Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Повышение апоптоза и Autophagic после индукции Новые синтетические C-1 Аналог 7-deoxypancratistatin в человеческой аденокарциномы молочной железы и клетки нейробластомы с Тамоксифен

doi: 10.3791/3586 Published: May 30, 2012

Summary

Мы синтезировали новый аналог pancratistatin с сопоставимыми противораковой активностью, как родной pancratistatin, интересно, комбинаторного лечения тамоксифеном дало резкое повышение в апоптозе и autophagic индукции митохондриальной ориентации с минимальным влиянием на доброкачественные фибробластов. Таким образом, JCTH-4 в сочетании с тамоксифена может обеспечить безопасное противораковой терапии.

Abstract

Рак молочной железы является одной из самых распространенных видов рака среди женщин в Северной Америке. Многие современные анти-лечения рака, в том числе ионизирующих излучений, индуцируют апоптоз через повреждения ДНК. К сожалению, такое лечение неселективными для раковых клеток и производят аналогичные токсичность в нормальных клетках. Мы сообщили селективной индукции апоптоза в раковых клетках естественным pancratistatin соединения (PST). В последнее время новые PST аналог, C-1 ацетоксиметил производных 7-deoxypancratistatin (JCTH-4), был произведен синтез заново, и это показывает сопоставимые избирательную активность вызывающих апоптоз в нескольких линиях раковых клеток. В последнее время аутофагии был вовлечен в злокачественные опухоли и как про-выживания и про-смерть механизмов в ответ на химиотерапию. Тамоксифен (TAM) неизменно продемонстрировала индукции про выживания аутофагии в многочисленных раковых заболеваний. В данном исследовании эффективность JCTH-4 отдельно и в сочетании с ТАМ, чтобы вызвать гибель клеток в человеческом cance грудиг (MCF7) и нейробластомы (SH-SY5Y) клеток оценивали. ТАМ только индуцированные аутофагии, но незначительная гибель клеток, тогда как JCTH-4 только нанесен значительный индукции апоптоза с некоторыми индукции аутофагии. Интересно, что комбинаторная лечение дало резкое увеличение апоптоза и autophagic индукции. Мы следили зависящих от времени морфологические изменения в клетках, подвергающихся MCF7 ТАМ-индуцированной аутофагии, JCTH-4-индуцированного апоптоза и аутофагии и ускоренной гибели клеток с комбинаторной лечения с использованием замедленной микроскопии. Мы показали этих соединений индуцировать апоптоз / аутофагии по митохондриальной таргетинга в этих раковых клеток. Важно отметить, что эти процедуры не влияют на выживание доброкачественные человеческие фибробласты. Таким образом, эти результаты показывают, что JCTH-4 в сочетании с ТАМ может быть использован в качестве безопасной и очень мощным анти-раковой терапии против рака молочной железы и клетки нейробластомы.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Введение

Апоптоз, или введите я запрограммированная смерть клетки, представляет собой физиологический процесс, который может работать внешне, через связывание лигандов смерти к смерти рецептором, или внутренне. Внутренние пути апоптоза инициируется внутриклеточных стресса, таких как повреждение ДНК и митохондриальная дисфункция, это в конечном итоге приводит к пермеабилизации митохондрий, диссипации митохондриального мембранного потенциала (ММП), выпуск апоптогенное факторов с митохондриальной пространство межмембранного и последующего выполнения апоптоза 1.

Аутофагия это процесс, в котором клетки-брейки, деградирует, и перерабатывает свои внутриклеточных компонентов, сохраняя при этом целостность плазматической мембраны, она вызвана различными типами клеточных стрессов, включая окислительный стресс, гипоксия, белковых агрегатов, питательные лишения, лишение фактор роста, и поврежденных органелл 2. На начальных этапахэтого процесса, цитозольной материал охвачен autophagosomes дважды membraned пузырьки, которые сливаются в лизосомы сформировать autolysosomes. Сообщение лизосомальных синтеза, цитозольной материалы, ранее рассмотрен autophagosomes разлагаются под действием лизосомальных ферментов 2. Обширные активации этого пути дает обширный деградацию внутриклеточных компонентов, которые могут привести к гибели клеток autophagic или типа II запрограммированной клеточной смерти 3.

Уклонение от гибели клеток считается одним из признаков рака 4. Рак это болезнь, характеризуется неконтролируемым ростом клеток и распространение 5. В частности, нейробластома возникает из развивающихся нервных клеток симпатической нервной системы, из нервного гребня 6. Это наиболее распространенный солидных опухолей, происходящих у детей раннего возраста, что составляет около 9% всех раковых заболеваний у детей 7. Хотя значительный прогресс был достигнут на сегодняшний день, это заболевание остается проблематичнымкак основной ученых и клиницистов. С другой стороны, рак молочной железы является наиболее распространенным видом рака среди женщин 8. Тамоксифен (TAM) неоднократно использовались для терапии гормон аспекты рака молочной железы в качестве рецептора эстрогена (ER) антагонист 9. Тем не менее, другие отчеты свидетельствуют о дополнительных независимых механизмов индукции апоптоза TAM. В частности, ТАМ взаимодействует со сложной Я в дыхательной цепи митохондрий (MRC) на своем флавинмононуклеотида (ФМН) место 10.

PST это природное соединение, выделенный из растения Hymenocallis littoralis. Контрастные от многих химиотерапии используется в настоящее время, было показано, вызывают апоптоз, не в генотоксического образом, избирательно в различных типах клеток рака через митохондриальную ориентации 11-15. Тем не менее, доклинических и клинических работ препятствуют ее доступности, он присутствует в очень малых количествах в естественных источников и многие complicфлуктуации бремя его химического синтеза. Мы синтезировали и скрининг синтетических аналогов 7-deoxypancratistatin и наблюдал подобные противораковой активностью в С-1 ацетоксиметил производной, JC-TH-ацетат-4 (JCTH-4) 16. Теперь у нас в руках синтетический аналог PST с мощной противораковой активностью. Его синтез был стандартизирован и может быть расширена, чтобы произвести достаточное количество для проведения доклинических и клинических работ. Поскольку природные PST и ТАМ как цель митохондриях, было бы интересно изучить совместное действие синтетического аналога PST на человеческий рак молочной железы и клетки нейробластомы в сочетании с TAM.

