Verbetering van de apoptotische en autofagocytische Inductie door een nieuwe synthetische C-1-analoog van 7-deoxypancratistatin in de moedermelk Darmkanker en Neuroblastoom Cellen met Tamoxifen
Summary
We hebben gesynthetiseerd een nieuwe analoog van pancratistatin met vergelijkbare anti-kanker activiteit als native pancratistatin, interessant, combinatorische behandeling met tamoxifen leverde een drastische verbetering in de apoptotische en autofagocytische inductie door mitochondriale richten met minimale effecten op goedaardige fibroblasten. Zo kon JCTH-4 in combinatie met tamoxifen zorgen voor een veilige anti-kanker therapie.
Abstract
Borstkanker is een van de meest voorkomende vormen van kanker onder vrouwen in Noord-Amerika. Vele huidige antikankerbehandelingen, zoals ioniserende straling, apoptose via DNA-schade. Helaas is een dergelijke behandeling niet-selectief voor kankercellen en produceren soortgelijke toxiciteit in normale cellen. Wij hebben gemeld selectieve inductie van apoptose in kankercellen door de natuurlijke verbinding pancratistatin (PST). Onlangs is een nieuwe PST analoog een C-1 acetoxymethyl derivaat van 7 deoxypancratistatin (JCTH-4), die door de novo synthese en vertoont vergelijkbare selectieve apoptose inducerende activiteit in verscheidene cellijnen. Onlangs heeft autofagie betrokken bij maligniteiten als zowel pro-overleving en pro-dood mechanismen in reactie op chemotherapie. Tamoxifen (TAM) heeft altijd aangetoond inductie van pro-survival autofagie in tal van vormen van kanker. In deze studie werd de effectiviteit van JCTH-4 alleen en in combinatie met TAM om celdood te induceren in de moedermelk Cancer (MCF7) en neuroblastoom (SH-SY5Y) cellen werd geëvalueerd. TAM alleen autofagie veroorzaakt, maar onbeduidend celdood terwijl JCTH-4 alleen al veroorzaakt significante inductie van apoptose met een aantal inductie van autofagie. Interessant is dat de combinatorische behandeling leverde een drastische toename van apoptotische en autofagocytische inductie. We tijdsafhankelijke morfologische veranderingen in MCF7 cellen die door TAM-geïnduceerde autofagie, JCTH-4-geïnduceerde apoptose en autofagie, en versnelde celdood bewaakt met behulp van combinatorische behandeling met behulp van time-lapse microscopie. We hebben aangetoond dat deze verbindingen apoptose / autofagie induceren door mitochondriale targeting in deze kankercellen. Belangrijker is dat deze behandelingen geen invloed op de overleving van goedaardige menselijke fibroblasten. Zo geven deze resultaten aan dat JCTH-4 in combinatie met TAM kunnen worden gebruikt als een veilig en zeer krachtige anti kanker therapie tegen borstkanker en neuroblastoomcellen.
Protocol
Discussion
PST en soortgelijke verbindingen is aangetoond om anti-kanker eigenschappen 11-15,21. We hebben eerder gemeld natuurlijke PST om selectief te destabiliseren de mitochondriën in kankercellen, die veroorzaakt daarbij apoptose door het vrijkomen van apoptotische factoren 12,14. Het is zeer waarschijnlijk dat JCTH-4 werkt via hetzelfde werkingsmechanisme heeft; JCTH-4 veroorzaakt MMP ineenstorting van de MCF7 cellen gezien met TMRM kleuring (afb. 5a), en een verhoogde productie van RO…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Ridders van Columbus Hoofdstuk 9671 (Windsor, Ontario), en een CIHR Frederick Banting en Charles Best Canada Graduate Scholarship uitgereikt aan Dennis Ma. Hartelijk dank aan Robert Hodge en Elizabeth Fidalgo da Silva voor hun hulp bij de time-lapse microscopie. Bedankt aan Katie Facecchia voor het bewerken van de time-lapse microscopie video's. Wij zouden ook graag Sudipa juni Chatterjee en Phillip Tremblay bedanken voor de kritische beoordeling van dit manuscript. Dit werk is opgedragen ter nagedachtenis van Kevin Couvillon die zijn strijd tegen kanker verloren in 2010.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C |
| Fetal bovine serum | Gibco BRL | 16000-044 |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Scientific | SH30022.01 |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-014-C |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A |
| Hoechst 33342 dye | Molecular Probes | H3570 |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| WST-1 reagent | Roche Applied Science | 11644807001 |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer | 1420-011 |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | Gibco BRL | T-668 |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 |
| BioRad protein assay | Bio-Rad Laboratories | 500-0001Bottom of Form |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
References
- Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
- Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
- Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
- Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
- Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
- Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
- Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
- McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
- Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
- Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
- Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
- Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
- Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
- Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
- Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. a. n., Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
- Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).
