Summary
Hemos sintetizado un análogo de la novela de pancratistatin comparables con actividad anti-cáncer como pancratistatin nativa, curiosamente, el tratamiento combinatorio con el tamoxifeno produjo una mejora drástica en la inducción de la apoptosis y la autofagia en las mitocondrias con un efecto mínimo sobre los fibroblastos no cancerosas. Por lo tanto, JCTH-4 en combinación con el tamoxifeno podría proporcionar un seguro anti-terapia contra el cáncer.
Abstract
El cáncer de mama es uno de los cánceres más comunes entre las mujeres en América del Norte. Muchos de los actuales tratamientos contra el cáncer, incluyendo la radiación ionizante, inducir la apoptosis a través de daños en el ADN. Desafortunadamente, estos tratamientos no son selectivos para las células cancerosas y producir toxicidad similar en células normales. Nos han informado de la inducción selectiva de apoptosis en las células cancerosas por el pancratistatin compuesto natural (PST). Recientemente, un nuevo análogo de PST, un derivado C-1 de 7-acetoximetil deoxypancratistatin (JCTH-4), fue producido por la síntesis de novo y exhibe comparables actividad selectiva inductor de apoptosis en varias líneas celulares de cáncer. Recientemente, la autofagia se ha implicado en enfermedades malignas como tanto pro-supervivencia y pro-muerte mecanismos en respuesta a la quimioterapia. El tamoxifeno (TAM) invariablemente ha demostrado la inducción de pro-supervivencia autofagia en numerosos tipos de cáncer. En este estudio, la eficacia de JCTH-4 solos y en combinación con TAM para inducir la muerte celular en cancia de mama humanor (MCF7) y neuroblastoma (SH-SY5Y), las células se evaluó. TAM sola indujo la autofagia, pero la muerte celular insignificante, mientras que JCTH-4 solo causó la inducción de la apoptosis significativa con un poco de la inducción de la autofagia. Curiosamente, el tratamiento combinatorio producido un aumento drástico en la inducción de la apoptosis y la autofagia. Estamos supervisados dependientes del tiempo los cambios morfológicos en las células MCF7 sometidos a TAM inducida por la autofagia, las JCTH-4-inducida por la apoptosis y la autofagia, y la muerte acelerada de las células con el tratamiento combinatorio utilizando time-lapse microscopía. Hemos demostrado que estos compuestos para inducir la apoptosis / autofagia mediante la focalización mitocondrial en las células cancerosas. Es importante destacar que estos tratamientos no afectó la supervivencia de fibroblastos humanos no cancerosas. Por lo tanto, estos resultados indican que JCTH-4 en combinación con TAM podría ser utilizado como una caja fuerte y muy potentes contra el cáncer terapia contra el cáncer de mama y de células de neuroblastoma.
Protocol
Introducción
La apoptosis, o de tipo I la muerte celular programada, es un proceso fisiológico que puede funcionar extrínsecamente, a través de la unión de un ligando de muerte a un receptor de muerte, o intrínsecamente. La vía intrínseca de apoptosis se inicia por el estrés intracelular, como el daño del ADN y la disfunción mitocondrial, lo que en última instancia conduce a la permeabilización de la disipación de las mitocondrias, de potencial de membrana mitocondrial (PMM), la liberación de factores apoptogénicos desde el espacio intermembrana mitocondrial, y posterior ejecución de la apoptosis 1.
La autofagia es un proceso en el cual una célula se rompe, se degrada y recicla sus componentes intracelulares propios, manteniendo la integridad de la membrana plasmática, sino que está provocada por diferentes tipos de estrés celular, como el estrés oxidativo, la hipoxia, los agregados de proteínas, la privación de nutrientes, la privación del factor de crecimiento, y orgánulos dañados 2. En las etapas inicialesde este proceso, el material citosólico es engullida por autofagosomas, las vesículas de doble membrana, que se fusionan con los lisosomas para formar los autolisosomas. Publicar la fusión lisosomal, materiales citosólicas tomadas previamente por autofagosomas son degradados por las enzimas lisosomales 2. Activación extensiva de esta vía produce la degradación extensiva de los componentes intracelulares que pueden conducir a la muerte celular por autofagia o tipo II muerte celular programada 3.
La evasión de la muerte celular ha sido considerada como una de las características del cáncer 4. El cáncer es una enfermedad caracterizada por un crecimiento celular descontrolado y la proliferación 5. En particular, el neuroblastoma se plantea el desarrollo de las células nerviosas del sistema nervioso simpático de la cresta neural 6. Es el tumor sólido más común que se presenta en niños pequeños, lo que representa aproximadamente el 9% de los cánceres infantiles 7. Aunque mucho progreso se ha hecho hasta la fecha, esta enfermedad sigue siendo un problematanto a los científicos ya los médicos. Por otro lado, el cáncer de mama es el cáncer más común entre las mujeres 8. El tamoxifeno (TAM) se ha utilizado frecuentemente para el tratamiento de los cánceres de mama sensibles a las hormonas, como un receptor de estrógeno (ER), antagonista de los 9. Sin embargo, otros informes proporcionan pruebas adicionales de los mecanismos independientes de la inducción de apoptosis por parte de TAM. En particular, TAM interactúa con el Complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial (CRM) en su flavin mononucleótido (FMN) el sitio 10.
