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Medicine

Apoptotic और autophagic प्रेरण के एक उपन्यास सिंथेटिक मानव स्तन adenocarcinoma और Tamoxifen साथ neuroblastoma कोशिकाओं में सी 1 7 deoxypancratistatin के अनुरूप द्वारा संवर्धन

doi: 10.3791/3586 Published: May 30, 2012

Summary

हम देशी pancratistatin के रूप में तुलनीय विरोधी कैंसर गतिविधि के साथ pancratistatin का एक उपन्यास एनालॉग संश्लेषित है, दिलचस्प है, tamoxifen के साथ combinatory उपचार noncancerous fibroblasts पर न्यूनतम प्रभाव के साथ लक्षित mitochondrial द्वारा एक apoptotic और autophagic प्रेरण में कठोर वृद्धि झुकेंगे. इस प्रकार, tamoxifen के साथ संयोजन में JCTH-4 एक सुरक्षित विरोधी कैंसर चिकित्सा प्रदान सकता है.

Abstract

स्तन कैंसर महिलाओं के बीच उत्तरी अमेरिका में सबसे आम कैंसर में से एक है. विकिरण सहित कई मौजूदा विरोधी कैंसर उपचार, डीएनए की क्षति के माध्यम से apoptosis को उत्पन्न करते हैं. दुर्भाग्य से, इस तरह के उपचार के कैंसर की कोशिकाओं को गैर चयनात्मक हैं और सामान्य कोशिकाओं में इसी तरह की विषाक्तता का उत्पादन. हम प्राकृतिक यौगिक pancratistatin के (पीएसटी) के द्वारा कैंसर की कोशिकाओं में apoptosis के चुनिंदा शामिल की सूचना दी है. हाल ही में, एक उपन्यास पीएसटी अनुरूप, सात deoxypancratistatin (JCTH 4) के एक व्युत्पन्न acetoxymethyl C-1, डी Novo संश्लेषण द्वारा उत्पादन किया गया था और यह कई कैंसर कोशिका लाइनों में तुलनीय चयनात्मक apoptosis के उत्प्रेरण गतिविधि दर्शाती है. हाल ही में, भोजी दोनों और कीमोथेरेपी के जवाब में समर्थक अस्तित्व समर्थक मौत तंत्र के रूप में किया गया है दुर्दमताओं में फंसा है. Tamoxifen (टीएएम) हमेशा कई तरह के कैंसर में अस्तित्व भोजी की प्रेरण का प्रदर्शन किया है. इस अध्ययन में, अकेले और टीएएम साथ संयोजन में JCTH-4 की प्रभावकारिता मानव स्तन CANCE में कोशिका मृत्यु को उत्पन्न करने के लिए(MCF7) r और neuroblastoma के (एसएच SY5Y) के कोशिकाओं मूल्यांकन किया गया था. अकेले टीएएम भोजी प्रेरित किया, लेकिन तुच्छ कोशिका मृत्यु जबकि अकेले JCTH 4 भोजी की कुछ शामिल apoptosis की महत्वपूर्ण शामिल हुई. दिलचस्प है, combinatory उपचार apoptotic और autophagic शामिल में भारी वृद्धि मिले. हम मिश्रित समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर उपचार के साथ समय पर निर्भर MCF7 कोशिकाओं में morphological परिवर्तन प्रेरित भोजी - टीएएम के दौर से गुजर, JCTH-4-प्रेरित apoptosis और भोजी, और त्वरित कोशिका मृत्यु पर नजर रखी. हम इन यौगिकों का प्रदर्शन किया है इन कैंसर कोशिकाओं में mitochondrial लक्ष्यीकरण द्वारा प्रेरित apoptosis / भोजी. महत्वपूर्ण बात, इन उपचार noncancerous मानव fibroblasts की अस्तित्व प्रभावित नहीं किया. इस प्रकार, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि JCTH-4 टीएएम के साथ संयोजन में स्तन कैंसर और neuroblastoma कोशिकाओं के खिलाफ एक सुरक्षित और बहुत शक्तिशाली विरोधी कैंसर चिकित्सा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

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परिचय

Apoptosis, या क्रमादेशित कोशिका मृत्यु लिखें, एक शारीरिक प्रक्रिया है कि बाहर से काम कर सकते हैं के माध्यम से एक की मौत ligand के एक मौत रिसेप्टर के लिए बाध्य है, या आंतरिक रूप से, है. apoptosis के आंतरिक मार्ग intracellular तनाव से डीएनए की क्षति और mitochondrial रोग के रूप में शुरू की है, यह अंततः mitochondrial झिल्ली क्षमता के mitochondria अपव्यय, (एमएमपी), mitochondrial intermembrane अंतरिक्ष से apoptogenic कारकों के रिहाई की permeabilization की ओर जाता है, और बाद में निष्पादन 1 apoptosis की.

भोजी एक प्रक्रिया है जिसमें एक सेल टूटता है, degrades, और अपने स्वयं के intracellular घटकों recycles के प्लाज्मा झिल्ली अखंडता को बनाए रखने है, यह oxidative तनाव, hypoxia, प्रोटीन समुच्चय, पोषक तत्वों के अभाव, वृद्धि कारक के अभाव सहित सेलुलर तनाव के विभिन्न प्रकार से शुरू हो रहा है, और क्षतिग्रस्त organelles के 2. आरंभिक चरणों मेंइस प्रक्रिया के, साइटोसोलिक सामग्री autophagosomes, डबल membraned vesicles, जो lysosomes का फ्यूज autolysosomes फार्म के द्वारा घिरा हुआ है. Lysosomal संलयन, साइटोसोलिक सामग्री पहले autophagosomes द्वारा हाथ में लिया lysosomal 2 एंजाइमों द्वारा अपमानित कर रहे हैं. इस मार्ग का व्यापक सक्रियण intracellular घटकों है जो autophagic कोशिका मृत्यु या प्रकार द्वितीय क्रमादेशित कोशिका 3 मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं की व्यापक गिरावट पैदावार.

कोशिका मृत्यु की चोरी 4 कैंसर की पहचान में से एक माना गया है. कैंसर एक अनियंत्रित कोशिका वृद्धि और 5 प्रसार द्वारा विशेषता बीमारी है. विशेष रूप, neuroblastoma तंत्रिका शिखा से 6 सहानुभूति तंत्रिका तंत्र की तंत्रिका कोशिकाओं के विकास से उठता है. यह सबसे आम ठोस ट्यूमर युवा बच्चों में होने वाली है, सब बचपन 7 कैंसर का लगभग 9% के लिए लेखांकन. हालांकि बहुत प्रगति की तारीख करने के लिए किया गया है, इस रोग समस्याग्रस्त रहतादोनों बुनियादी वैज्ञानिकों और चिकित्सकों के लिए. दूसरी ओर, 8 महिलाओं में स्तन कैंसर सबसे आम कैंसर है. Tamoxifen (टीएएम) अक्सर हार्मोन उत्तरदायी स्तन कैंसर में उपचार के लिए एक एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर) 9 प्रतिपक्षी के रूप में इस्तेमाल किया. बहरहाल, अन्य रिपोर्टों टीएएम द्वारा अतिरिक्त स्वतंत्र apoptosis के शामिल के तंत्र का सबूत प्रदान करते हैं. विशेष रूप में, टीएएम इसके पीला रंग (FMN) 10 mononucleotide साइट पर mitochondrial श्वसन श्रृंखला (MRC) मैं परिसर के साथ सूचना का आदान प्रदान.