Здесь мы сообщаем селективной цитотоксичности JCTH-4 в человеческой нейробластомы (SH-SY5Y) и аденокарциномы молочной железы (MCF7) клеток. JCTH-4 был способен индуцировать апоптоз в обеих клеточных линий митохондриальной таргетинг; JCTH-4 вызваны диссипацией ПММ и увеличение активных форм кислорода (АФК) производства в отдельных mitochondria из этих раковых клеток. Кроме того, аутофагии было вызвано JCTH-4 в MCF7 клеток. Интересно, что добавление к JCTH ТАМ-4 оскорбление усиливается вышеупомянутыми последствиями JCTH-4 SH-SY5Y и MCF7 клеток. Морфологические изменения, вызванные JCTH-4 и ТАМ самостоятельно и в комбинации MCF7 клетки контролируется с помощью покадровой микроскопии фазового контраста или яркие картины поля. Нормальные человеческие фибробласты плода (NFF) показали заметное снижение чувствительности к JCTH-4 как в одиночку, а в сочетании с TAM. Таким образом, эти наблюдения позволяют предположить, JCTH-4, в одиночку и с ТАМ, быть безопасным и эффективным химиотерапевтическое средство против рака молочной железы и нейробластомы.

Материалы и методы

1. Культуре клеток

  1. Расти и культуры SH-SY5Y человеческих клеток нейробластомы (АТСС, Кат. CRL-2266, Манассас, Вирджиния, США) с изменения Дульбеко орлы среднего F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Канада) с добавлением 2 мМ L-глутамине, 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 10 мг / мл гентамицина (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Канада). Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% CO 2.
  2. Расти и культуры MCF7 человека аденокарциномы молочной железы клетки (АТСС, Кат. HTB-22, Манассас, Вирджиния, США) в RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Канада, Mississauga, ON, Канада) с добавлением 10% FBS стандарт (Thermo Научные, Waltham, MA) и 10 мг / мл гентамицина (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Канада). Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% CO 2.
  3. Расти и культуры, казалось бы, нормальных человеческих эмбриональных фибробластов (NFF) клеточной линии (Coriell института медицинских исследований, Кат. AG04431B, Камден, штат Нью-Джерси, США) в средней Дульбеко изменения Орла, высокий уровень глюкозы (Thermo Scientific, Waltham, Массачусетс, США ) с добавлением 15% FBS и 10 мг / мл гентамицина (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Канада). Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% CO 2.

2. Подготовка наркотиков

  1. Взвесить тамоксифен (TAM) цитрат соль (Sigma-Aldrich, Кат. T9262, Mississauga, ON, Канада) и растворить его в ДМСО подготовить 10 мМ маточного раствора. Магазин маточного раствора при температуре -20 ° C до использования. Все элементы управления транспортным средством, используемые в этом исследовании, содержащиеся ДМСО при менее 0,5%.
  2. Повторите шаг 2.1 подготовить 1 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО из JC-TH-ацетат-4 (JCTH-4), производства chemoenzymatic синтеза из бромбензол, как описано выше 16. Магазин маточного раствора при температуре -20 ° C до использования. Все элементы управления транспортным средством, используемые в этом исследовании, содержащиеся ДМСО при менее 0,5%.

3. Time-Lapse микроскопии

  1. Плиты приблизительно 2,0 х 10 5 MCF7 клеток в 35 мм со стеклянным дном культуры блюд (Маттек Corporation, Кат. P35G-014-C, Ashland, штат Массачусетс, США) в стерильных условиях кабинета класса II биобезопасности и позволить им расти 37 ° С и 5% CO 2.
  2. Когда клетки достигают от 60 до 70% слияния, относиться к ним с 1 мкМ JCTH-4 с помощью 1 мМматочного раствора растворяют в ДМСО и 10 мкМ ТАМ помощью 10 мМ маточного раствора, растворенного в ДМСО, самостоятельно и в комбинации в классе II биобезопасности кабинета.
  3. После обработки клеток в течение 48 часов, место клеток в камере с подогревом при температуре 37 ° C с 5% CO 2 на стадии Leica DMI6000 флуоресцентного микроскопа (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия).
  4. Использование ЛАГ AF6000 программное обеспечение, установить микроскоп принять фазового контраста или яркие снимки поле 400x увеличением каждые 5 минут в течение 18 часов.

4. Ядерная Окрашивание

  1. Плиты приблизительно 2,0 х 10 5 MCF7 или SH-SY5Y клеток в каждой лунке 6 подальше нижней культуре ткани пластины в классе II биобезопасности кабинета и дать им возможность расти при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  2. Когда клетки достигают от 60 до 70% слияния, относиться к ним с 1 мкМ JCTH-4 с помощью 1 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО и 10 мкМ ТАМ помощью 10 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО, каксамостоятельно и в комбинации в классе II биобезопасности кабинета.
  3. Инкубируйте клетки с вышеупомянутой процедуры при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 48 часов (SH-SY5Y клеток) или 72 часов (MCF7 клеток).
  4. После обработки и инкубации клеток с препаратами, непосредственно добавить краситель Hoechst 33342 (Molecular Probes, Юджин, Орегон, США) в средствах массовой информации обработанные клетки до конечной концентрации 10 мкМ для окрашивания ядер.
  5. Инкубируйте клетки с Hoechst красителя от 5 до 10 минут, защищенном от света месте.
  6. Поместите пластину на этапе IRB Leica DM перевернутой флуоресцентного микроскопа (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия).
  7. Возьмите люминесцентные и фазы микрофотографии на 400x увеличением.