PST es un compuesto natural aislado de la planta de Hymenocallis littoralis. Contrastando de muchos agentes quimioterapéuticos actualmente en uso, se ha demostrado que induce la apoptosis, en una forma no genotóxico, selectivamente en diferentes tipos celulares de cáncer a través mitocondrial orientación 11-15. Sin embargo, el trabajo preclínico y clínico se ha visto obstaculizado por su disponibilidad, sino que está presente en cantidades muy bajas en su fuente natural y la complicidad que muchosciones carga de su síntesis química. Se han sintetizado y se tamiza análogos sintéticos de 7-deoxypancratistatin y similares observó actividad anti-cáncer en un derivado C-1 acetoximetilo, JC-TH-acetato-4 (JCTH-4) 16. Ahora tenemos en la mano de un análogo sintético PST con una potente actividad anti-cáncer. Su síntesis se ha normalizado y se puede escalar para producir cantidades suficientes para el trabajo preclínico y clínico. Desde PST natural y TAM, tanto el objetivo de la mitocondria, sería interesante investigar el efecto combinado de un análogo sintético de PST en el cáncer de mama humano y células de neuroblastoma en combinación con la TAM.
Aquí, se presenta citotoxicidad selectiva de JCTH-4 en el neuroblastoma humano (SH-SY5Y) y el adenocarcinoma de mama (MCF7) de las células. JCTH-4 era capaz de inducir la apoptosis en ambas líneas celulares por parte de la orientación mitocondrial; JCTH-4 provocó la disipación de MMP y un aumento de especies reactivas del oxígeno (ROS) en el aislado mitochondria partir de estas células cancerosas. Además, la autofagia fue inducida por JCTH-4 en células MCF7. Interesantemente, la adición de TAM al JCTH-4 insulto mejorado los efectos antes mencionados de JCTH-4 en SH-SY5Y y las células MCF7. Los cambios morfológicos inducidos por JCTH-4 y TAM solos y en combinación en las células MCF7 fueron controlados a través de microscopía de lapso de tiempo de contraste de fase o imágenes brillantes sobre el terreno. Fibroblastos humanos normales fetales (NFF) exhibió una marcada disminución de la sensibilidad a JCTH-4 tanto solas como en combinación con TAM. Por lo tanto, estas observaciones sugieren JCTH-4, solo y con TAM, que es un agente quimioterapéutico segura y eficaz contra el cáncer de mama y el neuroblastoma.
Materiales y Métodos
1. Cultivo Celular
- Crecer y cultura SH-SY5Y células de neuroblastoma humano (ATCC, cat. N º CRL-2266, Manassas, VA, EE.UU.) con Dulbecco modificado del medio Eagles F-12 de Ham (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canadá), suplementado con 2 mM L-glutaminaE, 10% de suero fetal bovino (FBS) y 10 mg / ml de gentamicina (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canadá). Mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Crecer y la cultura MCF7 células humanas de adenocarcinoma de mama (ATCC, cat. N º HTB-22, Manassas, VA, EE.UU.) en medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Canadá, Mississauga, ON, Canadá), suplementado con FBS al 10% estándar (Thermo Científico, Waltham, MA) y 10 mg / ml de gentamicina (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canadá). Mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Crecer y la cultura de la apariencia normal de fibroblastos fetales humanos (NFF) línea celular (Instituto Coriell para la Investigación Médica, cat. N º AG04431B, Camden, NJ, EE.UU.) en la Dulbecco modificado de Eagle, la glucosa alta (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU. ) suplementado con FBS al 15% y 10 mg / ml de gentamicina (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canadá). Mantener las células a 37 ° C y 5% de CO 2.
2. Preparación de Drogas
- Pesar el tamoxifeno (TAM) citrato de sal (Sigma-Aldrich, cat. N º T9262, Mississauga, ON, Canadá) y se disuelven en DMSO para preparar una solución de 10 mM. Tienda solución madre a -20 ° C hasta su uso. Todos los controles del vehículo utilizado en este estudio contenía DMSO a menos de 0,5%.
- Repetir el paso 2,1 para preparar una solución madre 1 mM disuelto en DMSO de-JC-TH-acetato de 4 (JCTH-4), producido por síntesis quimioenzimática de bromobenceno como se ha descrito previamente 16. Tienda solución madre a -20 ° C hasta su uso. Todos los controles del vehículo utilizado en este estudio contenía DMSO a menos de 0,5%.
3. Time-Lapse Microscopía
- Placa de aproximadamente 2,0 x 10 5 células MCF7 en placas de 35 mm de vidrio cultivo de fondo (MatTek Corporation, cat. N º P35G-014-C, Ashland, MA, EE.UU.) en condiciones estériles de un gabinete de bioseguridad clase II y les permita crecer a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Cuando las células alcanzan 60 a 70% de confluencia, los tratan con 1 mM JCTH-4 con un 1 mMSolución madre disolvió en DMSO y 10 mM de TAM utilizando una solución madre 10 mM disuelto en DMSO, solos y en combinación en una clase II bioseguridad armario.
- Después del tratamiento de las células durante 48 horas, las células en una cámara climatizada a 37 ° C con 5% de CO 2 en un escenario de un microscopio de fluorescencia Leica DMI6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).
- Usando LAS AF6000 software, configurar el microscopio de contraste de fases para tomar o micrografías de campo claro con un aumento de 400x cada 5 minutos durante 18 horas.
4. La tinción nuclear
- Placa de aproximadamente 2,0 x 10 5 MCF7 o células SH-SY5Y en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 inferior a suficiente distancia del tejido en un gabinete de bioseguridad clase II y les permita crecer a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Cuando las células alcanzan desde 60 hasta 70% de confluencia, los tratan con 1 mM JCTH-4 utilizando una solución madre 1 mM disuelto en DMSO y 10 mM de TAM utilizando una solución madre 10 mM disuelto en DMSO, tantosolos y en combinación en una clase II bioseguridad armario.
