Summary

Steigerung der apoptotischen und autophagische Induktion durch eine neuartige synthetische C-1-Analogon von 7-deoxypancratistatin in die menschliche Muttermilch Adenokarzinom und Neuroblastomzellen mit Tamoxifen

Published: May 30, 2012
doi:

Summary

Wir haben eine neue Analogon Pancratistatin mit vergleichbaren Anti-Krebs-Aktivität als native Pancratistatin synthetisiert; Interessanterweise ergab kombinatorische Behandlung mit Tamoxifen eine drastische Steigerung der Apoptose und Autophagie-Induktion durch mitochondriale Targeting mit minimalen Auswirkungen auf noncancerous Fibroblasten. Somit könnte JCTH-4 in Kombination mit Tamoxifen eine sichere Anti-Krebs-Therapie.

Abstract

Brustkrebs ist eine der häufigsten Krebserkrankungen bei Frauen in Nordamerika. Viele aktuelle Anti-Krebs-Behandlungen, einschließlich ionisierender Strahlung, die Apoptose über DNA-Schäden. Leider sind solche Behandlungen nicht-selektiven, um Krebszellen zu erzeugen und ähnliche Toxizität in normalen Zellen. Wir haben selektive Induktion von Apoptose in Krebszellen durch die natürliche Verbindung Pancratistatin (PST) berichtet. Kürzlich wurde eine neue PST Analog, ein C-1 Acetoxymethyl-Derivat von 7-deoxypancratistatin (JCTH-4), von de-novo-Synthese hergestellt und weist vergleichbare selektive Apoptose induzierende Aktivität in verschiedenen Krebszelllinien. Vor kurzem hat die Autophagie in bösartigen Erkrankungen wie sowohl pro-Überleben und die pro-Tod-Mechanismen als Reaktion auf Chemotherapie beteiligt. Tamoxifen (TAM) hat stets die Induktion von pro-Überleben Autophagie in zahlreichen Krebsarten demonstriert. In dieser Studie, um die Wirksamkeit von JCTH-4 allein oder in Kombination mit TAM Zelltod in der menschlichen Muttermilch deutung zu induzierenr (MCF7) und Neuroblastom (SH-SY5Y-Zellen) wurde ausgewertet. TAM allein Autophagie, induziert aber unbedeutend Zelltod während JCTH-4 allein signifikante Induktion der Apoptose mit etwas Induktion von Autophagie verursacht. Interessanterweise ergab die kombinatorische Behandlung eine drastische Zunahme der apoptotischen und autophagischen Induktion. Wir überwachten zeitabhängige morphologische Veränderungen in MCF7-Zellen durchlaufen TAM-induzierten Autophagie, JCTH-4-induzierte Apoptose und Autophagie und beschleunigte Zelltod mit kombinatorischen Behandlung mit Zeitraffer-Mikroskopie. Wir haben diese Verbindungen nachgewiesen, dass die Apoptose / Autophagie durch mitochondriale Targeting in diesen Krebszellen zu induzieren. Wichtig ist, dass diese Behandlungen haben keinen Einfluss auf das Überleben der menschlichen Fibroblasten noncancerous. Somit zeigen diese Ergebnisse, dass JCTH-4 in Kombination mit TAM als sicher und sehr potente anti-Krebs-Therapie gegen Brustkrebs und Neuroblastom-Zellen verwendet werden.

Protocol

Einführung Apoptose, oder geben Sie mir den programmierten Zelltod, ist ein physiologischer Prozess, der extrinsisch arbeiten kann, über die Bindung eines Liganden an einen Tod death receptor, oder intrinsisch. Der intrinsische Weg der Apoptose wird durch intrazelluläre Stress wie DNA-Schäden und mitochondriale Dysfunktion initiiert, dies führt letztendlich zu der Permeabilisierung der Mitochondrien, die Ableitung des mitochondrialen Membranpotentials (MMP), Freisetzung von apoptogene Fakt…

Discussion

PST und ähnliche Verbindungen wurde gezeigt, eine anti-Krebs-Eigenschaften 11-15,21. Wir haben zuvor natürlich PST gemeldet, um die Mitochondrien selektiv in Krebszellen destabilisieren, die dadurch induziert Apoptose durch die Freisetzung von Faktoren apoptogene 12,14. Es ist sehr wahrscheinlich, dass JCTH-4 wirkt über den gleichen Mechanismus; JCTH-4 verursacht MMP Zusammenbruch in MCF7-Zellen als mit TMRM Färbung (Abb. 5a) gesehen, und erhöhte Bildung von ROS in isolierten …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von den Knights of Columbus Kapitel 9671 (Windsor, Ontario) und einem CIHR Frederick Banting und Charles Best Kanada Graduate Stipendium für Dennis Ma unterstützt worden. Vielen Dank an Robert Hodge und Elizabeth Fidalgo da Silva für ihre Hilfe bei der Zeitraffer-Mikroskopie. Wir danken Ihnen, Katie Facecchia für die Bearbeitung der Zeitraffer-Mikroskopie Videos. Wir möchten auch Sudipa Juni Chatterjee und Phillip Tremblay für die kritische Durchsicht des Manuskripts danken. Diese Arbeit wird in Erinnerung an Kevin Couvillon, der seinen Kampf gegen den Krebs im Jahr 2010 verloren gewidmet.

Materials

Material Name Company Catalogue number
SH-SY5Y cell line ATCC CRL-2266
Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM Sigma-Aldrich 51448C
Fetal bovine serum Gibco BRL 16000-044
MCF7 cell line ATCC HTB-22
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R 0883
Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) Coriell Institute for Medical Research AG04431B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium Thermo Scientific SH30022.01
Tamoxifen citrate salt Sigma-Aldrich T9262
35 mm glass bottom culture dishes MatTek P35G-014-C
Leica DMI6000 B inverted microscope Leica Microsystems N/A
Hoechst 33342 dye Molecular Probes H3570
Leica DM IRB inverted fluorescence microscope Leica Microsystems N/A
Annexin V AlexaFluor-488 Invitrogen A13201
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-20ML
Haemocytometer Fisher Scientific 267110
WST-1 reagent Roche Applied Science 11644807001
Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter PerkinElmer 1420-011
Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) Gibco BRL T-668
Glass tissue grinder Fisher Scientific K8885300-0002
BioRad protein assay Bio-Rad Laboratories 500-0001Bottom of Form
Amplex Red Invitrogen A12222
Horseradish peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8125
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices 3126666
Anti-LC3 antibody raised in rabbit Novus Biologicals NB100-2220
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6728
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6802
Chemiluminescence peroxidase substrate Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

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Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).

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