנדה מלגת בוגר הוענק דניס אמא. תודה הודג' רוברט ואליזבת Fidalgo דה סילבה על עזרתם עם מיקרוסקופיה זמן לשגות. תודה קייטי Facecchia לעריכה על צילום בהילוך מהיר מיקרוסקופית. אנו רוצים גם להודות Sudipa יוני צ'אטרג'י ופיליפ Tremblay לבדיקה ביקורתית של כתב היד הזה. עבודה זו מוקדשת לזכרו של קווין Couvillon שאיבד את הקרב שלו נגד סרטן בשנת 2010.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 | |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30022.01 | |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 | |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corp. | P35G-014-C | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| H–chst 33342 dye | Molecular Probes, Life Technologies | H3570 | |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| WST-1 reagent | Roche Group | 11644807001 | |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer, Inc. | 1420-011 | |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | GIBCO, by Life Technologies | T-668 | |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 | |
| BioRad protein assay | Bio-Rad | 500-0001Bottom of Form | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 | |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 | |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 | |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 | |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
References
- Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
- Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
- Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
- Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
- Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J.
- Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
- Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
- Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
- McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
- Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
- Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
- Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
- Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
- Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
- Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
- Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. an, Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
- Warburg, O.
- Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
- Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).