- Se incuban las células con los tratamientos antes mencionados a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 48 horas (SH-SY5Y células) o 72 horas (las células MCF7).
- Después del tratamiento y la incubación de células con las drogas, directa agregar colorante Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) a los medios de comunicación de las células tratadas a una concentración final de 10 mM para teñir los núcleos.
- Se incuban las células con el colorante Hoechst durante 5 a 10 minutos protegidas de la luz.
- Colocar la placa en el escenario de un microscopio Leica DM IRB invertido de fluorescencia (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).
- Tome micrografías fluorescentes y la fase de la ampliación de 400X.
5. Anexina V Ensayo de unión
- Placa de aproximadamente 5,0 x 10 5 MCF7, SH-SY5Y, o células NFF en placas de 10 ml de cultivo de tejido en una clase II gabinete de bioseguridad y les permita crecer a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Wcélulas de gallina alcanzar 60 a 70% de confluencia, los tratan con 1 mM JCTH-4 utilizando una solución madre 1 mM disuelto en DMSO y 10 mM de TAM utilizando una solución 10 mM de stock disolvió en DMSO, tanto solos como en combinación en un bioseguridad clase II gabinete.
- Se incuban las células con los tratamientos antes mencionados a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 48 horas (SH-SY5Y células) o 72 horas (MCF7 y células NFF).
- Preparar Anexina V tampón de unión en ddH 2 O con HEPES 10 mM, 10 mM de NaOH, 140 mM de NaCl y 1 mM de CaCl 2 a pH 7,6 y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
- Después del tratamiento y la incubación de células con las drogas, retire el soporte de las placas que contienen células en suspensión y colocarlo en un tubo de 15 ml por separado cónica para cada grupo de tratamiento diferentes etiquetados con el tratamiento adecuado.
- Separe las células adherentes de las placas utilizando tripsina.
- Después las células despegadas de la placa como un resultado de la tripsina, aspirar los medios colocados en la cónica 15 mltubo en el paso al 5.4 y volver a meterla en sus placas originales con las células en suspensión de tripsina.
- Con la pipeta de llenado electrónico y pipetas serológicas, mezcle los medios de comunicación con la solución de células tripsina y colocar esta mezcla de nuevo en los correspondientes tubos cónicos de 15 ml.
- Centrifugar las células a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C, separar el sobrenadante de cada tubo, y volver a suspender las células en PBS.
- Centrifugar las células a 600 xg durante 5 minutos, separar el sobrenadante de cada tubo, y Resuspender las células en tubos de microcentrífuga etiquetados con aproximadamente 50 a 70 l de tampón de Anexina V unión.
- Añadir Anexina V AlexaFluor-488 (01:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canadá) y el colorante Hoechst a una concentración final de 10 mM y se incuba durante 15 minutos protegido de la luz.
- Después de la incubación, vórtice uno de los tubos de microcentrífuga, añadir 7 a 10 l de la mezcla de células a un portaobjetos de microscopio, colocar un cubreobjetos overtop de la mezcla de células en el microscópicasdiapositivas e y tomar micrografías fluorescentes, tanto Anexina V y Hoechst imágenes para cada punto de vista, a 400 aumentos en un IRB Leica DM invertido microscopio de fluorescencia (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Repetir para cada muestra experimental en cada uno de los tubos de microfuga restantes.
6. De agua salada tetrazolio soluble (WST-1) Ensayo para la viabilidad celular
- Trypsinize un confluente T75 frasco o 10 cm de tejido de la placa de cultivo MCF7, SH-SY5Y, o células NFF en un gabinete de bioseguridad clase II.
- Después las células se han levantado, añadir 5 a 10 ml de medios de comunicación para la tripsina y colocar la suspensión de células de medios en un tubo cónico de 15 ml.
- Centrifugar las células a 600 xg durante 5 minutos, colocar el tubo de nuevo en la cabina de bioseguridad, separar el sobrenadante de cada tubo y se resuspenden las células en aproximadamente 1 a 3 ml de medio, dependiendo del tamaño sedimento celular.
- Colocar 10 l de la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga, añadir 10 l de colorante azul de tripano (SIGMA-Aldrich, Mississauga, ON, Canadá), y mezclar con una micropipeta.
- Cargar 10 l de Trypan Blue células suspendidas en un hemocitómetro (Hausser Scientific, EE.UU.), contar las células, y calcular la concentración de células de la suspensión de células en el original 15 ml tubo cónico.
- Utilice esta concentración para determinar el volumen de la suspensión celular inicial necesaria para crear suspensiones diluidas de células con concentraciones de 1,5 x 10 5 células / ml para MCF7 y SH-SY5Y y 5,0 x 10 4 para las células NFF necesarios para chapado.
- Utilizar las suspensiones de células diluidas a la placa 15 x 10 3 MCF7 o células SH-SY5Y / pocillo o 5,0 x 10 3 células NFF / bien mediante la adición de 100 l de las suspensiones de células diluidas a cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos fondo claro tejido. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante la noche.
- Tratar las células con 1 mM JCTH-4 y 10 mM de TAM, solos y en combinación en un gabinete de bioseguridad clase II de 72 horass de MCF7 y células NFF, y durante 48 horas para SH-SY5Y células.
- Después del tratamiento y la incubación de los medicamentos, se añaden 10 l de reactivo WST-1 (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU.) a cada pocillo e incubar la placa durante 4 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Tome las lecturas de absorbancia a 450 nm en un Wallac Victor 3 Contador 1420 Multilabel (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canadá) y expresarlos en forma de porcentajes de los grupos de control con disolvente.