5. Аннексин V связывания

  1. Плиты около 5,0 х 10 5 MCF7, SH-SY5Y или NFF клеток в 10 мл культуры тканей пластин в классе II биобезопасности кабинета и дать им возможность расти при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  2. Wкурица клетки достигают от 60 до 70% слияния, относиться к ним с 1 мкМ JCTH-4 с помощью 1 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО и 10 мкМ ТАМ помощью 10 мМ маточного раствора, растворенного в ДМСО, как самостоятельно, так и в комбинации в классе II биобезопасности шкафу.
  3. Инкубируйте клетки с вышеупомянутой процедуры при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 48 часов (SH-SY5Y клеток) или 72 часов (MCF7 и NFF клеток).
  4. Подготовить Аннексин V буфера для связывания в DDH 2 O 10 мМ HEPES, 10 мМ NaOH, 140 мм NaCl и 1 мМ CaCl 2 при рН 7,6 и хранить при 4 ° C до использования.
  5. После обработки и инкубации клеток с препаратами, удаление информации из пластин, содержащих взвешенные клетки и поместить его в отдельную 15 мл коническую трубку для каждой отдельной группе лечения помечены надлежащего лечения.
  6. Снимите прилипшие клетки из пластины с использованием трипсина.
  7. После того как клетки сняты с пластинки в результате трипсина, аспирации средствах массовой информации размещены в 15 мл коническуюАль трубку в пункте 5.4 и поместить его обратно в оригинальной пластины с трипсином приостановлено клеток.
  8. С электронным наполнитель пипетки и серологические пипетки, перемешать средствах массовой информации с решением клетки трипсином и поместить эту смесь обратно в соответствующие 15 мл конические пробирки.
  9. Центрифуга клеток при 600 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° С, удалить супернатант из каждой пробирки и ресуспендирования клеток в PBS.
  10. Центрифуга клеток при 600 мкг в течение 5 минут, удалить супернатант из каждой пробирки, и ресуспендируют меченых клеток в трубах микроцентрифужную с 50 до 70 мкл Аннексин V связывающим буфером.
  11. Добавить Аннексин V AlexaFluor-488 (1:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Канада) и красителя Hoechst конечной концентрации 10 мкМ и инкубировать в течение 15 минут защищенном от света месте.
  12. После инкубации вихрь одну из микроцентрифужную трубы, добавить от 7 до 10 мкл клетки смеси предметное стекло микроскопа, поместите возвышаться покровное клетки смесь на микротрещинслайд электронной и флуоресцентной микроскопии принимать, как Аннексин V и Hoechst изображений для каждого вида, в 400x увеличение на IRB Leica DM перевернутой флуоресцентного микроскопа (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия). Повторите эти действия для каждого экспериментального образца в каждой из оставшихся труб отцентрифугировать.

6. Водорастворимые соли тетразолия (WST-1) Анализ на жизнеспособность клеток

  1. Trypsinize сливной T75 колбу или 10 см культуре ткани блюдо MCF7, SH-SY5Y или NFF клеток в классе II биобезопасности кабинета.
  2. После того, как клетки были сняты, добавить от 5 до 10 мл СМИ трипсина и поместить подвески СМИ ячейки в 15 мл коническую трубку.
  3. Центрифуга клеток при 600 мкг в течение 5 минут, положите трубку обратно в шкаф биобезопасности, удалить супернатант из каждой пробирки и ресуспендирования клеток от 1 до 3 мл средства массовой информации в зависимости от размера ячейки гранул.
  4. Место 10 мкл суспензии клеток в микроцентрифуге трубки, добавляют 10 мкл Трипановый синий краситель (SIGMA-Aldrich, Mississauga, ON, Канада) и смешайте его с пипетки.
  5. Загрузить 10 мкл Трипановый Синий приостановлено клеток на гемоцитометра (Хауссер Scientific, США), подсчитать клетки, и рассчитать концентрацию клеток в суспензии клеток оригинальные 15 мл коническую трубку.
  6. Использование этой концентрации для определения объема оригинального суспензии клеток, необходимых для создания разбавленных суспензий с концентрацией 1,5 · 10 5 клеток / мл для MCF7 и SH-SY5Y и 5.0 × 10 4 клеток NFF необходимых для покрытия.
  7. Использование разбавленных суспензий для пластины 15 х 10 3 MCF7 или SH-SY5Y клеток / лунку или 5,0 х 10 3 клеток NFF / а путем добавления 100 мкл разбавленных суспензий в каждую лунку 96-луночного ясно пластины культуры тканей дна. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO 2 в одночасье.
  8. Относитесь к клеткам с 1 мкМ JCTH-4 и 10 мкМ ТАМ как самостоятельно, так и в комбинации в классе II биобезопасности шкафу в течение 72 часовс для MCF7 и NFF клеток, и в течение 48 часов для SH-SY5Y клеток.
  9. После обработки и инкубации препаратов, добавляют 10 мкл WST-1 реагент (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана, США) в каждую лунку и инкубировать пластину в течение 4 часов при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  10. Возьмите оптической плотности при 450 нм на Wallac Victor 3 1420 Multilabel Счетчик (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Канада) и выразить их в процентах от растворителя контрольных групп.