पीएसटी एक प्राकृतिक संयंत्र Hymenocallis littoralis से अलग परिसर है. वर्तमान में उपयोग में कई केमोथेरापी से विषम, यह apoptosis को उत्पन्न करने के लिए, एक गैर genotoxic तरीके में, चुनिंदा mitochondrial 11-15 लक्ष्यीकरण के माध्यम से विभिन्न कैंसर कोशिका प्रकार में दिखाया गया है. हालांकि, इसकी उपलब्धता के द्वारा preclinical और नैदानिक ​​काम किया गया रुकावट है, यह अपनी प्राकृतिक स्रोत और कई complic है में बहुत कम मात्रा में मौजूद हैations अपने रासायनिक संश्लेषण बोझ है. हम संश्लेषित जांच 7 deoxypancratistatin के सिंथेटिक analogues के और एक C-1 acetoxymethyl व्युत्पन्न में इसी तरह की गतिविधि विरोधी कैंसर, 16 जे.सी. - TH-एसीटेट 4 (JCTH 4) मनाया. हम अब हाथ में प्रबल विरोधी कैंसर गतिविधि के साथ एक सिंथेटिक पीएसटी अनुरूप है. उसके संश्लेषण मानकीकृत किया गया है और बढ़ाया preclinical और नैदानिक ​​काम करने के लिए पर्याप्त मात्रा में उत्पादन किया जा सकता है. चूंकि प्राकृतिक पीएसटी और दोनों लक्ष्य टीएएम के mitochondria, यह मानव स्तन कैंसर और neuroblastoma कोशिकाओं पर टीएएम के साथ संयोजन में पीएसटी की एक कृत्रिम अनुरूप के संयुक्त प्रभाव की जांच करने के लिए दिलचस्प होगा.

इस के साथ साथ, हम मानव neuroblastoma के में JCTH 4 चयनात्मक cytotoxicity (एसएच SY5Y) और स्तन (MCF7) ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं की रिपोर्ट. JCTH 4 mitochondrial लक्ष्यीकरण द्वारा दोनों सेल लाइनों में apoptosis को उत्पन्न करने में सक्षम था, JCTH-4 एमएमपी का अपव्यय और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) पृथक mitoch में उत्पादन में वृद्धि का कारणइन कैंसर कोशिकाओं से ondria. इसके अलावा, भोजी JCTH-4 द्वारा MCF7 कोशिकाओं में प्रेरित किया गया था. दिलचस्प है, टीएएम की JCTH-4 अपमान करने के लिए अलावा एसएच SY5Y और MCF7 कोशिकाओं में JCTH-4 के aforementioned प्रभाव बढ़ाया. Morphological परिवर्तन JCTH-4 और अकेले और संयोजन में MCF7 कोशिकाओं में टीएएम द्वारा प्रेरित चरण विपरीत या उज्ज्वल मैदान चित्रों के समय चूक माइक्रोस्कोपी के माध्यम से निगरानी की गई. सामान्य मानव भ्रूण fibroblasts (NFF) के JCTH-4 के लिए संवेदनशीलता में एक उल्लेखनीय कमी का प्रदर्शन दोनों अकेले और टीएएम साथ संयोजन में. इसलिए, इन टिप्पणियों टीएएम साथ JCTH-4, और अकेले में सुझाव देते हैं, के लिए एक सुरक्षित और प्रभावी स्तन कैंसर और neuroblastoma के खिलाफ chemotherapeutic एजेंट हो.

सामग्री और तरीके

1. सेल संस्कृति

  1. बढ़ने और संस्कृति एसएच SY5Y Dulbecco संशोधित ईगल्स मध्यम F-12 हैम (सिग्मा Aldrich, मिसिसॉगा, पर, कनाडा) 2 मिमी के साथ पूरक के साथ मानव neuroblastoma कोशिकाओं (ATCC, बिल्ली. CRL 2266 नहीं, Manassas, VA, संयुक्त राज्य अमेरिका) एल - glutaminए, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 10 मिलीग्राम / एमएल gentamicin (Gibco ब्राज़ीलियाई VWR, मिसिसॉगा, पर, कनाडा). 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को बनाए रखने.
  2. बढ़ो और RPMI +१६४० मध्यम (सिग्मा Aldrich कनाडा, मिसिसॉगा, पर, कनाडा) के साथ पूरक 10% FBS मानक (थर्मो MCF7 मानव स्तन ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं (ATCC, बिल्ली. HTB-22, नहीं, Manassas, VA, संयुक्त राज्य अमेरिका) संस्कृति वैज्ञानिक, Waltham, MA) और 10 मिलीग्राम / एमएल gentamicin Gibco ब्राज़ीलियाई VWR, पर, कनाडा मिसिसॉगा,. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को बनाए रखने.
  3. आगे बढ़ें और संस्कृति जाहिरा तौर पर सामान्य मानव भ्रूण (NFF) के Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, उच्च ग्लूकोज (थर्मो वैज्ञानिक, Waltham, MA, संयुक्त राज्य अमेरिका में fibroblast सेल लाइन (Coriell चिकित्सा अनुसंधान के लिए संस्थान, बिल्ली नहीं AG04431B, Camden, न्यू जर्सी, संयुक्त राज्य अमेरिका) ) 15% FBS और 10 मिलीग्राम / एमएल gentamicin, (Gibco ब्राज़ीलियाई VWR, पर, कनाडा मिसिसॉगा,) के साथ पूरक. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को बनाए रखने.

2. दवा तैयार

  1. बाहर tamoxifen के वजन (टीएएम) साइट्रेट नमक (सिग्मा Aldrich, बिल्ली. T9262 नहीं, मिसिसॉगा, पर, कनाडा) और यह DMSO में भंग करने के लिए एक 10 मिमी स्टॉक समाधान तैयार. -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग जब तक स्टोर स्टॉक समाधान. सभी वाहन DMSO के कम से कम 0.5% में निहित इस अध्ययन में इस्तेमाल किया नियंत्रण.
  2. 1 मिमी स्टॉक DMSO के (JCTH 4) जे.सी. TH-एसीटेट-4, bromobenzene से chemoenzymatic संश्लेषण द्वारा उत्पादित के रूप में पहले 16 में वर्णित में भंग समाधान तैयार 2.1 कदम दोहराएँ. -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग जब तक स्टोर स्टॉक समाधान. सभी वाहन DMSO के कम से कम 0.5% में निहित इस अध्ययन में इस्तेमाल किया नियंत्रण.

3. समय - चूक माइक्रोस्कोपी

  1. थाली लगभग 2.0 x 35 मिमी गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन (MatTek निगम, बिल्ली नहीं. P35G-014 - सी, Ashland, एमए, संयुक्त राज्य अमेरिका) में 5 MCF7 कोशिकाओं 10 और द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट की बाँझ परिस्थितियों में उन्हें विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  2. जब कोशिकाओं संगम 60 से 70% तक पहुँचने, 1 JCTH-4 माइक्रोन एक 1 मिमी का उपयोग कर के साथ उन्हें इलाजस्टॉक समाधान DMSO के और 10 माइक्रोन एक 10 मिमी शेयर DMSO में भंग है, अकेले और संयोजन में एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में समाधान का उपयोग कर टीएएम में भंग.
  3. कक्षों की 48 घंटे, एक गर्म कक्ष में 37 पर जगह कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस एक Leica DMI6000 फ्लोरोसेंट खुर्दबीन (Leica माइक्रोसिस्टम्स, Wetzlar, जर्मनी) के एक मंच पर 5% सीओ 2 के साथ. के लिए उपचार के बाद
  4. लास AF6000 सॉफ्टवेयर का प्रयोग, खुर्दबीन सेट 400x बढ़ाई चरण के विपरीत या उज्ज्वल क्षेत्र micrographs 18 घंटे के लिए हर 5 मिनट लग.