7. Tetramethylrhodamine metil éster (TMRM) tinción
- Colocar un cubreobjetos en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 fondo bien claro tejido y la placa de las células MCF7 en cada pocillo de una placa de 6 de cultivo de tejidos en un armario de clase II bioseguridad. Les permiten crecer a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Cuando las células alcanzan desde 60 hasta 70% de confluencia, los tratan con 1 mM JCTH-4 utilizando una solución madre 1 mM disuelto en DMSO y 10 mM de TAM utilizando una solución madre 10 mM disuelto en DMSO,tanto sola como en combinación en un gabinete de bioseguridad clase II.
- Se incuban las células con los tratamientos antes mencionados a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 72 horas.
- Después del tratamiento y la incubación de células con las drogas, directa agregar colorante Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) a los medios de comunicación de las células tratadas a una concentración final de 10 mM para teñir los núcleos, así como tetrametilrodamina metil éster (TMRM ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canadá) a una concentración final de 200 nM.
- Se incuban las células con los colorantes en 5% de CO 2 y 37 ° C durante 45 minutos protegidas de la luz.
- Pipeta 8 l de medios o PBS en un portaobjetos de microscopio y tomar un cubreobjetos de la placa de 6 pocillos y lo coloca en la parte superior de los medios o PBS sobre el portaobjetos de microscopio con las células que se enfrentan hacia abajo con pinzas.
- Tome micrografías fluorescentes, tanto Hoechst y micrografías TMRM para cada punto de vista, con un IRB invierte Leica DM microscopio de fluorescencia (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) con un aumento de 400x.
8. Aislamiento mitocondrial
- Preparar aproximadamente 10 ml de tampón hipotónico (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 210 mM de manitol, 70 mM de sacarosa, 10 mM-Leu-PEP, 10 mM Pep-A, y 100 mM PMSF) y tampón de reacción y mantener las dos soluciones en hielo.
- Con unos 8 a 10 confluentes T75 matraces de cultivo de tejidos de células SH-SY5Y, trypsinize las células, agregar medios para neutralizar la tripsina, recoger las suspensiones de células en tubos cónicos de 50 ml, y los tubos de centrifugar a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C.
- Retire los gránulos de las células sobrenadante y resuspender en 10 a 20 ml de PBS frío, centrifugar los tubos a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C, y repetir este proceso de lavado una vez.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en tampón hipotónico frío. Homogeneizar células manualmente con un triturador de tejidos de vidrio y centrifugar el lisado de células a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C.
9. Amplex Roja Ensayo
- Después de aislar las mitocondrias de las células, estimar la concentración de proteína de la muestra de mitocondrias aisladas utilizando una curva estándar de concentraciones conocidas de 1mg/mL BSA (albúmina de suero bovino) con el ensayo de proteína BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) .
- Uso de la concentración estimada de proteína de la solución de mitocondrias aisladas, calcular el volumen de esta solución para dar 20 g de proteína. Pipetear este volumen en cada pocillo de una opaca 96-pocillos para cargar 20 g de proteína / pocillo.
- Llenar cada pocillo de la placa a un volumen total de 100 l con tampón de reacción, el tratamiento farmacológico (con una concentración final de 1 mM JCTH-4, y / o 10 mM de TAM, o 250 mM de PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON , CAnada) utilizado como control positivo), reactivo Amplex Roja a una concentración final de 50 mM, y peroxidasa de rábano (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canadá) en la proporción de 6 U/200 l.
- Después de una incubación de 2 horas, tomar las lecturas de fluorescencia en el ex. 560 nm y EM. 590 nm en un espectrofluorómetro (SpectraMax XPS Géminis, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.).
10. Preparación de lisado celular
- Crecer las células MCF7 de 60 a 70% de confluencia en placas de cultivo de 10 cm de tejido.
- Tratar las células con 1 mM JCTH-4 y 10 mM de TAM solos y en combinación durante 72 horas con aproximadamente 10 a 15 placas por grupo de tratamiento.
- Preparar tampón de lisis celular (10 mM Tris-HCl a pH 7,2, KCl 5 mM, 1 mM de MgCl 2, EGTA 1 mM, 1% de Triton-X-100; 10 mM-Leu-PEP, 10 mM Pep-A, y 100 mM PMSF ) y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
- Mecánicamente desalojar las células de las superficies de la placa con un rascador de células y recoger las células en 50 marcadoml tubos cónicos.
- Centrifugar los tubos a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C, retirar los sedimentos celulares sobrenadante y resuspender en aproximadamente 10 a 20 ml de PBS frío, centrifugar los tubos a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C, y repetir este proceso de lavado una vez.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en tampón frío lisis celular. Homogeneizar células manualmente con un triturador de tejidos de vidrio y centrifugar el lisado de células a 600 xg durante 5 minutos a 4 ° C.
- Desechar los gránulos y almacenar los lisados celulares a -20 ° C hasta su uso.
11. Los análisis de Western Blot
- Determinar la concentración de proteína de lisados celulares utilizando el ensayo de proteína BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). Someter a las muestras de proteínas a SDS-PAGE y la proteína de transferencia a una membrana de nitrocelulosa.
- Después de la transferencia, las membranas de bloque con un 5% w / v leche TBST (Tris-solución salina tamponada con Tween-20) solución durante 1 hora.
- Las membranas de la sonda con una hormigai-LC3 anticuerpo producido en conejo (1:500) (Novus Productos Biológicos, cat. N º NB100-2220, Littleton, CO, EE.UU.), o un anticuerpo anti-β-actina se crió en el ratón (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., cat. N º SC-81178, de Paso Robles, CA, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C.