7. Tetramethylrhodamine метиловый эфир (TMRM) Окрашивание

  1. Поместите покровное в каждую лунку 6 подальше нижней плиты культуре ткани и пластину MCF7 клеток в каждую лунку с 6 лунками культуры ткани в классе корпус II биобезопасности. Позвольте им расти при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  2. Когда клетки достигают от 60 до 70% слияния, относиться к ним с 1 мкМ JCTH-4 с помощью 1 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО и 10 мкМ ТАМ помощью 10 мМ маточного раствора, растворенного в ДМСО,как самостоятельно, так и в комбинации в классе II биобезопасности кабинета.
  3. Инкубируйте клетки с вышеупомянутой процедуры при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 72 часов.
  4. После обработки и инкубации клеток с препаратами, непосредственно добавить краситель Hoechst 33342 (Molecular Probes, Юджин, Орегон, США) в средствах массовой информации обработанные клетки до конечной концентрации 10 мкМ для окрашивания ядер, а также tetramethylrhodamine метиловый эфир (TMRM ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Канада) в конечной концентрации 200 нМ.
  5. Инкубируйте клетки с красителями на 5% CO 2 и 37 ° C в течение 45 минут защищенном от света месте.
  6. Внесите 8 мкл PBS СМИ или на предметном стекле микроскопа и принять покровное с 6 лунками и поместите его на верхнюю часть средств массовой информации или PBS на предметное стекло микроскопа с клетками вниз с помощью пинцета.
  7. Возьмите люминесцентные микрофотографии, как Hoechst и TMRM микрофотографии для каждого вида, с IRB Leica DM перевернутой флуоресцентного микроскопа (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия) в 400x увеличением.

8. Митохондриальная изоляции

  1. Подготовить около 10 мл гипотонического буфера (1 мМ ЭДТА, 5 мМ Трис-HCl, 210 мМ маннит, 70 мМ сахарозы, 10 мкМ Leu-ППК, 10 мкМ Пеп-и 100 мкм PMSF) и реакционного буфера и сохранить оба решения на льду.
  2. С 8 до 10 сливной T75 культуры тканей колбы SH-SY5Y клеток, trypsinize клетки, добавляют средства массовой информации для нейтрализации трипсина, собирать клеточные суспензии в 50 мл конические пробирки и центрифуги трубы 600 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° C.
  3. Удалить супернатант и ресуспендируют клетки гранулы примерно от 10 до 20 мл холодного PBS, центрифуги трубы 600 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° С, и повторить этот процесс мытья один раз.
  4. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в холодной гипотонического буфера. Однородный клетки вручную с помощью мясорубки ткани стекла и центрифуги Клеточный лизат 600 мкг в течение 5 минут при 4 ° C.

9. Amplex Красной Пробирной

  1. После выделения митохондрий из клеток, оценить концентрацию белка в образце изолированных митохондриях с использованием стандартной кривой известных концентраций 1mg/mL BSA (бычий сывороточный альбумин) с BioRad анализа белка (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния, США) .
  2. Используя оценку концентрации белка в изолированных митохондриях решение, рассчитать объем этого решения, чтобы дать 20 мкг белка. Пипетировать этот объем в каждую лунку непрозрачной 96-луночного планшета, чтобы загрузить 20 мкг белка / а.
  3. Заполните каждую лунку в тарелку общим объемом 100 мкл с реакцией буфера, лечение от наркозависимости (с конечной концентрации 1 мкМ JCTH-4 и / или 10 мкМ ТАМ, или 250 мкМ PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON , СANADA), используемых в качестве положительного контроля), Красная Amplex реагента в конечной концентрации 50 мкМ, и пероксидазой хрена (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Канада) в соотношении 6 U/200 мкл.
  4. После 2 часов инкубации, взять показания флуоресценции на Ex. 560 нм и Em. 590 нм на spectrofluorometer (SpectraMax Близнецы XPS, Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США).

10. Сотовые Подготовка лизата

  1. Рост MCF7 клеток от 60 до 70% слияния в 10 см пластины тканевой культуры.
  2. Лечить клеток с 1 мкМ JCTH-4 и 10 мкМ ТАМ самостоятельно и в комбинации в течение 72 часов с 10 до 15 пластин в группе лечения.
  3. Подготовить буфер лизиса клеток (10 мМ Трис-HCl при рН 7,2, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1 мМ EGTA, 1% Triton-X-100, 10 мкМ Leu-ППК, 10 мкМ Пеп-и 100 мкм PMSF ) и хранить при температуре 4 ° C до использования.
  4. Механически выбить клеток с пластинки поверхности клетки скребок и собирают клетки меченых 50мл конических труб.
  5. Центрифуга труб при 600 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° C, удалите супернатант и ресуспендируют гранулы ячейки от 10 до 20 мл холодного PBS, центрифуги трубы 600 мкг в течение 5 минут при температуре 4 ° С, и повторить этот процесс стирки один раз.
  6. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в холодной буфера для лизиса клеток. Однородный клетки вручную с помощью мясорубки ткани стекла и центрифуги Клеточный лизат 600 мкг в течение 5 минут при 4 ° C.
  7. Откажитесь от таблеток и хранения клеточных лизатов при температуре -20 ° C до использования.

11. Анализ западных Blot

  1. Определение концентрации белка клеточных лизатов использованием BioRad анализа белка (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Калифорния, США). Предмет белка образцов SDS-PAGE и переводят белок в нитроцеллюлозных мембран.
  2. После передачи, блок мембраны с 5% вес / объем молока TBST (трис-буферном растворе Твин-20) решение в течение 1 часа.
  3. Зонд мембран с муравьемя-LC3 антител, поднятые в кролика (1:500) (Novus биологические, Кат. NB100-2220, Литтлтон, Колорадо, США), или анти-β-актин антител, поднятые в мышь (1:1000) (Санта-Крус биотехнологии, Inc Кат. SC-81178, Пасо Роблес, Калифорния, США) в течение ночи при 4 ° C.
  4. Тема мембраны одного 15 минут и два 5 минут моет в TBST и инкубировать с анти-мышь (1:2000) или анти-кролик (1:2000) пероксидазы хрена конъюгированных вторичных антител (Abcam, Кат. Ab6728 и ab6802, Кембридж, Массачусетс, США) в течение 1 часа при температуре 4 ° C.
  5. Тема мембран для трех последовательных 5 минут моет в TBST и визуализировать белки группы с повышенной реагент хемилюминесценции (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Канада).
  6. Исполняет денситометрия анализа с использованием ImageJ программного обеспечения.

