Mejora de la inducción de apoptosis y la autofagia mediante un sintético nuevo C-1 analógica de 7-deoxypancratistatin en el adenocarcinoma de mama humano y células de neuroblastoma con tamoxifeno
Summary
Hemos sintetizado un análogo de la novela de pancratistatin comparables con actividad anti-cáncer como pancratistatin nativa, curiosamente, el tratamiento combinatorio con el tamoxifeno produjo una mejora drástica en la inducción de la apoptosis y la autofagia en las mitocondrias con un efecto mínimo sobre los fibroblastos no cancerosas. Por lo tanto, JCTH-4 en combinación con el tamoxifeno podría proporcionar un seguro anti-terapia contra el cáncer.
Abstract
El cáncer de mama es uno de los cánceres más comunes entre las mujeres en América del Norte. Muchos de los actuales tratamientos contra el cáncer, incluyendo la radiación ionizante, inducir la apoptosis a través de daños en el ADN. Desafortunadamente, estos tratamientos no son selectivos para las células cancerosas y producir toxicidad similar en células normales. Nos han informado de la inducción selectiva de apoptosis en las células cancerosas por el pancratistatin compuesto natural (PST). Recientemente, un nuevo análogo de PST, un derivado C-1 de 7-acetoximetil deoxypancratistatin (JCTH-4), fue producido por la síntesis de novo y exhibe comparables actividad selectiva inductor de apoptosis en varias líneas celulares de cáncer. Recientemente, la autofagia se ha implicado en enfermedades malignas como tanto pro-supervivencia y pro-muerte mecanismos en respuesta a la quimioterapia. El tamoxifeno (TAM) invariablemente ha demostrado la inducción de pro-supervivencia autofagia en numerosos tipos de cáncer. En este estudio, la eficacia de JCTH-4 solos y en combinación con TAM para inducir la muerte celular en cancia de mama humanor (MCF7) y neuroblastoma (SH-SY5Y), las células se evaluó. TAM sola indujo la autofagia, pero la muerte celular insignificante, mientras que JCTH-4 solo causó la inducción de la apoptosis significativa con un poco de la inducción de la autofagia. Curiosamente, el tratamiento combinatorio producido un aumento drástico en la inducción de la apoptosis y la autofagia. Estamos supervisados dependientes del tiempo los cambios morfológicos en las células MCF7 sometidos a TAM inducida por la autofagia, las JCTH-4-inducida por la apoptosis y la autofagia, y la muerte acelerada de las células con el tratamiento combinatorio utilizando time-lapse microscopía. Hemos demostrado que estos compuestos para inducir la apoptosis / autofagia mediante la focalización mitocondrial en las células cancerosas. Es importante destacar que estos tratamientos no afectó la supervivencia de fibroblastos humanos no cancerosas. Por lo tanto, estos resultados indican que JCTH-4 en combinación con TAM podría ser utilizado como una caja fuerte y muy potentes contra el cáncer terapia contra el cáncer de mama y de células de neuroblastoma.
Protocol
Discussion
PST y compuestos similares se han demostrado tener propiedades anti-cancerígenas 11-15,21. Hemos informado anteriormente de PST naturales para desestabilizar selectivamente la mitocondria en células cancerosas, que por lo tanto induce la apoptosis por la liberación de factores de apoptogénicos 12,14. Lo más probable es que JCTH-4 actúa a través del mismo mecanismo; JCTH-4 provocó el colapso de MMP en células MCF7 como se ha visto con la tinción de TMRM (Fig. 5a), y el aum…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido apoyado por los Caballeros de Colón el Capítulo 9671 (Windsor, Ontario), y Federico Banting CIHR y Charles Best Canadá Becas de Posgrado otorgó a Dennis Ma. Gracias a Hodge, Robert y Elizabeth Fidalgo da Silva por su ayuda con la microscopía de lapso de tiempo. Gracias a Katie Facecchia para la edición de los vídeos de microscopía de time-lapse. También nos gustaría dar las gracias a Sudipa junio Chatterjee y Tremblay Phillip para la revisión crítica de este manuscrito. Este trabajo está dedicado en memoria de Kevin Couvillon quien perdió su batalla contra el cáncer en 2010.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C |
| Fetal bovine serum | Gibco BRL | 16000-044 |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Scientific | SH30022.01 |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-014-C |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A |
| Hoechst 33342 dye | Molecular Probes | H3570 |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| WST-1 reagent | Roche Applied Science | 11644807001 |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer | 1420-011 |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | Gibco BRL | T-668 |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 |
| BioRad protein assay | Bio-Rad Laboratories | 500-0001Bottom of Form |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
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