- Sujeto a las membranas de una de 15 minutos y dos lavados de 5 minutos en TBST y se incuba con un ratón anti-(1:2000) o un conejo anti-(1:2000) peroxidasa de rábano conjugada secundaria de anticuerpos (Abcam, cat. N º ab6728 y ab6802, Cambridge, MA, EE.UU.) durante 1 hora a 4 ° C.
- Sujeto a las membranas de tres lavados consecutivos de 5 minutos en TBST y visualizar las bandas de proteínas con el reactivo de quimioluminiscencia (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Canadá).
- Realizaron análisis de densitometría utilizando el software ImageJ.
12. Monodansylcadaverine (MDC) de tinción
- Colocar un cubreobjetos en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 fondo bien claro tejido y la placa de las células MCF7 en cada pocillo de un 6y tejido transparente inferior cultivo en placa en un gabinete de bioseguridad clase II. Les permiten crecer a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Cuando las células alcanzan desde 60 hasta 70% de confluencia, los tratan con 1 mM JCTH-4 utilizando una solución madre 1 mM disuelto en DMSO y 10 mM de TAM utilizando una solución 10 mM de stock disolvió en DMSO, tanto solos como en combinación en un bioseguridad clase II gabinete.
- Se incuban las células con los tratamientos antes mencionados a 37 ° C y 5% de CO 2 durante 72 horas.
- Después del tratamiento y la incubación de células con fármacos, directamente añadir Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Canadá) a una concentración final de 0,1 mM a cada pocillo durante 15 min.
- Se incuban las células con el colorante a 5% de CO 2 y 37 ° C durante 15 minutos protegidas de la luz.
- Pipetear 30 l de los medios de comunicación o PBS en un portaobjetos de microscopio y tomar un cubreobjetos de la placa de 6 pocillos y colocarlo en la parte superior de los medios de comunicación o de PBS sobre el portaobjetos con células de la FACIng abajo con unas pinzas.
- Tome fluorescentes MDC y micrografías de fase, para cada punto de vista, con una Leica DM IRB invierte microscopio de fluorescencia (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) con un aumento de 400x.
13. Los resultados representativos
La inducción selectiva de apoptosis en adenocarcinoma de mama humano y células de neuroblastoma por JCTH-4: mejora de la actividad por TAM
La inducción de la apoptosis selectiva se muestra en varias células de cáncer por desastres naturales PST (Fig. 1a) 11-13. Debido a la escasa disponibilidad de los archivos PST, se han sintetizado análogos de 7-deoxypancratistatin (JCTH-4, fig. 1b) y sometidos a tamizaje para semejante actividad anti-cáncer en el adenocarcinoma de mama humano (MCF7) y células de neuroblastoma (SH-SY5Y). En la primera fase de los experimentos, hemos querido para monitorear los cambios morfológicos en el tiempo después del tratamiento con JCTH-4 y TAM solo y en combinación en MCF7 célulass. MCF7 células fueron controlados durante 18 horas, como se ve en vídeo 1 producido por microscopía de lapso de tiempo con imágenes de contraste de fase, con tratamiento con disolvente (control) durante 48 horas; estas células no mostraron cambios importantes en la morfología. Por el contrario, después de 48 horas de 1 mM JCTH-4 del tratamiento, estas células mostraron cambios morfológicos asociados con la apoptosis, como la contracción, blebbing, la formación de cuerpos apoptóticos como se ve en el vídeo 2. Por otro lado, el tratamiento de TAM solo en las células MCF7 producido una morfología muy distinta incluyendo inclusiones puntiformes indicativos de autofagosomas asociados con la autofagia (vídeo 3). Morfología apoptótica muy mínimo se observó y células generalmente exhiben morfología saludable comparable a la de control de disolvente tratado células MCF7. Curiosamente, en la presencia de TAM, la inducción apoptótica por JCTH-4 se ha mejorado drásticamente como se indica por el aumento morfología apoptótica en células MCF7 después de 48 horas como illustrated en el vídeo 4.
En la segunda fase de experimentos se utilizó tintes fluorescentes para evaluar la inducción de la apoptosis. Después de 72 horas y 48 horas de 1 mM JCTH-4 tratamiento en MCF7 y células SH-SY5Y respectivamente, Hoechst tinte y se utilizó para controlar la morfología nuclear. Los resultados indicaron que los núcleos de condensación, brillantemente teñido acompañado de cuerpos apoptóticos en MCF7 y SH-SY5Y células, indicativos de la inducción de apoptosis (Fig. 2a, b). Tratamiento de TAM solo han mostrado un mínimo de morfología nuclear apoptótica en células MCF7 y SH-SY5Y, los núcleos son grandes, redondos, y se tiñen débilmente con el grupo de control comparable al disolvente (Fig. 2a, b) Hoechst. De acuerdo con Video 4, los núcleos de las células MCF7 y SH-SY5Y muestran un marcado incremento en la morfología apoptótica con la combinación de tratamiento después de 72 horas (Fig. 2a, b).
Para verificar la inducción de apoptosis, las células fueron evaluados para pexternalización hosphatidylserine, un marcador de apoptosis, a través de un ensayo de Anexina V vinculante 17. Células MCF7 y SH-SY5Y tratadas durante 72 y 48 horas respectivamente con 1 mM JCTH-4 solos y en combinación con TAM mM 10 fueron positivas para Anexina V vinculante, indicado por la fluorescencia verde, lo que confirma la inducción de la apoptosis (Fig. 3a, b ). N externalización evidente de fosfatidilserina se observó en MCF7 y SH-SY5Y células tratadas con TAM solo, así como en las células NFF tratados con todos los grupos antes mencionados tratamientos después de 72 horas (Fig. 3c). Por lo tanto, JCTH-4 solo y en combinación con TAM selectiva induce la apoptosis en las células MCF7 y SH-SY5Y.