12. Monodansylcadaverine (MDC) Окрашивание

  1. Поместите покровное в каждую лунку 6 подальше нижней плиты культуре ткани и пластину MCF7 клеток в каждой лунке 6подальше нижней культуре ткани пластины в классе II биобезопасности кабинета. Позвольте им расти при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  2. Когда клетки достигают от 60 до 70% слияния, относиться к ним с 1 мкМ JCTH-4 с помощью 1 мМ маточного раствора растворяют в ДМСО и 10 мкМ ТАМ помощью 10 мМ маточного раствора, растворенного в ДМСО, как самостоятельно, так и в комбинации в классе II биобезопасности шкафу.
  3. Инкубируйте клетки с вышеупомянутой процедуры при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 72 часов.
  4. После обработки и инкубации клеток с препаратами, непосредственно добавить Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Канада) до конечной концентрации 0,1 мм в каждую лунку в течение 15 мин.
  5. Инкубируйте клеток с красителем на 5% CO 2 и 37 ° C в течение 15 минут защищенном от света месте.
  6. Внесите 30 мкл PBS СМИ или на предметном стекле микроскопа и принять покровное с 6 лунками и поместите его на верхнюю часть средств массовой информации или PBS на предметное стекло микроскопа с клетками ВВСКИнг вниз с помощью пинцета.
  7. Возьмите люминесцентные MDC и фазы микрофотографии, для каждого вида, с IRB Leica DM перевернутой флуоресцентного микроскопа (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия) в 400x увеличением.

13. Представитель Результаты

Селективный индукции апоптоза в человека Аденокарцинома молочной железы и клетки нейробластомы на JCTH-4: Повышение активности на ТАМ

Селективный индукции апоптоза была показана в различных раковых клетках естественным PST (рис. 1а), 11-13. Из-за низкой доступности PST, мы были синтезированы аналоги 7-deoxypancratistatin (JCTH-4, рис. 1б) и отбор их для подобных противораковой активностью в человеческой аденокарциномы молочной железы (MCF7) и клеток нейробластомы (SH-SY5Y). На первом этапе экспериментов, мы хотели контролировать морфологические изменения в течение долгого времени после лечения JCTH-4 и ТАМ самостоятельно и в комбинации MCF7 клеткис. MCF7 клеток наблюдали в течение 18 часов, как видно на видео 1 производства покадровой микроскопии с изображением фазового контраста, с растворителем лечения (контроль) в течение 48 часов, эти клетки выставлены никаких серьезных изменений в морфологии. С другой стороны, после 48 часов 1 мкМ JCTH-4 лечение, эти клетки выставлены морфологических изменений, связанных с апоптозом, таких как усадка, blebbing, апоптоза формирование тела, как показано на видео 2. С другой стороны, ТАМ лечение только в MCF7 клетки произвели очень четкие морфологии в том числе точечных включений свидетельствуют о autophagosomes связанные с аутофагии (видео 3). Очень минимальный апоптоза морфологией наблюдается и клетки в целом выставлены здоровый морфологии сопоставимы с растворителем контроль рассматривается MCF7 клеток. Интересно, что при наличии ТАМ, индукции апоптоза JCTH-4 резко повышается, как это указано на повышение апоптоза морфологией в MCF7 клеток после 48 часов, иллюстрирующихред в видео 4.

На втором этапе эксперимента мы использовали флуоресцентные красители для оценки индукции апоптоза. После 72 часов и 48 часов 1 мкМ JCTH-4 лечение в MCF7 и SH-SY5Y клеток, соответственно, Hoechst краска была использована и для контроля ядерных морфологии. Результаты показали, сгущенное, ярко окрашенных ядер сопровождается апоптотических тел в MCF7 и SH-SY5Y клеток, что свидетельствует о апоптоза индукции (рис. 2а, б). ТАМ лечением дали минимальный апоптоза ядерных морфологии MCF7 и SH-SY5Y клеток ядер были большие, круглые, и тускло окрашенных Hoechst сопоставимы с растворителем контрольной группе (рис. 2, б). В соответствии с Видео 4 ядра MCF7 и SH-SY5Y клетки имеют заметное увеличение апоптоза морфологией с комбинированной терапии после 72 часов (рис. 2, б).

Чтобы проверить апоптоза индукции, клетки были оценены на рhosphatidylserine экстернализации, маркером апоптоза, через Аннексин V связывания 17. MCF7 и SH-SY5Y клетках, обработанных в течение 72 и 48 часов соответственно с 1 мкМ JCTH-4 отдельно и в сочетании с 10 мкМ ТАМ были положительными Аннексин V обязательными, указывает зеленая флуоресценция, подтверждающие индукции апоптоза (рис. 3а, б ). Не очевидно экстернализации фосфатидилсерина наблюдался в MCF7 и SH-SY5Y клетках, обработанных только ТАМ, а также в клетках, обработанных NFF со всеми вышеупомянутыми группами лечения после 72 часов (рис. 3в). Таким образом, JCTH-4 отдельно и в сочетании с TAM выборочно вызывает апоптоз в MCF7 и SH-SY5Y клеток.