4. परमाणु धुंधला

  1. प्लेट 2.0 लगभग x MCF7 5 10 या एक 6 द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट में अच्छी तरह से स्पष्ट नीचे टिशू कल्चर प्लेट की हर अच्छी तरह से और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में विकसित करने की अनुमति एसएच SY5Y कोशिकाओं.
  2. जब कोशिकाओं को 60 से 70% संगम तक पहुँचते हैं, उन्हें 1 JCTH - 4 सुक्ष्ममापी 1 मिमी शेयर DMSO में भंग समाधान और 10 माइक्रोन टीएएम DMSO में एक 10 मिमी स्टॉक भंग समाधान का उपयोग कर का उपयोग करते हुए, दोनों के साथ इलाजअकेले और संयोजन में एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में.
  3. 37 में aforementioned उपचार के साथ कोशिकाओं को सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 48 (कोशिकाओं एसएच SY5Y) घंटे या 72 घंटे (MCF7 कोशिकाओं) के लिए 5% सीओ 2.
  4. उपचार और दवाओं के साथ कक्षों की ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं के इलाज मीडिया को सीधे Hoechst 33,342 डाई (आण्विक जांच, यूजीन, या, संयुक्त राज्य अमरीका) 10 माइक्रोन का एक अंतिम एकाग्रता के नाभिक दाग जोड़ने.
  5. 5 से 10 मिनट के लिए प्रकाश से सुरक्षित Hoechst डाई के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  6. Leica डीएम आईआरबी औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (Leica माइक्रोसिस्टम्स, Wetzlar, जर्मनी) के मंच पर थाली प्लेस.
  7. 400x बढ़ाई फ्लोरोसेंट और चरण micrographs ले लो.

5. Annexin वी बंधन परख

  1. प्लेट 5.0 लगभग 10 x MCF7 5 एसएच SY5Y, या NFF कोशिकाओं वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में 10 एमएल ऊतक संस्कृति प्लेटों में और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 उन्हें विकसित करने की अनुमति.
  2. डब्ल्यूमुर्गी कोशिकाओं संगम 60 से 70% तक पहुँचते हैं, उन्हें एक JCTH-4 माइक्रोन 1 मिमी स्टॉक DMSO के और 10 माइक्रोन टीएएम के एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा में एक 10 मिमी स्टॉक DMSO में भंग समाधान, दोनों अकेले और संयोजन में उपयोग कर भंग में समाधान का उपयोग कर के साथ इलाज कैबिनेट.
  3. 37 में aforementioned उपचार के साथ कोशिकाओं को सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 48 (कोशिकाओं एसएच SY5Y) घंटे या 72 घंटे (MCF7 और NFF कोशिकाओं) के लिए 5% सीओ 2.
  4. DDH 2 हे में 10 मिमी HEPES, 10 मिमी NaOH, 140 मिमी NaCl, और उपयोग जब तक 7.6 पीएच और दुकान में 1 मिमी 2 4 ° CaCl सी के साथ Annexin वी बाध्यकारी बफर तैयार.
  5. इलाज और दवाओं के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन के बाद, निलंबित कोशिकाओं से युक्त प्लेटों से मीडिया को हटाने और एक अलग 15 एमएल चोटीदार ट्यूब में यह प्रत्येक अलग उपचार की उचित उपचार के साथ लेबल समूह के लिए जगह है.
  6. Trypsin का उपयोग कर प्लेट से पक्षपाती कोशिकाओं को अलग करें.
  7. Trypsin का एक परिणाम के रूप में की थाली से उठा लिया कोशिकाओं के बाद, 15 एमएल शांकव में रखा मीडिया महाप्राण (व्यंजन)5.4 चरण में अल ट्यूब और यह जगह वापस trypsin निलंबित कोशिकाओं के साथ अपने मूल प्लेटों में.
  8. इलेक्ट्रॉनिक विंदुक भराव और सीरम वैज्ञानिक pipettes, trypsin सेल समाधान के साथ मीडिया मिश्रण और इस मिश्रण को इसी 15 एमएल चोटीदार ट्यूबों में वापस जगह है.
  9. 5 मिनट के लिए 4 पर 600 XG में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस, प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, और पीबीएस में resuspend कोशिकाओं.
  10. 5 मिनट के लिए 600 XG कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, और Annexin वि बाध्यकारी बफर के बारे में 50 से 70 μL साथ में लेबल microfuge ट्यूबों resuspend कोशिकाओं.
  11. 10 माइक्रोन का एक अंतिम एकाग्रता Annexin AlexaFluor (1:50) - 488 (सिग्मा Aldrich, मिसिसॉगा, पर, कनाडा) वी और Hoechst डाई और प्रकाश से सुरक्षित 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  12. निम्नलिखित ऊष्मायन, एक microfuge ट्यूबों के भंवर, सेल मिश्रण का एक खुर्दबीन स्लाइड के लिए 7 से 10 μL जोड़ने के लिए, microscop पर सेल मिश्रण की एक coverslip ज़्यादा जगहई स्लाइड और फ्लोरोसेंट micrographs ले, प्रत्येक दृश्य के लिए दोनों Annexin वी और Hoechst Leica डीएम प्रतिदीप्ति खुर्दबीन औंधा आईआरबी पर 400x बढ़ाई (Leica माइक्रोसिस्टम्स, Wetzlar, जर्मनी), छवियों. शेष microfuge ट्यूब में से प्रत्येक में प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूना के लिए दोहराएँ.

6. सेल व्यवहार्यता के लिए पानी में घुलनशील Tetrazolium नमक (WST-1) परख

  1. संगामी T75 कुप्पी या 10 सेमी MCF7 के ऊतक संस्कृति डिश, एसएच SY5Y, या एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में NFF कोशिकाओं Trypsinize.
  2. के बाद कोशिकाओं को हटा लिया गया है, trypsin मीडिया की 5 से 10 एमएल जोड़ने के लिए और एक 15 एमएल चोटीदार ट्यूब में मीडिया सेल निलंबन जगह है.
  3. 5 मिनट के लिए 600 XG कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, जैव सुरक्षा कैबिनेट में ट्यूब जगह वापस करने के लिए, प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, और मीडिया सेल गोली आकार पर निर्भर करता है के बारे में 1 से 3 एमएल में कोशिकाओं resuspend.
  4. एक microfuge ट्यूब में सेल निलंबन की जगह 10 μL, 10 Trypan ब्लू डाई (एस μL जोड़नेigma - Aldrich, मिसिसॉगा, पर, कनाडा), और micropipette साथ मिश्रण.
  5. एक रुधिरकोशिकामापी (Hausser वैज्ञानिक, संयुक्त राज्य अमेरिका) पर Trypan ब्लू निलंबित कोशिकाओं के 10 μL लोड, कोशिकाओं की गिनती, और मूल 15 एमएल चोटीदार ट्यूब में सेल निलंबन की कोशिकाओं की एकाग्रता की गणना.
  6. इस एकाग्रता का उपयोग करने के लिए मूल सेल 1.5 x 10 5 MCF7 और एसएच SY5Y के और एक्स 5.0 10 NFF चढ़ाना के लिए आवश्यक कोशिकाओं के लिए 4 के लिए / कोशिकाओं एमएल की सांद्रता के साथ पतला सेल निलंबन बनाने की जरूरत निलंबन की मात्रा निर्धारित करने के लिए.
  7. 15 थाली करने के लिए पतला सेल निलंबन का उपयोग 10 एक्स MCF7 3 या एसएच SY5Y कोशिकाओं / अच्छी तरह से या 5.0 x 10 3 NFF कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से स्पष्ट नीचे टिशू कल्चर प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए पतला सेल निलंबन की μL 100 जोड़कर. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ रातोंरात 2 कोशिकाओं को सेते हैं.
  8. 72 घंटे के लिए 1 JCTH-4 माइक्रोन और 10 माइक्रोन टीएएम दोनों अकेले और संयोजन में एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में साथ कोशिकाओं का इलाजके लिए MCF7 और NFF कोशिकाओं, और एसएच SY5Y कोशिकाओं के लिए 48 घंटे के लिए है.
  9. इलाज और दवाओं के ऊष्मायन के बाद, 10 की μL जोड़ने WST 1 प्रत्येक अच्छी तरह से (Roche अनुप्रयुक्त विज्ञान, इंडियानापोलिस, में, संयुक्त राज्य अमेरिका) अभिकर्मक और 37 में 4 घंटे के लिए थाली सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  10. एक Wallac विक्टर 3 1420 Multilabel काउंटर (PerkinElmer, वुडब्रिज, पर, कनाडा) पर 450 एनएम absorbance के रीडिंग ले लो और उन्हें को विलायक नियंत्रण समूह के प्रतिशत के रूप में व्यक्त हैं.

7. Tetramethylrhodamine मिथाइल एस्टर धुंधला (TMRM)

  1. 6 अच्छी तरह से स्पष्ट नीचे ऊतक संस्कृति प्लेट और एक 6 एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट की हर अच्छी तरह से में MCF7 कोशिकाओं प्लेट की हर अच्छी तरह से में एक coverslip रखें. उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 को विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. जब कोशिकाओं संगम 60 से 70% तक पहुँचने, 1 JCTH-4 सुक्ष्ममापी 1 मिमी शेयर DMSO में भंग समाधान और 10 माइक्रोन टीएएम एक 10 मिमी स्टॉक DMSO में भंग समाधान का उपयोग कर का उपयोग कर के साथ उन्हें इलाज,दोनों अकेले और संयोजन में एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में.
  3. 37 में aforementioned उपचार के साथ कोशिकाओं को सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 72 घंटे के लिए 5% सीओ 2.
  4. उपचार और दवाओं के साथ कक्षों की ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं के इलाज मीडिया को सीधे Hoechst 33,342 डाई (आण्विक जांच, यूजीन, या, संयुक्त राज्य अमरीका) 10 माइक्रोन का एक अंतिम एकाग्रता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नाभिक tetramethylrhodamine मिथाइल एस्टर (TMRM दाग जोड़ने ) (BRL Gibco, VWR, मिसिसॉगा, पर, कनाडा) 200 एनएम के अंतिम एकाग्रता में.
  5. 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए प्रकाश से सुरक्षित रंगों के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  6. विंदुक एक खुर्दबीन स्लाइड पर मीडिया या पीबीएस की μL 8 और 6 अच्छी तरह से थाली से एक coverslip लेने के और मीडिया या पीबीएस की चिमटी के साथ नीचे की ओर का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ खुर्दबीन स्लाइड पर शीर्ष पर यह जगह.
  7. Leica डीएम आईआरबी औंधा प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ फ्लोरोसेंट micrographs, दोनों Hoechst और प्रत्येक दृश्य के लिए TMRM micrographs, ले लो (Leica माइक्रोसिस्टम्स, Wetzlar, जर्मनी 400x बढ़ाई).

8. Mitochondrial अलगाव

  1. Hypotonic बफर के 10 एमएल (1 मिमी EDTA, 5 मिमी Tris - एचसीएल, 210 मिमी mannitol, 70 मिमी सूक्रोज, 10 माइक्रोन लियू - स्फूर्ति, 10 माइक्रोन पीईपी एक, और 100 माइक्रोन PMSF) और प्रतिक्रिया बफर के बारे में तैयार और दोनों के समाधान रखना बर्फ़ में.
  2. के बारे में 8 से 10 संगामी एसएच SY5Y कोशिकाओं के T75 टिशू कल्चर बोतल के साथ, कोशिकाओं trypsinize, मीडिया जोड़ने के लिए trypsin बेअसर, 50 एमएल चोटीदार ट्यूबों में सेल निलंबन इकट्ठा, और 600 XG पर ट्यूब 4 में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ° सी.
  3. निकालें सतह पर तैरनेवाला और resuspend ठंड पीबीएस के बारे में 10 से 20 एमएल में सेल छर्रों, 5 मिनट के लिए 600 XG पर ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, और इस धोने की प्रक्रिया एक बार फिर दोहराना.
  4. निकालें सतह पर तैरनेवाला और ठंड hypotonic बफर में कोशिकाओं resuspend. कोशिकाओं को स्वयं एक गिलास ऊतक बनाने की मशीन के साथ है और Homogenize 600 XG में 5 मिनट के लिए 4 में सेल lysate अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस

9. Amplex लाल परख

  1. कोशिकाओं से mitochondria के अलग करने के बाद, BSA 1mg/mL के नाम से जाना BioRad प्रोटीन परख (जैव रेड प्रयोगशालाओं, पहलवान, CA के संयुक्त राज्य अमेरिका) के साथ सांद्रता (गोजातीय सीरम albumin) के एक मानक वक्र का उपयोग अलग mitochondria के नमूने के प्रोटीन की एकाग्रता का अनुमान .
  2. अलग mitochondria के समाधान के प्रोटीन की अनुमानित एकाग्रता का उपयोग करना, इस प्रोटीन की 20 μg देने के समाधान की मात्रा की गणना. एक अपारदर्शी 96 अच्छी तरह से थाली के लिए / प्रोटीन अच्छी तरह से 20 μg लोड करने की हर अच्छी तरह से में इस मात्रा को विंदुक.
  3. थाली में प्रतिक्रिया बफर, दवा उपचार (1 माइक्रोन JCTH-4, और / या 10 माइक्रोन टीएएम, या 250 माइक्रोन PQ (सिग्मा Aldrich, मिसिसॉगा, पर अंतिम एकाग्रता के साथ के साथ एक 100 μL की कुल मात्रा के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से भरें , सी) anada एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया), 50 माइक्रोन का एक अंतिम एकाग्रता में Amplex लाल अभिकर्मक, और हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) 6 U/200 μL के अनुपात में (सिग्मा Aldrich, मिसिसॉगा, पर, कनाडा).
  4. एक 2 घंटे की ऊष्मायन के बाद, पूर्व में प्रतिदीप्ति रीडिंग ले. 560 एनएम और एम. एक spectrofluorometer (SpectraMax मिथुन XPS के, आण्विक उपकरण, Sunnyvale, सीए, संयुक्त राज्य अमरीका) पर 590 एनएम.

10. सेलुलर lysate तैयारी

  1. 10 सेमी ऊतक संस्कृति प्लेटों में 60 से 70% के संगम MCF7 कोशिकाओं को विकसित.
  2. 1 JCTH-4 माइक्रोन और 10 माइक्रोन टीएएम अकेले और 72 घंटे के लिए इलाज समूह के लगभग 10 से 15 प्रति प्लेट के साथ संयोजन में के साथ कोशिकाओं का इलाज.
  3. सेल बफर तैयार (7.2 पीएच में 10 मिमी Tris एचसीएल, 5 मिमी KCl, 1 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी EGTA, 1% ट्राइटन-X-100, 10 माइक्रोन लियू - स्फूर्ति, 10 माइक्रोन पीईपी एक, और 100 माइक्रोन PMSF ) 4 पर दुकान और ° सी का उपयोग करें जब तक.
  4. यंत्रवत् एक सेल खुरचनी के साथ थाली सतहों से कोशिकाओं को जगह देना और 50 लेबल में कोशिकाओं को इकट्ठाएमएल चोटीदार ट्यूबों.
  5. 600 XG पर ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, 4 ° सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए ठंडा पीबीएस, अपकेंद्रित्र 600 XG में ट्यूब के बारे में 10 से 20 एमएल में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल छर्रों, हटाने और धोने की प्रक्रिया को दोहराने एक बार.
  6. निकालें सतह पर तैरनेवाला और ठंड सेल बफर में कोशिकाओं resuspend है. कोशिकाओं को स्वयं एक गिलास ऊतक बनाने की मशीन के साथ है और Homogenize 600 XG में 5 मिनट के लिए 4 में सेल lysate अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
  7. छर्रों त्यागें और -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग जब तक सेल lysates की दुकान.