Para cuantificar el efecto de JCTH-4 solos y en combinación con TAM, un WST-1 tratado ensayo basado colorimétrico para la viabilidad celular, un indicador del metabolismo celular activo, se realizó en MCF7 y células tratadas NFF durante 72 horas y las células SH-SY5Y durante 48 horas.En comparación con los grupos de control con disolvente, 1 mM JCTH-4 disminuye el metabolismo celular activo por más del 50%, mientras que 10 TAM mM sola no mostró ninguna diferencia significativa tanto en MCF7 y SH-SY5Y células (Fig. 4a, b). Curiosamente en MCF7 y células SH-SY5Y, la adición de TAM al JCTH-4 insulto como resultado una disminución sinérgica en el metabolismo celular. Las células fueron NFF drásticamente menos sensible tanto a JCTH-4 solo y JCTH 4-con TAM (fig. 4c). Por lo tanto, JCTH-4 demuestra la actividad sinérgica selectiva con TAM en MCF7 y células SH-SY5Y.
Mitocondrial orientación de JCTH-4
Para ver si JCTH-4 se dirige a la mitocondria para inducir la apoptosis de potencial de membrana mitocondrial en las células enteras y la generación de ROS en las mitocondrias aisladas se vigila. MCF7 células fueron tratadas durante 72 horas y se tiñeron con TMRM. 1 mM JCTH-4 disminuyó MMP, indicado por la pérdida de fluorescencia roja (Fig. 5a). Sin embargo, con ªAdemás electrónico de TAM mM 10, una disipación mayor de MMP se observó, mientras que 10 TAM mM solo no tuvo ningún efecto evidente sobre la MMP.
Como aumenta la generación de ROS se han asociado a la permeabilización de la membrana mitocondrial y la inducción de la apoptosis, la producción de ROS se evaluó con el tinte Amplex Roja en las mitocondrias aisladas de SH-SY5Y células tratadas con 1 mM JCTH-4 y 10 mM de TAM, solo y en combinación 18 -20. Las lecturas de fluorescencia se expresaron como unidades de fluorescencia relativa (RFU). Los aumentos en la generación de ROS se observaron con JCTH-4 y TAM solo (Fig. 5b). Curiosamente, el tratamiento combinado produjo un mayor incremento en la producción de ROS. Un inductor bien conocida de la producción de ROS en las mitocondrias, PQ, se utilizó como control positivo.
La inducción de autofagia por JCTH-4 y TAM
La inducción de autofagia se ha asociado a la quimioterapia insulto por muchos compuestos diferentes
Durante la autofagia, asociada a los microtúbulos de proteína una cadena ligera de 3 (LC3), normalmente situado en el citosol (LC3-I), se lipidados con fosfatidiletanolamina y, posteriormente, localizada en las membranas autophagosomal (LC3-II) 2. Para verificar la inducción de la autofagia, los niveles de LC3-II fueron evaluados en MCF7 células tratadas durante 72 horas a través de los análisis de Western blot. 1 mM JCTH-4 poco induce la conversión de LC3-I LC3-II, mientras que 10 TAM mM produce una mayor respuesta autofagia (Fig.6b). Curiosamente, el tratamiento combinado resultó en la mayor inducción de autofagia, produciendo un LC3-II a LC3-I proporción mayor que 3. Por lo tanto, estos resultados demuestran la inducción autofagia en las células MCF7 por JCTH-4 y TAM solos y en combinación, con la mayor respuesta en las células con el tratamiento de combinación.
Suplementario de vídeo 1. La morfología celular de las células MCF7 tratados con disolvente de control. MCF7 células fueron controlados entre 48 y 66 horas después del tratamiento de control de disolvente (DMSO) con time-lapse con imágenes de microscopía de contraste de fase. Las células se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO 2. Las imágenes fueron capturadas con un aumento de 400x. Haga clic aquí para ver el video .
Suplementario Video 2. La inducción de la apoptosis celular en la morfología de las células MCF7 tratados con JCTH-4. MCF7 células fueron controlados entre 48 y 66 horas después de saber el tratamientoh 1 mM JCTH-4 utilizando time-lapse con imágenes de microscopía de contraste de fase. Las células se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO 2. Las imágenes fueron capturadas con un aumento de 400x. Haga clic aquí para ver el video .
Suplementario de vídeo 3. Inducción de la morfología celular, la autofagia en las células MCF7 tratados con TAM. MCF7 células fueron controlados entre 48 y 66 horas después del tratamiento con TAM 10 mM utilizando time-lapse con imágenes de microscopía de contraste de fase. Las células se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO 2. Las imágenes fueron capturadas con un aumento de 400x. Haga clic aquí para ver el video .
Suplementario de vídeo 4. La morfología apoptótica mejorada por JCTH-4 con TAM en las células MCF7. MCF7 células fueron controlados entre 48 y 66 horas después del tratamiento con ambos mM JCTH 1-4 y 10 mM de TAM con time-lapse microscopía con la fase contRast imágenes. Las células se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO 2. Las imágenes fueron capturadas con un aumento de 400x. Haga clic aquí para ver el video .
Figura 1. Comparación estructural de los archivos PST de un material sintético 7-desoxi analógica. (A) Estructura química de pancratistatin (PST). (B) Estructura química de-JC-TH-acetato de 4 (JCTH-4).