Для количественной оценки влияния JCTH-4 отдельно и в сочетании с TAM, WST-1 на основе колориметрический тест для жизнеспособности клеток, показатель активного клеточного метаболизма, был выполнен на MCF7 и NFF клетках, обработанных в течение 72 часов и SH-SY5Y клетках, обработанных в течение 48 часов.По сравнению с контрольными группами растворителей, 1 мкМ JCTH-4 снизилась активный клеточный метаболизм на 50%, в то время как 10 мкМ ТАМ только выставлены никаких существенных различий в обеих MCF7 и SH-SY5Y клетки (рис. 4, б). Интересно, что в MCF7 и SH-SY5Y клеток, добавление к JCTH ТАМ-4 оскорбления в результате синергетического снижение клеточного метаболизма. NFF клеток были значительно менее чувствительны к JCTH-4 и один JCTH-4 с TAM (рис. 4в). Таким образом, JCTH-4 демонстрирует избирательный синергетический деятельности с ТАМ в MCF7 и SH-SY5Y клеток.

Митохондриальная Таргетинг JCTH-4

Чтобы убедиться, что JCTH-4 ориентирован на митохондрии индуцировать апоптоз митохондриального мембранного потенциала в целом и клетки ROS поколения в изолированных митохондриях наблюдение. MCF7 клетки обрабатывали в течение 72 часов и окрашивали TMRM. 1 мкМ JCTH-4 снизилась ММП, обозначенные потери красной флуоресценции (рис. 5а). Тем не менее, с-йэлектронной добавлением 10 мкМ ТАМ, большая диссипация ММП наблюдается, в то время как 10 мкМ ТАМ только не очевидно воздействие на ММП.

Как увеличивается ROS поколения были связаны с митохондриальной мембраны пермеабилизации и индукции апоптоза, производство АФК оценивали с Amplex Красная краска в изолированных митохондриях из SH-SY5Y клетки обрабатывали 1 мкМ JCTH-4 и 10 мкМ ТАМ, самостоятельно и в комбинации 18 -20. Флуоресценции показания были выражены как относительные единицы флуоресценции (РФС). Увеличение ROS поколения наблюдались JCTH-4 и один TAM (рис. 5б). Интересно, что комбинированное лечение дало большее увеличение производства АФК. Известный индуктором продукции АФК в митохондрии, PQ, был использован в качестве положительного контроля.

Индукция Аутофагия по JCTH-4 и ТАМ

Autophagic индукции был связан с химиотерапевтическими оскорбление различных соединений (рис. 6а). Следует отметить, что интенсивность окрашивания MDC был наибольшим с комбинированной терапии, а затем только ТАМ и JCTH-4 в одиночку.

В аутофагии, микротрубочек связанных белка 1 легкой цепи 3 (LC3) обычно находится в цитозоле (LC3-I), lipidated с фосфатидилэтаноламин, а затем локализованная для autophagosomal мембран (LC3-II) 2. Чтобы проверить индукцией аутофагии, уровни LC3-II были оценены в MCF7 клетках, обработанных в течение 72 часов с помощью западных анализов пятно. 1 мкМ JCTH-4 слегка индуцированные превращения LC3-я в LC3-II, а 10 мкМ ТАМ производится больше autophagic ответ (рис.6b). Интересно, что комбинированное лечение привело к наибольшей индукцией аутофагии, уступая LC3-II в LC3-I соотношение больше 3. Таким образом, эти результаты показывают, autophagic индукции в MCF7 клеток JCTH-4 и ТАМ самостоятельно и в сочетании с наибольший отклик в клетках с комбинированной терапии.

Справочная Видео 1. Сотовой морфологии MCF7 клетках, обработанных растворителем управления. MCF7 клеток наблюдали между 48 и 66 часов после обработки растворителем управления (ДМСО) с помощью покадровой микроскопии с изображением фазового контраста. Клетки при температуре 37 ° C и 5% CO 2. Изображения были захвачены в 400x увеличением. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео .

Справочная Видео 2. Индукции апоптоза в клеточной морфологии MCF7 клетках, обработанных JCTH-4. MCF7 клеток наблюдали между 48 и 66 часов после лечения остроумиеч 1 мкМ JCTH-4 с помощью покадровой микроскопии с изображением фазового контраста. Клетки при температуре 37 ° C и 5% CO 2. Изображения были захвачены в 400x увеличением. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео .

Справочная видео 3. Индукция autophagic клеточной морфологии в MCF7 клетках, обработанных TAM. MCF7 клеток наблюдали между 48 и 66 часов после лечения с 10 мкМ ТАМ использованием замедленной микроскопии с изображением фазового контраста. Клетки при температуре 37 ° C и 5% CO 2. Изображения были захвачены в 400x увеличением. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео .

Справочная Видео 4. Расширенные апоптоза морфологии JCTH-4 с ТАМ в MCF7 клеток. MCF7 клеток наблюдали между 48 и 66 часов после лечения как с 1 мкМ JCTH-4 и 10 мкМ ТАМ использованием замедленной микроскопа с фазовым продолжениераст фотографий. Клетки при температуре 37 ° C и 5% CO 2. Изображения были захвачены в 400x увеличением. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео .

Рисунок 1
Рисунок 1. Структурное сравнение PST для синтетических 7-дезокси аналог. (А) Химическая структура pancratistatin (PST). (Б) Химическая структура JC-TH-ацетат-4 (JCTH-4).

Рисунок 2
Рисунок 2. JCTH-4 вызывает ядерная апоптоза морфологией с повышенной активностью с TAM. Ядерная морфология (а) MCF7 и (б) SH-SY5Y клетках, обработанных в течение 72 и 48 часов соответственно с указанной концентрацией ТАМ и JCTH-4 окрашенных Hoechst красителя. Контрольные группы лечились с растворителем (DMSO). Изображения были приняты на 400x увеличение на флуоресцентный микроскоп. Шкала бар = 15 мкм.

