Steigerung der apoptotischen und autophagische Induktion durch eine neuartige synthetische C-1-Analogon von 7-deoxypancratistatin in die menschliche Muttermilch Adenokarzinom und Neuroblastomzellen mit Tamoxifen
Summary
Wir haben eine neue Analogon Pancratistatin mit vergleichbaren Anti-Krebs-Aktivität als native Pancratistatin synthetisiert; Interessanterweise ergab kombinatorische Behandlung mit Tamoxifen eine drastische Steigerung der Apoptose und Autophagie-Induktion durch mitochondriale Targeting mit minimalen Auswirkungen auf noncancerous Fibroblasten. Somit könnte JCTH-4 in Kombination mit Tamoxifen eine sichere Anti-Krebs-Therapie.
Abstract
Brustkrebs ist eine der häufigsten Krebserkrankungen bei Frauen in Nordamerika. Viele aktuelle Anti-Krebs-Behandlungen, einschließlich ionisierender Strahlung, die Apoptose über DNA-Schäden. Leider sind solche Behandlungen nicht-selektiven, um Krebszellen zu erzeugen und ähnliche Toxizität in normalen Zellen. Wir haben selektive Induktion von Apoptose in Krebszellen durch die natürliche Verbindung Pancratistatin (PST) berichtet. Kürzlich wurde eine neue PST Analog, ein C-1 Acetoxymethyl-Derivat von 7-deoxypancratistatin (JCTH-4), von de-novo-Synthese hergestellt und weist vergleichbare selektive Apoptose induzierende Aktivität in verschiedenen Krebszelllinien. Vor kurzem hat die Autophagie in bösartigen Erkrankungen wie sowohl pro-Überleben und die pro-Tod-Mechanismen als Reaktion auf Chemotherapie beteiligt. Tamoxifen (TAM) hat stets die Induktion von pro-Überleben Autophagie in zahlreichen Krebsarten demonstriert. In dieser Studie, um die Wirksamkeit von JCTH-4 allein oder in Kombination mit TAM Zelltod in der menschlichen Muttermilch deutung zu induzierenr (MCF7) und Neuroblastom (SH-SY5Y-Zellen) wurde ausgewertet. TAM allein Autophagie, induziert aber unbedeutend Zelltod während JCTH-4 allein signifikante Induktion der Apoptose mit etwas Induktion von Autophagie verursacht. Interessanterweise ergab die kombinatorische Behandlung eine drastische Zunahme der apoptotischen und autophagischen Induktion. Wir überwachten zeitabhängige morphologische Veränderungen in MCF7-Zellen durchlaufen TAM-induzierten Autophagie, JCTH-4-induzierte Apoptose und Autophagie und beschleunigte Zelltod mit kombinatorischen Behandlung mit Zeitraffer-Mikroskopie. Wir haben diese Verbindungen nachgewiesen, dass die Apoptose / Autophagie durch mitochondriale Targeting in diesen Krebszellen zu induzieren. Wichtig ist, dass diese Behandlungen haben keinen Einfluss auf das Überleben der menschlichen Fibroblasten noncancerous. Somit zeigen diese Ergebnisse, dass JCTH-4 in Kombination mit TAM als sicher und sehr potente anti-Krebs-Therapie gegen Brustkrebs und Neuroblastom-Zellen verwendet werden.
Protocol
Discussion
PST und ähnliche Verbindungen wurde gezeigt, eine anti-Krebs-Eigenschaften 11-15,21. Wir haben zuvor natürlich PST gemeldet, um die Mitochondrien selektiv in Krebszellen destabilisieren, die dadurch induziert Apoptose durch die Freisetzung von Faktoren apoptogene 12,14. Es ist sehr wahrscheinlich, dass JCTH-4 wirkt über den gleichen Mechanismus; JCTH-4 verursacht MMP Zusammenbruch in MCF7-Zellen als mit TMRM Färbung (Abb. 5a) gesehen, und erhöhte Bildung von ROS in isolierten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den Knights of Columbus Kapitel 9671 (Windsor, Ontario) und einem CIHR Frederick Banting und Charles Best Kanada Graduate Stipendium für Dennis Ma unterstützt worden. Vielen Dank an Robert Hodge und Elizabeth Fidalgo da Silva für ihre Hilfe bei der Zeitraffer-Mikroskopie. Wir danken Ihnen, Katie Facecchia für die Bearbeitung der Zeitraffer-Mikroskopie Videos. Wir möchten auch Sudipa Juni Chatterjee und Phillip Tremblay für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wird in Erinnerung an Kevin Couvillon, der seinen Kampf gegen den Krebs im Jahr 2010 verloren gewidmet.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C |
| Fetal bovine serum | Gibco BRL | 16000-044 |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Scientific | SH30022.01 |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-014-C |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A |
| Hoechst 33342 dye | Molecular Probes | H3570 |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| WST-1 reagent | Roche Applied Science | 11644807001 |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer | 1420-011 |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | Gibco BRL | T-668 |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 |
| BioRad protein assay | Bio-Rad Laboratories | 500-0001Bottom of Form |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
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