Figura 2. JCTH-4 induce la morfología nuclear apoptótica con el aumento de la actividad con la TAM. Morfología nuclear de (a) MCF7 y (b) las células SH-SY5Y tratadas durante 72 y 48 horas respectivamente, con las concentraciones indicadas de TAM y se tiñen JCTH-4 con reactivo de Hoechst. Los grupos control fueron tratados con disolvente (DMSO). Las imágenes fueron tomadas a 400 aumentos en un microscopio de fluorescencia. Barras de escala = 15 micras.
Figura 3. JCTH-4 causas fosfatidilserina externalización solos y en combinación con TAM selectivamente en las células cancerosas. Anexina unión a fosfatidilserina exteriorizada V fue evaluado para verificar la inducción de la inducción de la apoptosis en (a) MCF7 (72 horas), (b) SH-SY5Y (48 horas), y (c) las células NFF (72 horas) tratados con JCTH-4 y TAM a las concentraciones indicadas. Los grupos control fueron tratados con disolvente (DMSO). Las imágenes fueron tomadas a 400 aumentos en un microscopio de fluorescencia. Barras de escala = 15 micras.
TAM Figura 4. Mejora disminución viabilidad por JCTH-4 selectivamente en las células cancerosas. Placas de 96 pocillos fueron sembrados wio (un) MCF7, (b) SH-SY5Y, y (c) las células NFF y se trató con JCTH-4 y TAM a las concentraciones indicadas. MCF7 y células NFF fueron tratados durante 72 horas y SH-SY5Y fueron tratados durante 48 horas. Después del tratamiento de drogas y la incubación, WST-1 reactivo se añadió a cada pocillo, y las lecturas de absorbancia fueron tomadas a 450 nm y se expresó como un porcentaje del control (DMSO). Las estadísticas se realizaron con GraphPad Prism versión 5.0. Los valores se expresan como media ± desviación estándar de cuadruplicados de 3 experimentos independientes. MCF7: * p <0,001, ** p <0,0001 versus control; # p <0,05 frente a 1 mM JCTH-4; † p <0,0001 frente a 10 mM de TAM. SH-SY5Y: * p <0,0005 versus control; # p <0,005 frente a 1 mM JCTH-4; † p <0,005 frente a 10 mM de TAM. NFF: * p <0,005 frente a 10 mM TAM + 1 mM JCTH-4 en las células MCF7, # p <0,01 frente a 10 mM TAM + 1 mM JCTH-4 en las células SH-SY5Y.
Figura 5. JCTH-4 y acto de TAM en las mitocondrias. (A) MCF7 células fueron cultivadas en cubreobjetos y se trató con las concentraciones indicadas de fármacos durante 72 horas y se tiñeron con TMRM para evaluar MMP. Las células del grupo control fueron tratados con disolvente (DMSO). Las imágenes fueron capturadas con un aumento de 400x en un microscopio de fluorescencia. Barra de escala = 15 m. (B) las mitocondrias aisladas de SH-SY5Y células fueron tratadas con JCTH-4 y TAM a las concentraciones indicadas, y la producción de ROS se evaluó con el sustrato Amplex Roja en presencia de peroxidasa de rábano (HRP). Las células del grupo control fueron tratados con disolvente (DMSO). El paraquat (PQ) se utilizó a una concentración de 250 mM como un control positivo. Las lecturas de fluorescencia se obtuvieron después de 2 horas de tratamiento en el ex. 560 nm y EM. 590 nm y expresados como fluorescenc relativae unidades (RFU). Las estadísticas se obtuvieron utilizando GraphPad Prism versión 5.0. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes con tendencias similares. Los valores se expresaron como media ± desviación estándar de cuadruplicados de un experimento independiente. * P <0,05, ** p <0.005, *** p <0,001 versus control; # p <0,05 frente a 1 mM JCTH-4; † p TAM mM <0,05 frente a 10; @ p <0,05 versus 250 mM de PQ.
Figura 6. TAM mejora la inducción de autofagia JCTH-4. (A) MCF7 células fueron cultivadas en cubreobjetos y se sometió a insulto JCTH-4 y TAM a las concentraciones indicadas por 72 horas. Las células de control de grupo fueron tratados con disolvente (DMSO). Después del tratamiento, MCF7 células fueron teñidas con el MDC para detectar vacuolas autofágicas. Las imágenes fueron capturadas con un aumento de 400x en un microscopio de fluorescencia. Barras de escala = 15 micras. (b) análisis de Western blot se llevaron a cabo para LC3 y β actina-en lisados celulares de las células MCF7 tratados con las concentraciones indicadas de fármacos durante 72 horas. Los análisis densitométricos fueron ejecutados utilizando el software ImageJ. Las estadísticas se realizaron con GraphPad Prism versión 5.0. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. * P <0,05, ** p <0.005, *** p <0,0005 versus control; # p <0,001 frente a 1 mM JCTH-4; † p <0,001 frente a 10 mM de TAM.
Lista de abreviaturas.
| ER | los receptores de estrógenos |
| FMN | flavina mononucleótido |
| JCTH-4 | JC-TH-acetato-4 |
| LC3 | microtúbulos de proteínas asociadas una cadena ligera de 3 |
| MDC | monodansylcadaverine |
| MMP | mitochondrpotencial de membrana ial |
| MRC | cadena respiratoria mitocondrial |
| NFF | normal de los fibroblastos fetales humanos |
| PQ | paraquat |
| PST | pancratistatin |
| RFU | unidades de fluorescencia relativa |
| ROS | especies reactivas de oxígeno |
| TAM | tamoxifeno |
| TMRM | tetrametilrodamina metil éster |
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Discussion
PST y compuestos similares se han demostrado tener propiedades anti-cancerígenas 11-15,21. Hemos informado anteriormente de PST naturales para desestabilizar selectivamente la mitocondria en células cancerosas, que por lo tanto induce la apoptosis por la liberación de factores de apoptogénicos 12,14. Lo más probable es que JCTH-4 actúa a través del mismo mecanismo; JCTH-4 provocó el colapso de MMP en células MCF7 como se ha visto con la tinción de TMRM (Fig. 5a), y el aumento de la generación de ROS en la mitocondria aislada de SH-SY5Y células (Fig. 5b), indicativo de una disfunción mitocondrial. Por lo tanto, la inducción de apoptosis por JCTH-4 es más probablemente a través de la focalización mitocondrial en las células cancerosas.
