Förbättring av apoptotiska och Autophagic Induktion av en ny syntetisk C-1-analog av 7-deoxypancratistatin i human bröstadenokarcinoma och neuroblastomceller med Tamoxifen
Summary
Vi har syntetiserat en ny analog pankratistatin med jämförbar anti-cancer aktivitet som infödda pankratistatin, intressant, gav kombinatorisk behandling med tamoxifen en drastisk förbättring i apoptotisk och autophagic induktion genom mitokondrie-inriktning med minimal effekt på noncancerous fibroblaster. Sålunda kunde JCTH-4 i kombination med tamoxifen tillhandahålla en säker anticancerterapi.
Abstract
Bröstcancer är en av de vanligaste cancerformer bland kvinnor i Nordamerika. Många nuvarande behandlingar mot cancer, inklusive joniserande strålning inducerar apoptos via DNA-skada. Olyckligtvis är sådana behandlingar är icke-selektiva för cancerceller och producera liknande toxicitet i normala celler. Vi har rapporterat selektiva induktion av apoptos i cancerceller genom den naturliga föreningen pankratistatin (PST). Nyligen har en ny PST-analog, en C-1 acetoximetyl-derivatet av 7-deoxypancratistatin (JCTH-4), som produceras av de novo-syntes och det uppvisar jämförbar selektiv aktivitet apoptosinducerande i flera cancercellinjer. Nyligen har autophagy implicerats i maligniteter som både pro-överlevnad och pro-döden mekanismer som svar på kemoterapi. Tamoxifen (TAM) har undantagslöst visat induktion av pro-överlevnad autophagy i många cancerformer. I denna studie att effekten av JCTH-4 ensamt och i kombination med TAM inducera celldöd i humana bröst tydelser (MCF7) och neuroblastom (SH-SY5Y-celler) utvärderades. TAM ensam inducerade autophagy, men obetydlig celldöd medan JCTH-4 ensamt orsakade signifikant induktion av apoptos med några induktion av autophagy. Intressant, gav kombinationsproportioner behandlingen en drastisk ökning av apoptotiska och autophagic induktion. Vi övervakade tidsberoende morfologiska förändringar i MCF7 celler som genomgår TAM-inducerad autophagy och JCTH-4-inducerad apoptos och autophagy och snabbare celldöd med kombinatorisk behandling med time-lapse mikroskopi. Vi har visat att dessa föreningar inducerar apoptos / autophagy genom mitokondriell målsökning av dessa cancerceller. Viktigt har dessa behandlingar inte påverka överlevnaden av noncancerous humana fibroblaster. Sålunda visar dessa resultat att JCTH-4 i kombination med TAM skulle kunna användas som en säker och mycket potent anti-cancer-terapi mot bröstcancer och neuroblastomceller.
Protocol
Discussion
PST och liknande föreningar har visats ha anti-canceregenskaper 11-15,21. Vi har tidigare rapporterat naturligt PST att destabilisera mitokondrierna selektivt i cancerceller, som därmed inducerar apoptos genom frisättning av apoptogenic faktorer 12,14. Det är mest troligt att JCTH-4 verkar genom samma mekanism; JCTH-4 orsakas MMP kollaps i MCF7-celler som ses med TMRM färgning (fig. 5a), och ökad produktion av ROS i isolerade mitokondrier från SH-SY5Y-celler (Fig. 5b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har stötts av riddarna av Columbus kapitel 9671 (Windsor, Ontario) och en CIHR Frederick Banting och Charles Best Kanada Graduate stipendium till Dennis Ma. Tack till Robert Hodge och Elizabeth Fidalgo da Silva för deras hjälp med time-lapse mikroskopi. Tack till Katie Facecchia för att redigera time-lapse mikroskopi videor. Vi vill också tacka Sudipa juni Chatterjee och Phillip Tremblay för kritisk granskning av detta manuskript. Detta arbete är tillägnat till minne av Kevin Couvillon som förlorade sin kamp mot cancer under 2010.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number |
| SH-SY5Y cell line | ATCC | CRL-2266 |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM | Sigma-Aldrich | 51448C |
| Fetal bovine serum | Gibco BRL | 16000-044 |
| MCF7 cell line | ATCC | HTB-22 |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R 0883 |
| Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) | Coriell Institute for Medical Research | AG04431B |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium | Thermo Scientific | SH30022.01 |
| Tamoxifen citrate salt | Sigma-Aldrich | T9262 |
| 35 mm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-014-C |
| Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica Microsystems | N/A |
| Hoechst 33342 dye | Molecular Probes | H3570 |
| Leica DM IRB inverted fluorescence microscope | Leica Microsystems | N/A |
| Annexin V AlexaFluor-488 | Invitrogen | A13201 |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-20ML |
| Haemocytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| WST-1 reagent | Roche Applied Science | 11644807001 |
| Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter | PerkinElmer | 1420-011 |
| Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) | Gibco BRL | T-668 |
| Glass tissue grinder | Fisher Scientific | K8885300-0002 |
| BioRad protein assay | Bio-Rad Laboratories | 500-0001Bottom of Form |
| Amplex Red | Invitrogen | A12222 |
| Horseradish peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8125 |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | 3126666 |
| Anti-LC3 antibody raised in rabbit | Novus Biologicals | NB100-2220 |
| Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6728 |
| Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody | Abcam | ab6802 |
| Chemiluminescence peroxidase substrate | Sigma-Aldrich | CPS160 |
| Monodansylcadaverine | Sigma-Aldrich | 30432 |
References
- Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
- Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
- Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
- Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
- Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
- Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
- Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
- Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
- McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
- Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
- Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
- Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
- Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
- Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
- Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
- Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
- Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
- Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. a. n., Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
- Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).