Рисунок 3
Рисунок 3. JCTH-4 причины фосфатидилсерина экстернализации самостоятельно и в сочетании с TAM выборочно в раковых клетках. Аннексин V привязки к вовне фосфатидилсерина оценивали проверить индукции апоптоза в (а) MCF7 (72 часа), (б) SH-SY5Y (48 часов), и (с) NFF (72 часа) клетки, обработанные JCTH-4 и ТАМ в указанной концентрации. Контрольные группы лечились при помощи растворителя (ДМСО). Изображения были приняты на 400x увеличение на флуоресцентный микроскоп. Шкала бар = 15 мкм.

Рисунок 4
Рисунок 4. ТАМ повышает жизнеспособность снижение на JCTH-4 выборочно в раковых клетках. 96-луночных планшетах были засеяны шм (а) MCF7, (б) SH-SY5Y, и (с) NFF клеток и обрабатывают JCTH-4 и ТАМ в указанной концентрации. MCF7 и NFF клетки обрабатывали в течение 72 часов и SH-SY5Y лечились в течение 48 часов. Сообщение лечения наркозависимости и инкубации WST-1 реагента в каждую лунку добавляют и поглощения показания были приняты на длине волны 450 нм и выражали в процентах от контроля (ДМСО). Статистика проводились с использованием GraphPad Prism 5.0. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение от quadruplicates 3 независимых экспериментов. MCF7: * р <0,001, ** р <0,0001 по сравнению с контролем; # р <0,05 в сравнении с 1 мкМ JCTH-4, † р <0,0001 по сравнению с 10 мкМ TAM. SH-SY5Y: * р <0,0005 по сравнению с контролем; # р <0,005 в сравнении с 1 мкМ JCTH-4, † р <0,005 в сравнении с 10 мкМ TAM. NFF: * р <0,005 в сравнении с 10 мкМ ТАМ + 1 мкМ JCTH-4 в MCF7 клеток; # р <0,01 в сравнении с 10 мкМ ТАМ + 1 мкМ JCTH-4 SH-SY5Y клеток.

Рисунок 5
Рисунок 5. JCTH-4 и ТАМ действует на митохондрии. (А) MCF7 клетки, выращенные на покровных и обрабатывают указанной концентрации препаратов в течение 72 часов и окрашивали TMRM оценить ММП. Клетки контрольной группы лечили при помощи растворителя (ДМСО). Изображения были захвачены в 400x увеличение на флуоресцентного микроскопа. Шкала бар = 15 мкм. (Б) изолированных митохондрий с SH-SY5Y клетки обрабатывали JCTH-4 и ТАМ в указанной концентрации и АФК оценивали с Amplex Красной субстрата в присутствии пероксидазы хрена (HRP). Клетки контрольной группы лечили при помощи растворителя (ДМСО). Параквата (PQ) был использован в концентрации 250 мкМ в качестве положительного контроля. Флуоресценции показания были получены через 2 часа лечения в Ex. 560 нм и Em. 590 нм и выражали в относительных fluorescencэлектронных блоков (РФС). Статистика были получены с использованием GraphPad Prism 5.0. Данные представитель 3-х независимых экспериментов с подобными тенденциями. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение от quadruplicates 1 независимый эксперимент. * Р <0,05, ** р <0,005, *** р <0,001 в сравнении с контролем; # р <0,05 в сравнении с 1 мкМ JCTH-4, † р <0,05 в сравнении с 10 мкМ ТАМ, @ р <0,05 в сравнении с 250 мкМ PQ.

Рисунок 6
Рисунок 6. ТАМ повышает autophagic индукции JCTH-4. (А) MCF7 клетки, выращенные на покровных и подвергается JCTH-4 и ТАМ оскорбления в указанной концентрации в течение 72 часов. Клетки контрольной группы лечили при помощи растворителя (ДМСО). Начать лечение, MCF7 клетки окрашивали MDC для обнаружения autophagic вакуоли. Изображения были захвачены в 400x увеличение на флуоресцентного микроскопа. Шкала бар = 15 мкм. (б) анализ Вестерн-блот проводились для LC3 и β-актина на клеточных лизатов MCF7 клетках, обработанных с указанной концентрацией препаратов в течение 72 часов. Денсиметрический анализы были выполнены с помощью программного обеспечения ImageJ. Статистика проводились с использованием GraphPad Prism 5.0. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение. * Р <0,05, ** р <0,005, *** р <0,0005 по сравнению с контролем; # р <0,001 в сравнении с 1 мкМ JCTH-4, † р <0,001 в сравнении с 10 мкМ TAM.

Список сокращений.

ER рецептора эстрогена
ФМН флавинмононуклеотида
JCTH-4 JC-TH-ацетат-4
LC3 микротрубочек связанных белков 1 легкой цепи 3
MDC monodansylcadaverine
ММП mitochondrIAL мембранного потенциала
MRC дыхательной цепи митохондрий
NFF нормальных человеческих эмбриональных фибробластов
PQ паракват
PST pancratistatin
РФС Относительная единицах флуоресценции
АФК активных форм кислорода
ТАМ тамоксифен
TMRM tetramethylrhodamine метилового эфира

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PST и аналогичных соединений было показано, что противораковыми свойствами 11-15,21. Ранее мы уже сообщали природных PST дестабилизировать митохондрии выборочно в раковых клетках, которые тем самым вызывает апоптоз выделением апоптогенное факторов 12,14. Вполне вероятно, что JCTH-4 действует через тот же механизм, JCTH-4 вызвали крах ММП в MCF7 клетки, как видно с TMRM окрашивания (рис. 5а), и увеличение генерации АФК в митохондрии, изолированные от SH-SY5Y клетки (рис. 5б), что свидетельствует о митохондриальной дисфункции. Таким образом, индукции апоптоза JCTH-4, скорее всего, через митохондриальную таргетинга в раковых клетках.