Las numerosas diferencias existentes entre las células cancerosas y el cáncer, que puedan servir como base para la selectividad de cáncer por JCTH-4. Las células cancerosas son muy dependientes de la glucólisis y menos en la mitocondria para la producción de energía, este fenómeno se refiere a uns el efecto Warburg 22. Tal actividad metabólica en las células cancerosas conduce a la alta acidez en el citosol. En consecuencia, el medio ambiente citosólica ácida contribuye hiperpolarización de las células cancerosas mitocondrias, que se ha relacionado con una mayor capacidad para invadir y evadir la apoptosis 23. Hyperpolariztion mitocondrias de las células cancerosas sin embargo, puede hacer que las células cancerosas sean vulnerables a JCTH-4, una vez tenido en la célula, JCTH-4 puede adquirir una carga positiva a través del procesamiento enzimático y de forma selectiva sólo podrá ser adoptada en la mitocondria celular de cáncer debido a su naturaleza hiperpolarizado. Por otra parte, una serie de mitocondrias las proteínas antiapoptóticas asociados han demostrado ser altamente expresado en células de cáncer que prohíben la permeabilización de la membrana mitocondrial y la posterior ejecución de la apoptosis, tales como las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2 de proteínas 24-26.
En presencia de diversas formas de estrés celular, la autofagia se activa comouna respuesta a favor de la supervivencia, permitiendo que las células para sobrevivir en condiciones adversas 2. Durante la estimulación de esta vía sin embargo, puede conducir a la descomposición extensiva de vitales componentes intracelulares que dan lugar a 3 autofágica la muerte celular. Tanto la supervivencia de las respuestas a favor y en favor de la muerte-autofágicas se han asociado a la quimioterapia insulto 3. La disfunción mitocondrial por JCTH-4 conduce a estrés oxidativo que podría desencadenar una respuesta predeterminada autofagia automática. De hecho lo hicimos observar algunas de inducción de autofagia, junto con la apoptosis con JCTH-4 tratamiento (Fig. 2a, b 3a, b 6a, b). A pesar de TAM ha sido bien establecida como un antagonista del RE en RE positivos, las células de cáncer de mama, recientemente se ha demostrado que la interacción con la unión de las mitocondrias, en el sitio FMN del complejo I 10. Además, TAM es un inductor conocido de la autofagia a través de muchos tipos de células de cáncer 3. De hecho, TAM causó un aumento en la generación de ROS en la aislada mitochondria (Fig. 5b). Sin embargo, esta interacción resultó ser insuficiente para provocar el colapso de MMP (Fig. 5a), pero suficiente para inducir una típica respuesta de pro-supervivencia autofagia. La inducción de autofagia extensa se observó cuando JCTH-4 y TAM se utiliza en combinación (Fig. 6a, b), que fue acompañado por un aumento de la respuesta citotóxica (Fig. 4a, b), lo que sugiere una respuesta a favor de la muerte de autofagia, sin embargo, las células cancerosas mueren con el tiempo la apoptosis, como resultado de la permeabilización mitocondrial y la liberación del factor apoptogenic. Dicha sensibilización por TAM a JCTH-4 insulto puede atribuirse al aumento en la generación de ROS por TAM. Debido a que tanto TAM y JCTH 4-son capaces de generar estrés oxidativo, la producción combinatoria de estrés, con ambos compuestos puede conducir a la inducción de autofagia amplia dando lugar a una respuesta en detrimento de la autofagia y / o la permeabilización mitocondrial y la apoptosis extensa posterior. Thtratamiento se combina no afecta a la viabilidad de los fibroblastos no cancerosas (Fig. 4c). Estos hallazgos indican que JCTH-4 solo y en combinación con TAM se puede utilizar de manera eficiente para tratar el cáncer de mama y el neuroblastoma, sin causar efectos adversos sobre las células no cancerosas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo ha sido apoyado por los Caballeros de Colón el Capítulo 9671 (Windsor, Ontario), y Federico Banting CIHR y Charles Best Canadá Becas de Posgrado otorgó a Dennis Ma. Gracias a Hodge, Robert y Elizabeth Fidalgo da Silva por su ayuda con la microscopía de lapso de tiempo. Gracias a Katie Facecchia para la edición de los vídeos de microscopía de time-lapse. También nos gustaría dar las gracias a Sudipa junio Chatterjee y Tremblay Phillip para la revisión crítica de este manuscrito. Este trabajo está dedicado en memoria de Kevin Couvillon quien perdió su batalla contra el cáncer en 2010.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 | |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30022.01 | |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 | |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek Corp. | P35G-014-C | |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| H–chst 33342 dye | Molecular Probes, Life Technologies | H3570 | |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| WST-1 reagent | Roche Group | 11644807001 | |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer, Inc. | 1420-011 | |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | GIBCO, by Life Technologies | T-668 | |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 | |
| BioRad protein assay | Bio-Rad | 500-0001Bottom of Form | |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 | |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 | |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 | |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 | |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
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