11. वेस्टर्न ब्लाट विश्लेषण

  1. सेल lysates BioRad प्रोटीन परख (जैव रेड प्रयोगशालाओं, पहलवान, CA के संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग कर के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. एसडीएस पृष्ठ और nitrocellulose झिल्ली प्रोटीन हस्तांतरण के लिए प्रोटीन के नमूने विषय.
  2. के बाद हस्तांतरण, एक 5% w / वी दूध TBST (Tris-buffered खारा बीच 20) के 1 घंटे के लिए समाधान के साथ ब्लॉक झिल्ली.
  3. एक चींटी के साथ जांच झिल्लीमैं-LC3 खरगोश में उठाया प्रतिरक्षी (1:500) (Novus बायोलॉजिकल, बिल्ली नहीं NB100 2220, Littleton, CO, संयुक्त राज्य अमेरिका), या एक एंटीबॉडी विरोधी β-Actin माउस (1:1000) (सांताक्रूज में उठाया जैव प्रौद्योगिकी, Inc, बिल्ली. सुप्रीम कोर्ट सं 81,178, Paso Robles, CA, संयुक्त राज्य अमेरिका) 4 में रातोंरात डिग्री सेल्सियस
  4. (1:2000) विरोधी माउस या एक (1:2000) विरोधी खरगोश हॉर्सरैडिश peroxidase संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (Abcam, बिल्ली ab6728 और नहीं के साथ एक 15 मिनट और दो TBST और सेते हैं में 5 मिनट washes के विषय झिल्ली ab6802, कैम्ब्रिज, MA, संयुक्त राज्य अमेरिका) 4 में 1 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस
  5. तीन TBST में लगातार washes के 5 मिनट और बढ़ाया chemiluminescence अभिकर्मक (सिग्मा Aldrich, CPS160, मिसिसॉगा, पर, कनाडा) के साथ प्रोटीन बैंड कल्पना विषय झिल्ली.
  6. Densitometry ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण प्रदर्शन किया.

12. Monodansylcadaverine धुंधला (एमडीसी)

  1. 6 अच्छी तरह से स्पष्ट नीचे ऊतक संस्कृति की थाली और थाली की हर अच्छी तरह से MCF7 कोशिकाओं में एक 6 के प्रत्येक अच्छी तरह से में एक coverslip प्लेसअच्छी तरह से स्पष्ट द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट में नीचे ऊतक संस्कृति थाली. उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 को विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  2. जब कोशिकाओं संगम 60 से 70% तक पहुँचने, 1 JCTH-4 सुक्ष्ममापी 1 मिमी शेयर DMSO में भंग समाधान और 10 माइक्रोन टीएएम के एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा में एक 10 मिमी स्टॉक DMSO में भंग समाधान, दोनों अकेले और संयोजन में उपयोग कर का उपयोग कर के साथ उन्हें इलाज कैबिनेट.
  3. 37 में aforementioned उपचार के साथ कोशिकाओं को सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 72 घंटे के लिए 5% सीओ 2.
  4. इलाज और दवाओं के साथ कोशिकाओं के ऊष्मायन के बाद, सीधे 0.1 मिमी के अंतिम 15 मिनट के लिए एक अच्छी तरह से एकाग्रता Monodansylcadaverine (एमडीसी) (सिग्मा Aldrich, मिसिसॉगा, पर, कनाडा).
  5. 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए प्रकाश से सुरक्षित डाई के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  6. विंदुक एक खुर्दबीन स्लाइड पर मीडिया या पीबीएस की 30 μL और 6 अच्छी तरह से थाली से एक coverslip लेने के और मीडिया या पीबीएस के शीर्ष पर यह कोशिकाओं के साथ खुर्दबीन स्लाइड faci पर जगहचिमटी के साथ एनजी नीचे की ओर.
  7. फ्लोरोसेंट एमडीसी और चरण micrographs ले लो करने के लिए, प्रत्येक दृश्य के लिए साथ Leica डीएम आईआरबी 400x बढ़ाई प्रतिदीप्ति खुर्दबीन (Leica माइक्रोसिस्टम्स, Wetzlar, जर्मनी) उलटा,.

13. प्रतिनिधि परिणाम

मानव स्तन और JCTH-4 Adenocarcinoma neuroblastoma कोशिकाओं में apoptosis के चयनात्मक प्रेरण: टीएएम द्वारा गतिविधि का संवर्धन

विभिन्न कैंसर कोशिकाओं में apoptosis के चयनात्मक शामिल प्राकृतिक PST (छवि 1a) 11-13 द्वारा दिखाया गया था. पीएसटी की कम उपलब्धता की वजह से, हम 7 deoxypancratistatin (JCTH-4, अंजीर 1b) के analogues संश्लेषित है और उन्हें मानव स्तन (MCF7) ग्रंथिकर्कटता और neuroblastoma कोशिकाओं (एसएच SY5Y) में इसी तरह के कैंसर विरोधी गतिविधि के लिए जांच की. प्रयोगों के पहले चरण में, हम साथ JCTH-4 और टीएएम अकेले इलाज के बाद समय पर morphological परिवर्तन की निगरानी और MCF7 कक्ष में संयोजन में करना चाहता थाहै. MCF7 कोशिकाओं 18 घंटे के लिए निगरानी की गई, के रूप में 1 वीडियो चरण विपरीत चित्रों के साथ समय व्यतीत माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्पादित में देखा, 48 घंटे के लिए विलायक उपचार (नियंत्रण) के साथ, इन कोशिकाओं morphology में कोई बड़ा परिवर्तन का प्रदर्शन किया. इसके विपरीत, 1 माइक्रोन उपचार JCTH-4 के 48 घंटे के बाद, इन कोशिकाओं रूपात्मक सिकुड़न जैसे apoptosis के साथ जुड़े परिवर्तन का प्रदर्शन किया, blebbing, apoptotic शरीर के गठन के रूप में 2 वीडियो में देखा. दूसरी ओर, टीएएम उपचार MCF7 कोशिकाओं में अकेले एक बहुत अलग कबरा भोजी (3 वीडियो) के साथ जुड़े autophagosomes का संकेत inclusions सहित आकारिकी का उत्पादन किया. बहुत कम से कम apoptotic आकारिकी मनाया गया था और कोशिकाओं को आम तौर पर स्वस्थ आकारिकी विलायक MCF7 कोशिकाओं का इलाज नियंत्रण करने के लिए तुलनीय प्रदर्शन किया. दिलचस्प है, टैम की उपस्थिति में, JCTH-4 द्वारा apoptotic प्रेरण काफी के रूप में illustrat के रूप में 48 घंटे के बाद MCF7 कोशिकाओं में वृद्धि apoptotic morphology ने संकेत दिया बढ़ाया गया थाएड में 4 वीडियो.

प्रयोगों के दूसरे चरण में हम फ्लोरोसेंट रंजक उपयोग apoptosis के शामिल होने का मूल्यांकन करने के लिए. 72 घंटे और 48 घंटे के MCF7 और एसएच SY5Y कोशिकाओं क्रमशः में 1 माइक्रोन JCTH. 4 उपचार के बाद, Hoechst डाई का इस्तेमाल किया गया था और परमाणु आकारिकी की निगरानी. परिणाम गाढ़ा, चमकते दाग MCF7 और एसएच SY5Y कोशिकाओं, apoptotic शामिल का संकेत (छवि 2a, ख) में apoptotic निकायों द्वारा साथ नाभिक संकेत दिया. टीएएम अकेले उपचार MCF7 और एसएच-SY5Y कोशिकाओं में कम से कम apoptotic परमाणु आकारिकी झुकेंगे, नाभिक Hoechst विलायक नियंत्रण समूह (छवि 2a, ख) के लिए तुलनीय के साथ बड़े, गोल, और dimly दाग थे. 4 वीडियो, MCF7 की नाभिक और एसएच SY5Y कोशिकाओं के साथ समझौते में 72 घंटे के बाद संयोजन उपचार (2a छवि, ख) के साथ apoptotic morphology में उल्लेखनीय वृद्धि का प्रदर्शन किया.

के apoptotic प्रेरण सत्यापित, सेल पी के लिए मूल्यांकन किया गयाhosphatidylserine बाह्यीभवन, एक Annexin वी बाध्यकारी 17 परख के माध्यम से apoptosis के लिए एक मार्कर,. MCF7 और एसएच SY5Y कोशिकाओं क्रमश: 72 और 48 घंटे के लिए इलाज 1 अकेले JCTH-4 माइक्रोन के साथ और 10 माइक्रोन टीएएम के साथ संयोजन में Annexin वी बाइंडिंग के लिए सकारात्मक थे, हरी प्रतिदीप्ति ने संकेत दिया, apoptosis के शामिल होने (चित्र 3a, ख की पुष्टि ). Phosphatidylserine का कोई स्पष्ट बाह्यीभवन है के MCF7 में मनाया गया और एसएच SY5Y कोशिकाओं टीएएम के साथ अकेले इलाज किया, के रूप में NFF 72 घंटे के बाद सभी aforementioned उपचार समूह (छवि -3 सी) के साथ इलाज किया कोशिकाओं में. इसलिए, अकेले और टीएएम साथ संयोजन में JCTH-4 चुनिंदा MCF7 और एसएच SY5Y कोशिकाओं में apoptosis लाती है.

अकेले JCTH-4 का प्रभाव मात्रा ठहराना और टीएएम के साथ संयोजन में, एक WST 1 सेल व्यवहार्यता, सक्रिय सेल चयापचय की एक सूचक है, के लिए आधारित वर्णमिति परख MCF7 पर प्रदर्शन किया था और 72 घंटे और एसएच SY5Y कोशिकाओं के लिए NFF कोशिकाओं का इलाज किया इलाज 48 घंटे के लिए.विलायक नियंत्रण समूहों की तुलना में, 50% से अधिक द्वारा 1 माइक्रोन JCTH-4 सक्रिय सेल चयापचय की कमी हुई, जबकि 10 माइक्रोन टीएएम अकेले दोनों MCF7 और में एसएच SY5Y कोशिकाओं (छवि 4a, ख) में कोई महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शन किया. दिलचस्प MCF7 और एसएच SY5Y कोशिकाओं में टैम की JCTH-4 अपमान के अलावा सेल चयापचय में एक synergistic कमी के परिणामस्वरूप. NFF कोशिकाओं काफी कम टीएएम (छवि 4c) के साथ दोनों JCTH 4 अकेले और JCTH के-4 के प्रति संवेदनशील थे. इसलिए, JCTH 4 MCF7 और एसएच SY5Y कोशिकाओं में टीएएम के साथ चयनात्मक synergistic गतिविधि को दर्शाता है.

JCTH-4 के mitochondrial लक्ष्य निर्धारण

अगर JCTH-4 mitochondria के लक्षित कर रहा है पूरे पृथक के mitochondria में ROS पीढ़ी की कोशिकाओं में apoptosis mitochondrial झिल्ली संभावित प्रेरित नजर रखी थी. MCF7 कोशिकाओं को 72 घंटे के लिए इलाज किया गया और TMRM साथ दाग. 1 माइक्रोन JCTH-4 एमएमपी, लाल प्रतिदीप्ति (छवि 5a) के नुकसान से संकेत की कमी हुई. हालांकि, वें के साथ10 माइक्रोन टीएएम की ई इसके अलावा, मिशन मोड परियोजना के एक अधिक से अधिक अपव्यय मनाया गया था, जबकि 10 माइक्रोन टीएएम अकेले एमएमपी पर कोई स्पष्ट प्रभाव था.

के रूप में बढ़ जाती है ROS पीढ़ी mitochondrial झिल्ली permeabilization के और apoptosis के शामिल करने के लिए संबद्ध किया गया है, ROS के उत्पादन Amplex एसएच SY5Y 1 JCTH 4 और 10 माइक्रोन टीएएम, अकेले माइक्रोन के साथ इलाज किया कोशिकाओं से अलग mitochondria में लाल डाई के साथ और 18 संयोजन में मूल्यांकन किया गया था -20. प्रतिदीप्ति रीडिंग सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFU) के रूप में व्यक्त किया गया. ROS पीढ़ी में वृद्धि JCTH-4 और अकेले टीएएम (छवि 5 ब) के साथ मनाया गया. दिलचस्प है, संयोजन उपचार ROS के उत्पादन में एक बड़ी वृद्धि झुकेंगे. Mitochondria में ROS के उत्पादन के एक प्रसिद्ध inducer, PQ, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया गया था.

भोजी के द्वारा की प्रेरण JCTH-4 और टीएएम

Autophagic शामिल कई विभिन्न यौगिकों द्वारा किया गया है chemotherapeutic अपमान से जुड़े (6a छवि) के साथ इलाज किया कोशिकाओं में मौजूद था. विशेष रूप से, एमडीसी धुंधला की तीव्रता संयोजन उपचार, अकेले टीएएम द्वारा पीछा किया, और अकेले JCTH-4 के साथ सबसे बड़ा था.

दौरान भोजी, microtubule-जुड़े प्रोटीन 1 प्रकाश 3 श्रृंखला (LC3) आम तौर पर cytosol (LC3-I) में स्थित, phosphatidylethanolamine के साथ lipidated है और बाद में autophagosomal (LC3 द्वितीय) झिल्ली 2 के लिए स्थानीयकृत. भोजी के शामिल होने की पुष्टि, LC3-II के स्तर MCF7 पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के माध्यम से 72 घंटे के लिए इलाज किया कोशिकाओं में मूल्यांकन किया गया. 1 माइक्रोन JCTH-4 थोड़ा LC3-II LC3 मैं रूपांतरण प्रेरित किया, जबकि 10 माइक्रोन टीएएम एक बड़ा autophagic प्रतिक्रिया का उत्पादन (छवि) 6b. दिलचस्प है, संयोजन उपचार भोजी की सबसे बड़ी प्रेरण में, LC3 मैं 3 से अधिक अनुपात के लिए एक LC3-II उपज. इसलिए, इन परिणामों के संयोजन उपचार के साथ कोशिकाओं में सबसे बड़ी प्रतिक्रिया के साथ JCTH-4 और टीएएम अकेले और संयोजन में MCF7 कोशिकाओं में autophagic प्रेरण दिखाना है.

पूरक 1 वीडियो MCF7 विलायक नियंत्रण के साथ इलाज किया कोशिकाओं के सेलुलर morphology. MCF7 कोशिकाओं के बीच 48 और 66 घंटे के बाद विलायक नियंत्रण (DMSO) उपचार चरण विपरीत चित्र के साथ समय व्यतीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग निगरानी की गई. कोशिकाओं 37 में बनाए रखा गया डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. छवियाँ 400x बढ़ाई पर कब्जा कर लिया गया. यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के लिए .

पूरक 2 वीडियो MCF7 JCTH-4 के साथ इलाज किया कोशिकाओं में apoptotic सेलुलर आकारिकी की प्रेरण. 48 और 66 घंटे इलाज के बाद बुद्धि के बीच MCF7 कोशिकाओं निगरानी की गईघंटे 1 माइक्रोन JCTH 4 चरण विपरीत चित्रों के साथ समय व्यतीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग. कोशिकाओं 37 में बनाए रखा गया डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. छवियाँ 400x बढ़ाई पर कब्जा कर लिया गया. यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के लिए .

पूरक 3 वीडियो टीएएम साथ इलाज MCF7 कोशिकाओं में autophagic सेलुलर आकारिकी की प्रेरण. MCF7 कोशिकाओं के बीच 48 और 10 माइक्रोन चरण विपरीत चित्रों के साथ समय व्यतीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग टीएएम साथ 66 घंटे इलाज के बाद निगरानी की गई. कोशिकाओं 37 में बनाए रखा गया डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. छवियाँ 400x बढ़ाई पर कब्जा कर लिया गया. यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के लिए .

पूरक 4 वीडियो MCF7 कोशिकाओं में टीएएम के साथ बढ़ी JCTH-4 द्वारा apoptotic morphology. MCF7 कोशिकाओं के बीच 48 और 66 घंटे इलाज के बाद दोनों 1 माइक्रोन JCTH-4 और 10 माइक्रोन टीएएम चरण cont के साथ समय व्यतीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग के साथ निगरानी की गईरास्ट चित्रों. कोशिकाओं 37 में बनाए रखा गया डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. छवियाँ 400x बढ़ाई पर कब्जा कर लिया गया. यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने के लिए .

चित्रा 1
चित्रा 1 पीएसटी स्ट्रक्चरल एक कृत्रिम अनुरूप 7 डिओक्सी की तुलना (एक) pancratistatin की रासायनिक संरचना (पीएसटी) (ख) जे.सी. - TH-एसीटेट 4 (JCTH 4) की रासायनिक संरचना.

चित्रा 2
आंकड़ा 2. JCTH-4 टीएएम के साथ बढ़ाया गतिविधि के साथ परमाणु apoptotic morphology लाती है. के परमाणु आकारिकी (क) MCF7 और (ख) एसएच SY5Y कोशिकाओं को क्रमशः 72 और 48 घंटे के लिए टैम के संकेत सांद्रता और Hoechst डाई साथ JCTH-4 दाग के साथ इलाज. नियंत्रण समूह (विलायक डी के साथ इलाज किया गयाएमएसओ). छवियाँ एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर 400x बढ़ाई ले जाया गया. पैमाने बार = 15 माइक्रोन.

चित्रा 3
चित्रा 3. JCTH-4 कारण बाह्यीभवन phosphatidylserine अकेले और संयोजन में चुनिंदा कैंसर की कोशिकाओं में टीएएम के साथ. Annexin externalized phosphatidylserine बाध्यकारी वी (क) MCF7 (72 घंटे), (ख) (48 घंटे) एसएच SY5Y, और (ग) NFF कोशिकाओं (72 घंटे) JCTH-4 के साथ इलाज में apoptosis के शामिल के शामिल होने की पुष्टि करने के लिए मूल्यांकन किया गया था और टीएएम संकेत सांद्रता पर. नियंत्रण समूह विलायक (DMSO) के साथ इलाज किया गया. छवियाँ एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर 400x बढ़ाई ले जाया गया. पैमाने बार = 15 माइक्रोन.

चित्रा 4
चित्रा 4. टीएएम JCTH-4 चुनिंदा कैंसर की कोशिकाओं में व्यवहार्यता की कमी को बढ़ाती है. 96 अच्छी तरह प्लेटें वरीयता प्राप्त वाईवें (एक) MCF7, (ख) एसएच SY5Y, और (ग) NFF कोशिकाओं और JCTH-4 और संकेत सांद्रता में टीएएम के साथ इलाज किया. MCF7 और NFF कोशिकाओं के 72 घंटे के लिए इलाज किया गया और एसएच SY5Y 48 घंटे के लिए इलाज किया गया. दवा उपचार और ऊष्मायन, WST-1 अभिकर्मक एक अच्छी तरह से जोड़ा गया है, और 450 एनएम absorbance के रीडिंग ले जाया गया और नियंत्रण का एक प्रतिशत (DMSO) के रूप में व्यक्त की है. सांख्यिकी GraphPad चश्मे संस्करण 5.0 का उपयोग प्रदर्शन किया गया. मान ± 3 स्वतंत्र प्रयोगों की quadruplicates से एसडी मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. MCF7: * पी ​​<.001, ** पी <0.0001 नियंत्रण बनाम, पी <0.05 की तुलना में 1 माइक्रोन JCTH-4, † पी की टीएएम <0.0001 बनाम 10 माइक्रोन. एसएच SY5Y: * p <नियंत्रण बनाम .०,००५, पी <.005 बनाम 1 माइक्रोन JCTH-4, † पी <.005 बनाम 10 माइक्रोन टीएएम. JCTH NFF: * पी ​​<.005 बनाम 10 माइक्रोन + टीएएम MCF7 कोशिकाओं में 1 माइक्रोन JCTH-4, पी <.01 बनाम 10 माइक्रोन टीएएम + 1 माइक्रोन -4 एसएच SY5Y कोशिकाओं में.

चित्रा 5
चित्रा 5 JCTH-4 और mitochondria पर टीएएम अधिनियम. (क) coverslips पर MCF7 कोशिकाओं बड़े हो रहे थे और दवाओं के संकेत सांद्रता के साथ इलाज किया और 72 घंटे के लिए TMRM साथ दाग एमएमपी का मूल्यांकन करने के लिए. नियंत्रण समूह की कोशिकाओं विलायक (DMSO) के साथ इलाज किया गया. छवियाँ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर 400x बढ़ाई पर कब्जा कर लिया गया. पैमाने बार = 15 माइक्रोन. (ख) पृथक एसएच SY5Y कोशिकाओं से mitochondria JCTH-4 और टीएएम के साथ संकेत सांद्रता में इलाज किया गया और ROS उत्पादन हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) की उपस्थिति में Amplex लाल सब्सट्रेट के साथ मूल्यांकन किया गया था. नियंत्रण समूह कोशिकाओं विलायक (DMSO) के साथ इलाज किया गया. Paraquat (PQ) 250 माइक्रोन की एकाग्रता में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. प्रतिदीप्ति रीडिंग पूर्व में उपचार के 2 घंटे के बाद प्राप्त किया गया. 560 एनएम और एम. 590 एनएम और रिश्तेदार fluorescenc के रूप में व्यक्तई इकाइयों (RFU). सांख्यिकी GraphPad चश्मे संस्करण 5.0 का उपयोग प्राप्त किया गया. डेटा इसी तरह के रुझान के साथ 3 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि है. मान ± 1 स्वतंत्र प्रयोग के quadruplicates का मतलब एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. * पी <0.05, पी ** <.005, *** <0.001 नियंत्रण बनाम पी, पी <0.05 की तुलना में 1 माइक्रोन JCTH-4, † पी <0.05 बनाम 10 माइक्रोन टीएएम, @ PQ पी <0.05 बनाम 250 माइक्रोन.

चित्रा 6
आंकड़ा 6. टीएएम JCTH 4 autophagic प्रेरण को बढ़ाती है (क) MCF7 कोशिकाओं coverslips पर बड़े हो रहे थे और 72 घंटे के लिए संकेत सांद्रता में JCTH-4 और टीएएम अपमान अधीन है. नियंत्रण समूह कोशिकाओं विलायक (DMSO) के साथ इलाज किया गया. उपचार पोस्ट, MCF7 कोशिकाओं को एमडीसी साथ दाग रहे थे लिए autophagic vacuoles का पता लगाने. छवियाँ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर 400x बढ़ाई पर कब्जा कर लिया गया. पैमाने बार = 15 माइक्रोन. (ख) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के LC3 और β-Actin के लिए MCF7 72 घंटे के लिए दवाओं का संकेत सांद्रता के साथ इलाज किया कोशिकाओं के सेल lysates पर किए गए. Densitometric विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मार डाला गया. सांख्यिकी GraphPad चश्मे संस्करण 5.0 का उपयोग प्रदर्शन किया गया. मान ± एसडी मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. * पी <0.05 पी ** <.005, पी. *** <.०,००५ बनाम नियंत्रण, पी <.001 बनाम 1 माइक्रोन JCTH-4, † पी <.001 बनाम 10 माइक्रोन टीएएम.

लघुरूप की सूची.

ईआर एस्ट्रोजन रिसेप्टर
FMN पीला रंग mononucleotide
JCTH - 4 जे.सी. - TH-एसीटेट-4
LC3 microtubule जुड़े प्रोटीन 1 प्रकाश 3 श्रृंखला
एमडीसी monodansylcadaverine
एमएमपी mitochondrial झिल्ली की क्षमता
मलेरिया अनुसंधान केंद्र mitochondrial सांस श्रृंखला
NFF सामान्य मानव भ्रूण fibroblast
PQ Paraquat
पीएसटी pancratistatin
RFU रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाइयों
आरओएस प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों
टीएएम tamoxifen
TMRM tetramethylrhodamine मिथाइल एस्टर

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Discussion

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पीएसटी और इसी तरह यौगिकों विरोधी कैंसर गुण 11-15,21 है दिखाया गया है. हम पहले से प्राकृतिक पीएसटी को सूचित किया है mitochondria के कैंसर की कोशिकाओं को, जो जिससे apoptogenic 12,14 कारकों की रिहाई से apoptosis लाती में चुनिंदा अस्थिर. यह सबसे अधिक संभावना है कि JCTH 4 एक ही व्यवस्था के माध्यम से कार्य करता है, JCTH-4 के रूप में TMRM धुंधला (छवि 5a) के साथ देखा है, और अलग mitochondria के में एसएच SY5Y कोशिकाओं से ROS के पीढ़ी बढ़ MCF7 कोशिकाओं में एमएमपी पतन का कारण (छवि ) 5 ब, mitochondrial रोग का संकेत है. इस प्रकार, apoptosis के JCTH-4 से शामिल कैंसर की कोशिकाओं में mitochondrial लक्ष्यीकरण के माध्यम से सबसे शायद है.

जो कैंसर चयनात्मकता के लिए आधार रूप में JCTH-4 से सेवा कर सकता है noncancerous और कैंसर की कोशिकाओं के बीच कई मतभेद मौजूद हैं. कैंसर की कोशिकाओं को अत्यधिक ग्लाइकोलाइसिस पर निर्भर है और ऊर्जा उत्पादन के लिए mitochondria पर कम कर रहे हैं, इस घटना के लिए संदर्भित किया जाता हैवारबर्ग 22 प्रभाव है. कैंसर की कोशिकाओं में इस तरह के चयापचय गतिविधि cytosol में उच्च अम्लता के लिए होता है. नतीजतन, अम्लीय साइटोसोलिक पर्यावरण कैंसर सेल के mitochondria hyperpolarization है जो एक बढ़ाया आक्रमण और 23 apoptosis को बचना करने की क्षमता से जोड़ा गया है योगदान देता है. कैंसर के mitochondria सेल की hyperpolariztion JCTH - 4 कमजोर कैंसर कोशिकाओं को प्रस्तुत करना सकता है, एक बार सेल में रखा, JCTH-4 एंजाइमी प्रसंस्करण के माध्यम से एक सकारात्मक चार्ज के अधिग्रहण और चुनिंदा उनके hyperpolarized प्रकृति के कारण कैंसर के mitochondria सेल में रखा जा सकता है हो सकता है. इसके अलावा, mitochondria के जुड़े antiapoptotic प्रोटीन की एक सरणी के लिए अत्यधिक कि mitochondrial झिल्ली permeabilization के और 24-26 प्रोटीन बीसीएल -2 परिवार के antiapoptotic प्रोटीन के रूप में apoptosis के बाद निष्पादन को प्रतिबंधित कैंसर की कोशिकाओं में व्यक्त होना दिखाया गया है.

सेलुलर तनाव के विभिन्न रूपों की उपस्थिति में, भोजी के रूप में शुरू हो रहा हैएक प्रतिक्रिया समर्थक अस्तित्व, कोशिकाओं को प्रतिकूल परिस्थितियों के तहत 2 जीवित रहने के लिए अनुमति देता है. इस मार्ग की उत्तेजना के दौरान, तथापि, महत्वपूर्ण intracellular autophagic कोशिका मृत्यु 3 से जन्म देने के घटकों के व्यापक टूटने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. दोनों अस्तित्व के समर्थक और समर्थक मौत autophagic प्रतिक्रियाओं को chemotherapeutic 3 अपमान करने के लिए संबद्ध किया गया है. Oxidative तनाव के लिए अग्रणी JCTH-4 द्वारा mitochondrial रोग एक स्वचालित डिफ़ॉल्ट autophagic प्रतिक्रिया ट्रिगर सकता है. वास्तव में हम उपचार JCTH-4 (छवि 2a, ख 3a, ख 6a, ख) के साथ apoptosis के साथ साथ कुछ autophagic शामिल निरीक्षण किया. हालांकि टीएएम अच्छी तरह ईआर सकारात्मक स्तन कैंसर की कोशिकाओं में एक ईआर विरोधी के रूप में स्थापित किया गया है, यह हाल ही में किया गया है mitochondria, परिसर मैं 10 FMN साइट के लिए बाध्य के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया. इसके अलावा, टीएएम कई कैंसर सेल 3 प्रकार भर में एक अच्छी तरह से ज्ञात भोजी की inducer है. दरअसल, टीएएम अलग mitoch में ROS पीढ़ी में वृद्धि का कारण थाondria (छवि 5b). हालांकि, इस तरह की बातचीत के लिए अपर्याप्त हो एमएमपी (छवि 5a) पतन, लेकिन एक विशिष्ट समर्थक उत्तरजीविता autophagic प्रतिक्रिया के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त कारण साबित हुआ. व्यापक autophagic प्रेरण जब JCTH-4 और टीएएम (6a छवि, ख) के संयोजन में इस्तेमाल किया गया, जो एक बढ़ाया साइटोटोक्सिक (छवि 4a, ख) प्रतिक्रिया, समर्थक मौत autophagic प्रतिक्रिया के विचारोत्तेजक के साथ मनाया गया, फिर भी, कैंसर की कोशिकाओं के अंत में apoptosis से मरने mitochondrial permeabilization और apoptogenic कारक रिहाई का एक परिणाम के रूप में. टीएएम द्वारा अपमान JCTH-4 के लिए इस तरह के संवेदीकरण टीएएम द्वारा ROS पीढ़ी में वृद्धि करने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है. क्योंकि दोनों टीएएम और JCTH-4 oxidative तनाव उत्पन्न करने में सक्षम हैं, दोनों यौगिकों के साथ इस तरह के तनाव के मिश्रित उत्पादन व्यापक autophagic एक हानिकारक autophagic प्रतिक्रिया और / या व्यापक mitochondrial permeabilization और बाद में apoptosis के जन्म देने के शामिल करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. गुउपचार है संयुक्त noncancerous fibroblasts (छवि 4c) की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है. इन नतीजों से संकेत मिलता है कि अकेले और टीएएम साथ संयोजन में JCTH-4 कुशलता से इस्तेमाल किया जा सकता है लिए noncancerous कोशिकाओं पर प्रतिकूल प्रभाव के कारण के बिना स्तन कैंसर और neuroblastoma के इलाज.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम के शूरवीरों कोलंबस अध्याय 9671 (विंडसर, ओंटारियो), और एक CIHR फ्रेडरिक Banting और चार्ल्स सर्वश्रेष्ठ कनाडा ग्रेजुएट डेनिस माँ के लिए सम्मानित किया गया छात्रवृत्ति के द्वारा समर्थित किया गया है. आप उनकी सहायता के लिए समय चूक माइक्रोस्कोपी साथ रॉबर्ट हॉज और एलिजाबेथ Fidalgo डा सिल्वा के लिए धन्यवाद. आप से केटी Facecchia तक समय चूक माइक्रोस्कोपी वीडियो संपादन के लिए धन्यवाद. हम भी इस पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए Sudipa जून चटर्जी और फिलिप Tremblay धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम केविन Couvillon जो 2010 में कैंसर के खिलाफ अपनी लड़ाई हार की स्मृति में समर्पित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SH-SY5Y cell line ATCC CRL-2266
Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM Sigma-Aldrich 51448C
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16000-044
MCF7 cell line ATCC HTB-22
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R 0883
Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) Coriell Institute for Medical Research AG04431B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30022.01
Tamoxifen citrate salt Sigma-Aldrich T9262
35 mm glass bottom culture dishes MatTek Corp. P35G-014-C
Leica DMI6000 B inverted microscope Leica Microsystems N/A
H–chst 33342 dye Molecular Probes, Life Technologies H3570
Leica DM IRB inverted fluorescence microscope Leica Microsystems N/A
Annexin V AlexaFluor-488 Invitrogen A13201
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-20ML
Haemocytometer Fisher Scientific 267110
WST-1 reagent Roche Group 11644807001
Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter PerkinElmer, Inc. 1420-011
Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) GIBCO, by Life Technologies T-668
Glass tissue grinder Fisher Scientific K8885300-0002
BioRad protein assay Bio-Rad 500-0001Bottom of Form
Amplex Red Invitrogen A12222
Horseradish peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8125
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices 3126666
Anti-LC3 antibody raised in rabbit Novus Biologicals NB100-2220
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6728
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6802
Chemiluminescence peroxidase substrate Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

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Apoptotic और autophagic प्रेरण के एक उपन्यास सिंथेटिक मानव स्तन adenocarcinoma और Tamoxifen साथ neuroblastoma कोशिकाओं में सी 1 7 deoxypancratistatin के अनुरूप द्वारा संवर्धन
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Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).More

Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).

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