Многочисленные различия между доброкачественные и раковые клетки, которые могут служить основой для рака селективности JCTH-4. Раковые клетки сильно зависят от гликолиза, а не на митохондрии для производства энергии, это явление называетсяс эффектом Варбурга 22. Такие метаболической активности в раковых клетках приводит к повышению кислотности в цитозоле. Следовательно, кислой среды способствует цитозольного раковые клетки митохондрии гиперполяризации, которая была связана с повышенной способностью к вторжению и избежать апоптоза 23. Hyperpolariztion раковых клеток митохондрии однако, может сделать раковые клетки уязвимыми для JCTH-4, после их принятия в клетку, JCTH-4 может получить положительный заряд в результате ферментативного обработки и может выборочно будут рассмотрены в раковой клетке митохондрии в связи с их гиперполяризации природы. Кроме того, множество митохондрий связанных антиапоптотических белков было показано, что высоко в раковые клетки, которые запрещают митохондриальной мембраны пермеабилизации и последующей реализации апоптоза, такие как антиапоптотического белков Bcl-2 семейства белков, 24-26.

При наличии различных форм клеточного стресса, аутофагии срабатывает какпро выживания ответ, что позволяет клеткам выживать в неблагоприятных условиях 2. За возбуждение этого пути однако, может привести к обширным пробой жизненно внутриклеточных компонентов порождает autophagic 3 клеточной смерти. И ответы про выживания и про-autophagic смерти были связаны с химиотерапевтическими оскорбление 3. Митохондриальная дисфункция по JCTH-4 приводит к окислительному стрессу может вызвать автоматическое умолчанию autophagic ответ. Действительно, мы сделали некоторые наблюдения autophagic индукции апоптоза, а также с JCTH-4 лечения (рис. 2а, б 3а, б 6а, б). Хотя ТАМ был также создан в качестве антагониста ЭР в ER-положительных клеток рака молочной железы, недавно было показано, что взаимодействие с митохондриями, привязка к ФМН сайте Комплекса я 10. Кроме того, ТАМ хорошо известный индуктор аутофагии во многих типов раковых клеток 3. Действительно, ТАМ было привести к увеличению в поколение ROS в изолированных mitochondria (рис. 5б). Тем не менее, такое взаимодействие оказалось недостаточно, чтобы вызвать коллапс MMP (рис. 5а), но достаточно, чтобы вызвать типичные про-выживание autophagic ответ. Обширные autophagic индукции наблюдается при JCTH-4 и TAM были использованы в комбинации (рис. 6, б), которое сопровождалось расширенной цитотоксической реакции (рис. 4, б), наводит на мысль о про-смерть autophagic ответ, тем не менее, раковые клетки в конечном итоге умирают от апоптоза, в результате митохондриального пермеабилизации и апоптогенное релиз фактор. Такая чувствительность к TAM к JCTH-4 оскорбление может быть связано с увеличением в поколение АФК TAM. Потому как ТАМ и JCTH-4 способны генерировать окислительного стресса, комбинаторной производство таких стресс с обоих соединений может привести к обширным autophagic индукции порождает отрицательное autophagic ответ и / или крупных митохондриальной пермеабилизации и последующего апоптоза. Thсочетается лечение не влияет на жизнеспособность доброкачественное фибробластов (рис. 4в). Эти результаты показывают, что JCTH-4 самостоятельно и в сочетании с ТАМ могут быть эффективно использованы для лечения рака молочной железы и нейробластомы, не вызывая побочных эффектов на доброкачественные клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Рыцари Колумба Глава 9671 (Виндзор, Онтарио), и CIHR Фредерик Бантинг и Чарльз Лучший Канаде Высшее стипендия присуждена Денис Ма. Спасибо Роберт Ходж и Элизабет Fidalgo да Силва за помощь с покадровой микроскопии. Спасибо Кэти Facecchia для редактирования покадровой видео микроскопии. Мы также хотели бы поблагодарить Sudipa июня Чаттерджи и Филипп Tremblay для критического обзора этой рукописи. Данная работа посвящена памяти Кевин Couvillon, который потерял борьбе против рака в 2010 году.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SH-SY5Y cell line ATCC CRL-2266
Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM Sigma-Aldrich 51448C
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16000-044
MCF7 cell line ATCC HTB-22
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R 0883
Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) Coriell Institute for Medical Research AG04431B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30022.01
Tamoxifen citrate salt Sigma-Aldrich T9262
35 mm glass bottom culture dishes MatTek Corp. P35G-014-C
Leica DMI6000 B inverted microscope Leica Microsystems N/A
H–chst 33342 dye Molecular Probes, Life Technologies H3570
Leica DM IRB inverted fluorescence microscope Leica Microsystems N/A
Annexin V AlexaFluor-488 Invitrogen A13201
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-20ML
Haemocytometer Fisher Scientific 267110
WST-1 reagent Roche Group 11644807001
Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter PerkinElmer, Inc. 1420-011
Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) GIBCO, by Life Technologies T-668
Glass tissue grinder Fisher Scientific K8885300-0002
BioRad protein assay Bio-Rad 500-0001Bottom of Form
Amplex Red Invitrogen A12222
Horseradish peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8125
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices 3126666
Anti-LC3 antibody raised in rabbit Novus Biologicals NB100-2220
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6728
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6802
Chemiluminescence peroxidase substrate Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
  2. Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
  3. Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
  6. Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
  7. Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
  8. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
  9. Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
  10. Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
  11. Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
  12. McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
  13. Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
  14. Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
  15. Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
  16. Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
  17. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
  18. Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  19. Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
  20. Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
  21. Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. an, Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
  22. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  23. Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
  24. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  25. Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
  26. Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).
Повышение апоптоза и Autophagic после индукции Новые синтетические C-1 Аналог 7-deoxypancratistatin в человеческой аденокарциномы молочной железы и клетки нейробластомы с Тамоксифен
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).More

Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter