Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Förbättring av apoptotiska och Autophagic Induktion av en ny syntetisk C-1-analog av 7-deoxypancratistatin i human bröstadenokarcinoma och neuroblastomceller med Tamoxifen

doi: 10.3791/3586 Published: May 30, 2012

Summary

Vi har syntetiserat en ny analog pankratistatin med jämförbar anti-cancer aktivitet som infödda pankratistatin, intressant, gav kombinatorisk behandling med tamoxifen en drastisk förbättring i apoptotisk och autophagic induktion genom mitokondrie-inriktning med minimal effekt på noncancerous fibroblaster. Sålunda kunde JCTH-4 i kombination med tamoxifen tillhandahålla en säker anticancerterapi.

Abstract

Bröstcancer är en av de vanligaste cancerformer bland kvinnor i Nordamerika. Många nuvarande behandlingar mot cancer, inklusive joniserande strålning inducerar apoptos via DNA-skada. Olyckligtvis är sådana behandlingar är icke-selektiva för cancerceller och producera liknande toxicitet i normala celler. Vi har rapporterat selektiva induktion av apoptos i cancerceller genom den naturliga föreningen pankratistatin (PST). Nyligen har en ny PST-analog, en C-1 acetoximetyl-derivatet av 7-deoxypancratistatin (JCTH-4), som produceras av de novo-syntes och det uppvisar jämförbar selektiv aktivitet apoptosinducerande i flera cancercellinjer. Nyligen har autophagy implicerats i maligniteter som både pro-överlevnad och pro-döden mekanismer som svar på kemoterapi. Tamoxifen (TAM) har undantagslöst visat induktion av pro-överlevnad autophagy i många cancerformer. I denna studie att effekten av JCTH-4 ensamt och i kombination med TAM inducera celldöd i humana bröst tydelser (MCF7) och neuroblastom (SH-SY5Y-celler) utvärderades. TAM ensam inducerade autophagy, men obetydlig celldöd medan JCTH-4 ensamt orsakade signifikant induktion av apoptos med några induktion av autophagy. Intressant, gav kombinationsproportioner behandlingen en drastisk ökning av apoptotiska och autophagic induktion. Vi övervakade tidsberoende morfologiska förändringar i MCF7 celler som genomgår TAM-inducerad autophagy och JCTH-4-inducerad apoptos och autophagy och snabbare celldöd med kombinatorisk behandling med time-lapse mikroskopi. Vi har visat att dessa föreningar inducerar apoptos / autophagy genom mitokondriell målsökning av dessa cancerceller. Viktigt har dessa behandlingar inte påverka överlevnaden av noncancerous humana fibroblaster. Sålunda visar dessa resultat att JCTH-4 i kombination med TAM skulle kunna användas som en säker och mycket potent anti-cancer-terapi mot bröstcancer och neuroblastomceller.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Införandet

Apoptos, eller typ I programmerad celldöd, är en fysiologisk process som kan fungera extrinsically via bindning av ett dödsfall ligand till en död receptor, eller i sig. Den inre vägen för apoptos initieras genom intracellulär stress, såsom DNA-skada och mitokondriell dysfunktion, vilket slutligen leder till permeabilisering av mitokondrier, avledning av mitokondriell membranpotential (MMP), frisättning av apoptogenic faktorer från den mitokondriella intermembrane utrymme, och efterföljande utförande av apoptos 1.

Autophagy är en process i vilken en cell går sönder, försämrar, och återvinner sin intracellulära komponenter under bibehållande integriteten plasmamembranet; den utlöses av olika typer av cellulära påkänningar inklusive oxidativ stress, hypoxi, proteinaggregat, näringsbrist, tillväxtfaktor deprivation, och skadade organeller 2. I inledningsskedetav denna process är cytosoliskt material uppslukas av autophagosomes, dubbel-membraned blåsor, som säkring för att lysosomer att bilda autolysosomes. Inlägg lysosomala fusion, cytosoliska material som tidigare tagits upp av autophagosomes bryts ned av lysosomala enzymer 2. Omfattande aktivering av denna väg ger omfattande nedbrytning av intracellulära komponenter, vilka kan leda till autophagic celldöd eller typ II programmerad celldöd 3.

Undandragande av celldöd har ansetts ett av kännetecknen av cancer 4. Cancer är en sjukdom som kännetecknas av okontrollerad celltillväxt och proliferation 5. I synnerhet uppstår neuroblastom från att utveckla nervceller i det sympatiska nervsystemet från neural crest 6. Det är den vanligaste solida tumören förekommer hos små barn, som står för ca 9% av alla barncancer 7. Även om stora framsteg har gjorts hittills, är denna sjukdom problematisktbåde grundforskare och kliniker. Å andra sidan är bröstcancer den vanligaste cancern bland honor 8. Tamoxifen (TAM) har ofta använts för terapi i hormon-responsiva bröstcancrar som en östrogenreceptor (ER)-antagonist 9. Trots andra rapporter ger belägg för ytterligare oberoende mekanismer för apoptos induktion av Tam. I synnerhet samverkar TAM med komplexa I den mitokondriella andningskedjan (MRC) vid sin flavinmononukleotid (FMN) webbplats 10.

PST är en naturlig förening som isolerats från den Hymenocallis littoralis växten. Jämföra från många kemoterapeutika som används för närvarande, har det visat sig inducera apoptos på ett icke-genotoxisk sätt, selektivt i olika typer av cancerceller via mitokondriell inriktning 11-15. Emellertid har prekliniska och kliniska arbete har hindrats av dess tillgänglighet, den är närvarande vid mycket låga mängder i sin naturliga källa och många complictioner belastning dess kemisk syntes. Vi har syntetiserat och screenades syntetiska analoger av 7-deoxypancratistatin och observerades liknande anti-cancer-aktivitet i en C-1 acetoximetyl-derivat, JC-TH-acetat-4 (JCTH-4) 16. Vi har nu i handen en syntetisk PST analog med potent anti-cancer aktivitet. Det syntes har standardiserats och kan skalas upp för att producera tillräckliga kvantiteter för preklinisk och klinisk arbete. Eftersom naturlig PST och TAM både mål-mitokondrierna, skulle det vara intressant att undersöka de kombinerade effekterna av en syntetisk analog av PST på human bröstcancer och neuroblastomceller i kombination med TAM.

Häri, rapporterar vi selektiva cytotoxiciteten hos JCTH-4 i humana neuroblastom (SH-SY5Y) och bröst-adenokarcinom (MCF7-celler). JCTH-4 kunde inducera apoptos i båda cellinjer genom mitokondriell målsökning; JCTH-4 orsakas avledning av MMP och en ökning i reaktiva syrespecies (ROS)-produktion i isolerad mitochondria från dessa cancerceller. Vidare autophagy inducerad av JCTH-4 i MCF7-celler. Intressant nog tillsats av TAM till JCTH-4 insult förbättras de tidigare nämnda effekterna av JCTH-4 i SH-SY5Y-och MCF7-celler. Morfologiska förändringar som JCTH-4 och TAM ensamma och i kombination i MCF7 celler övervakas via time-lapse mikroskopi av faskontrast eller ljusa bilder fält. Normala humana fetala fibroblaster (NFF) uppvisade en markerad minskning i känslighet för JCTH-4 både ensamma och i kombination med TAM. Därför tyder dessa observationer på JCTH-4, ensamt och i med TAM, för att vara en säker och effektiv kemoterapeutiskt medel mot bröstcancer och neuroblastom.

Material och metoder

1. Cellodling

  1. Växer och kulturen SH-SY5Y-humana neuroblastomceller (ATCC, katalognr. Nr CRL-2266, Manassas, VA, USA) med Dulbeccos modifierade Eagles Medium F-12 HAM (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada) kompletterat med 2 mM L-glutamine, 10% fetalt bovint serum (FBS) och 10 mg / ml gentamicin (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Kanada). Bibehålla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.
  2. Växer och kulturen MCF7 humana celler bröstadenokarcinomceller (ATCC, katalognr. Nr HTB-22, Manassas, VA, USA) i RPMI-1640-medium (Sigma-Aldrich Canada, Mississauga, ON, Kanada) kompletterat med 10% FBS-standard (Thermo Scientific, Waltham, MA) och 10 mg / ml gentamicin (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Kanada). Bibehålla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.
  3. Odla och kultur till synes normala humana foster fibroblast (NFF) cellinje (Coriell Institutet för medicinsk forskning, Cat. Nr AG04431B, Camden, NJ, USA) i Dulbeccos Modified Eagles Medium, Hög glukos (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA ) kompletterat med 15% FBS och 10 mg / ml gentamicin (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Kanada). Bibehålla cellerna vid 37 ° C och 5% CO2.

2. Läkemedel Framställning

  1. Väg upp tamoxifen (TAM) citrat-salt (Sigma-Aldrich, katalognr. Nr T9262, Mississauga, ON, Kanada) och lösa den i DMSO för att framställa en 10 mM förrådslösning. Lagra förrådslösning vid -20 ° C fram till användning. Alla fordon kontroller användes i denna studie innehöll DMSO vid mindre än 0,5%.
  2. Upprepa steg 2,1 för att framställa en 1 mM stamlösning löst i DMSO av JC-TH-acetat-4 (JCTH-4), som produceras av chemoenzymatic syntes från brombensen såsom tidigare beskrivits 16. Lagra förrådslösning vid -20 ° C fram till användning. Alla fordon kontroller användes i denna studie innehöll DMSO vid mindre än 0,5%.

3. Time-Lapse Mikroskopi

  1. Plate ca 2,0 x 10 5 MCF7-celler i 35 botten mm glas odlingsplattor (MatTek Corporation, Cat. Nr P35G-014-C, Ashland, MA, USA) i sterila förhållanden i ett klass II biosäkerhet skåpet och låta dem växa 37 ° C och 5% CO2.
  2. När cellerna når 60 till 70% konfluens, behandla dem med 1 pM JCTH-4 med hjälp av en 1 mMstamlösning löst i DMSO och 10 | iM TAM med användning av en 10 mM stamlösning löst i DMSO, ensamma och i kombination i en klass II biosäkerhet skåp.
  3. Efter behandling av celler under 48 timmar, celler ställe i en uppvärmd kammare vid 37 ° C med 5% CO2 på en fas av en Leica DMI6000 fluorescensmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland).
  4. Med LAS AF6000 mjukvara ställer mikroskopet för att ta faskontrast eller ljusa micrographs fält 400 gångers förstoring var 5: e minut under 18 timmar.

4. Kärnfärgning

  1. Plattan cirka 2,0 x 10 5 MCF7 eller SH-SY5Y-celler i varje brunn i en 6-brunnars klar botten vävnadsodlingsplatta i en klass II biosäkerhet skåp och tillåta dem att växa vid 37 ° C och 5% CO2.
  2. När cellerna når 60 till 70% konfluens, behandla dem med 1 pM JCTH-4 med hjälp av en 1 mM stamlösning löst i DMSO och 10 | iM TAM med användning av en 10 mM stamlösning löst i DMSO, bådeensamma och i kombination i en klass II biosäkerhet skåp.
  3. Inkubera cellerna med de ovannämnda behandlingarna vid 37 ° C och 5% CO2 under 48 timmar (SH-SY5Y-celler) eller 72 timmar (MCF7-celler).
  4. Efter behandling och inkubering av celler med läkemedel, direkt lägga Hoechst 33342 färgämne (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) till mediet i de behandlade cellerna till en slutlig koncentration av 10 pM för att färga kärnan.
  5. Inkubera cellerna med Hoechst-färgämne i 5 till 10 minuter skyddade från ljus.
  6. Placera plattan på scenen av en Leica DM IRB inverterat fluorescensmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland).
  7. Ta fluorescerande och fas mikrografer vid 400x förstoring.

5. Annexin V-bindningsanalys

  1. Plattan cirka 5,0 x 10 5 MCF7-, SH-SY5Y eller celler NFF i 10 kultur ml vävnadsodlingsplattor i en klass II biosäkerhet skåp och tillåta dem att växa vid 37 ° C och 5% CO2.
  2. Whönsägg cellerna når 60 till 70% konfluens, behandla dem med 1 pM JCTH-4 med hjälp av en 1 mM stamlösning löst i DMSO och 10 | iM TAM med användning av en 10 mM stamlösning löst i DMSO, både ensamma och i kombination i en klass II biosäkerhet skåp.
  3. Inkubera cellerna med de ovannämnda behandlingarna vid 37 ° C och 5% CO2 under 48 timmar (SH-SY5Y-celler) eller 72 timmar (MCF7 och NFF celler).
  4. Framställ Annexin V bindningsbuffert i ddHaO 2 O med 10 mM HEPES, 10 mM NaOH, 140 mM NaCl och 1 mM CaCl2 vid pH 7,6 och förvaras vid 4 ° C fram till användning.
  5. Efter behandling och inkubering av celler med läkemedel, ta bort material från plattorna innehållande suspenderade celler och placera den i en separat 15 ml koniskt rör för varje enskild behandlingsgrupp märkt med rätt behandling.
  6. Lösgöra vidhäftande celler från plattorna med trypsin.
  7. Efter det att cellerna lyfts från plattan som ett resultat av trypsin, suga ut mediet placeras i 15 ml koniskaal rör i steg 5,4 och sätt tillbaka i sina ursprungliga plattor med de suspenderade trypsin cellerna.
  8. Med den elektroniska pipetten fyllmedel och serologiska pipetter, blanda materialet med trypsin cellösningen och placera denna blandning tillbaka in i de motsvarande 15 ml koniskt rör.
  9. Centrifugera cellerna vid 600 x g under 5 minuter vid 4 ° C, avlägsna supernatanten från varje rör, och återsuspendera celler i PBS.
  10. Centrifugera cellerna vid 600 x g under 5 minuter, avlägsna supernatanten från varje rör, och återsuspendera celler i märkta mikrofugrör med omkring 50 till 70 | il av Annexin V-bindning buffert.
  11. Tillsätt Annexin V AlexaFluor-488 (01:50) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada) och Hoechst-färgämne till en slutlig koncentration av 10 pM och inkubera under 15 minuter skyddade från ljus.
  12. Efter inkubation virvel en av de mikrofugrör, tillsätt 7 till 10 | il av cellblandningen till ett mikroskopobjektglas, placera ett täckglas över toppen av cellblandningen för den microscope bildspel och ta fluorescerande mikrografer, både Annexin V och Hoechst bilder för varje vy, vid 400 gångers förstoring på en Leica DM IRB inverterat fluorescensmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland). Upprepa detta för varje experimentellt prov i vardera av de återstående mikrocentrifugrör.

6. Vatten lösligt tetrazoliumsalt (WST-1) Analys för cellviabilitet

  1. Trypsinisera en konfluent T75-flaska eller 10 cm vävnadsodlingsplatta av MCF7, SH-SY5Y eller celler NFF i en klass II biosäkerhet skåp.
  2. Efter det att cellerna har lyfts, tillsätt 5 till 10 ml av mediet till trypsin och placera medier cellsuspensionen i ett 15 ml koniskt rör.
  3. Centrifugera cellerna vid 600 x g under 5 minuter, placera röret tillbaka in i höljet biosäkerhet, avlägsna supernatanten från varje rör, och återsuspendera cellerna i ungefär 1 till 3 ml av medium beroende på cellpelleten storlek.
  4. Ställe 10 | il av cellsuspensionen i ett mikrofugrör, tillsätt 10 | il av trypanblått färgämne (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada), och blanda med en mikropipett.
  5. Ladda 10 | il av Trypan Blue suspenderade cellerna på en hemocytometer (Hauser Scientific, USA), räkna cellerna, och beräkna koncentrationen av celler av cellsuspensionen i den ursprungliga 15 ml koniskt rör.
  6. Använda denna koncentration för att bestämma volymen av den ursprungliga cellsuspensionen för att skapa utspädda cellsuspensioner med koncentrationer av 1,5 x 10 5 celler / ml för MCF7-och SH-SY5Y-och 5,0 x 10 4 för NFF celler som behövs för plätering.
  7. Använda utspädda cellsuspensionerna till plattan 15 x 10 3 MCF7 eller SH-SY5Y-celler / brunn eller 5,0 x 10 3 NFF celler / brunn genom att tillsätta 100 pl av den utspädda cellsuspensioner till varje brunn i en 96 brunn klar botten vävnadsodlingsplatta. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 över natten.
  8. Behandla cellerna med 1 | iM JCTH-4 och 10 | iM TAM både ensamma och i kombination i en klass II biosäkerhet skåp för 72 timmarss för MCF7 och NFF celler, och under 48 timmar för SH-SY5Y-celler.
  9. Efter behandling och inkubering av läkemedel, tillsätt 10 | il av WST-1-reagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) till varje brunn och inkubera plattan under 4 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
  10. Ta absorbansavläsningar vid 450 nm på en Wallac Victor 3 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Kanada) och uttrycka dem i procent av lösningsmedlet kontrollgrupperna.

7. Tetrametylrodamin-metylester (TMRM) Färgning

  1. Placera ett täckglas i varje brunn i en 6-brunnars klar botten vävnadskulturplatta och plattan MCF7-celler i varje brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta vid en klass II biosäkerhet skåp. Tillåta dem att växa vid 37 ° C och 5% CO2.
  2. När cellerna når 60 till 70% konfluens, behandla dem med 1 pM JCTH-4 med hjälp av en 1 mM stamlösning löst i DMSO och 10 | iM TAM med användning av en 10 mM stamlösning löst i DMSO,både ensamma och i kombination i en klass II biosäkerhet skåp.
  3. Inkubera cellerna med de ovannämnda behandlingarna vid 37 ° C och 5% CO2 under 72 timmar.
  4. Efter behandling och inkubering av celler med läkemedel, direkt lägga Hoechst 33342 färgämne (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) till mediet i de behandlade cellerna till en slutlig koncentration av 10 pM för att färga kärnan samt tetrametylrodamin-metylester (TMRM ) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Kanada) vid en slutlig koncentration av 200 nM.
  5. Inkubera cellerna med färgämnena vid 5% CO2 och 37 ° C under 45 minuter skyddade från ljus.
  6. Pipettera 8 pl medier eller PBS på ett objektglas och ta ett täckglas från 6 brunnar och placera den ovanpå media eller PBS på objektglaset med cellerna nedåt med pincett.
  7. Ta fluorescerande mikrografer, både Hoechst och TMRM mikrografer för varje vy, med en Leica DM IRB inverterat fluorescensmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) vid 400x förstoring.

8. Mitokondriell Isolering

  1. Framställ ca 10 ml hypoton buffert (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCl, 210 mM mannitol, 70 mM sackaros, 10 | iM Leu-pep, 10 pM Pep-A, och 100 | iM PMSF) och reak-tionsbuffert och hålla båda lösningarna på is.
  2. Med omkring 8 till 10 konfluenta T75-kolvar för vävnadsodling av SH-SY5Y-celler, Trypsinisera celler, tillsätt medier för att neutralisera trypsin, samla cellsuspensioner i 50 ml koniska rör och centrifugera rören vid 600 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
  3. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelletarna i ca 10 till 20 ml kall PBS, centrifugeras rören vid 600 xg under 5 minuter vid 4 ° C, och upprepa denna tvättprocess gång.
  4. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i kall hypoton buffert. Homogenisera cellerna manuellt med en glas-vävnadskvarn och centrifugera cellysatet vid 600 xg under 5 minuter vid 4 ° C.

9. Amplex röda Analys

  1. Efter isolering av mitokondrier från celler, uppskatta koncentrationen av protein i provet av isolerade mitokondrier med hjälp av en standardkurva med kända koncentrationer av 1mg/mL BSA (bovint serumalbumin) med BioRad proteinanalys (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) .
  2. Hjälp av den beräknade koncentrationen av protein i den isolerade mitokondrier lösning, beräkna volymen av denna lösning till att ge 20 ^ g protein. Pipettera denna volym i varje brunn i en opak platta med 96 brunnar för att ladda 20 ^ g protein / brunn.
  3. Fylla varje brunn i plattan till en total volym av 100 | il med reaktionsbuffert, läkemedelsbehandling (med en slutlig koncentration av 1 pM JCTH-4, och / eller 10 pM TAM, eller 250 pM PQ (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON , Canada) användes som en positiv kontroll), Amplex röda reagens vid en slutlig koncentration av 50 | iM, och pepparrotsperoxidas (HRP) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada) i förhållandet 6 U/200 | il.
  4. Efter en 2 h inkubation ta fluorescensavläsningar vid Ex. 560 nm och EM. 590 nm på en spektrofluorometer (SpectraMax Gemini XPS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

10. Cellulära lysatet Preparation

  1. Växa MCF7-celler till 60 till 70% konfluens i 10 cm vävnadskulturplattor.
  2. Behandla celler med 1 | iM JCTH-4 och 10 | iM TAM ensamma och i kombination i 72 timmar med ungefär 10 till 15 plattor per behandlingsgrupp.
  3. Framställ buffert cellys (10 mM Tris-HCl vid pH 7,2, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1% Triton-X-100; 10 pM Leu-pep, 10 pM Pep-A, och 100 | iM PMSF ) och lagra vid 4 ° C fram till användning.
  4. Mekaniskt lösgöra cellerna från plattornas ytor med en cellskrapa och samla upp celler i märkt 50ml koniska rör.
  5. Centrifugera rören vid 600 xg under 5 minuter vid 4 ° C, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpellets i ca 10 till 20 ml kall PBS, Centrifugera rören vid 600 xg under 5 minuter vid 4 ° C, och upprepa denna tvättprocess gång.
  6. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i kall cellysbuffert. Homogenisera cellerna manuellt med en glas-vävnadskvarn och centrifugera cellysatet vid 600 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
  7. Kassera dessa pellets och lagra cellysaten vid -20 ° C fram till användning.

11. Western Blot Analyser

  1. Bestämma proteinkoncentration av cellysat med användning av BioRad proteinanalys (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Utsätta protein prover för SDS-PAGE och överföring protein till ett nitrocellulosamembran.
  2. Efter överföring, block-membran med en 5% vikt / volym mjölk TBST (Tris-buffrad saltlösning Tween-20)-lösning under 1 timme.
  3. Probe membran med en myrai-LC3 antikropp framkallad i kanin (1:500) (Novus Biologicals, Kat nr. NB100-2220, Denver, CO, USA), eller en anti-β-aktin antikropp framkallad i mus (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., kat. nr SC-81.178, Paso Robles, CA, USA) över natten vid 4 ° C.
  4. Föremål membran till en 15 minut och två 5 min tvättar i TBST och inkuberas med en anti-mus (1:2000) eller en anti-kanin (1:2000) pepparrotsperoxidas-konjugerad sekundär antikropp (Abcam, kat nr. Ab6728 & ab6802, Cambridge, MA, USA) under 1 timme vid 4 ° C.
  5. Föremål membran till tre efter varandra följande 5 min tvättar i TBST och visualisera proteinbanden med förstärkt kemiluminescens reagens (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Kanada).
  6. Utförs densitetsfunktioner analyser med hjälp av ImageJ programvara.

12. Monodansylcadaverine (MDC) Färgning

  1. Placera ett täckglas i varje brunn i en 6-brunnars klar botten vävnadskulturplatta och plattan MCF7-celler i varje brunn i en 6och klar botten vävnadskultur platta i en klass II biosäkerhet skåp. Tillåta dem att växa vid 37 ° C och 5% CO2.
  2. När cellerna når 60 till 70% konfluens, behandla dem med 1 pM JCTH-4 med hjälp av en 1 mM stamlösning löst i DMSO och 10 | iM TAM med användning av en 10 mM stamlösning löst i DMSO, både ensamma och i kombination i en klass II biosäkerhet skåp.
  3. Inkubera cellerna med de ovannämnda behandlingarna vid 37 ° C och 5% CO2 under 72 timmar.
  4. Efter behandling och inkubering av celler med läkemedel, direkt lägga Monodansylcadaverine (MDC) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON, Kanada) till en slutlig koncentration av 0,1 mM till varje brunn i 15 min.
  5. Inkubera cellerna med färgämnet vid 5% CO2 och 37 ° C under 15 minuter skyddade från ljus.
  6. Pipettera 30 pl medier eller PBS på ett objektglas och ta ett täckglas från 6 brunnar och placera den ovanpå media eller PBS på objektglas med cellerna Facing nedåt med pincett.
  7. Ta fluorescerande MDC och mikrografer fas för varje vy med en Leica DM IRB inverterat fluorescensmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) vid 400X förstoring.

13. Representativa resultat

Selektiv induktion av apoptos i humant bröstadenokarcinom och neuroblastomceller av JCTH-4: Förbättring av aktivitet av TAM

Selektiv induktion av apoptos som visas i olika cancerceller genom naturlig PST (fig. 1a) 11-13. På grund av den låga tillgängligheten av PST, har vi syntetiserat analoger av 7-deoxypancratistatin (JCTH-4, fig.. 1b) och screenades dem för motsvarande anti-cancer-aktivitet i human bröst-adenokarcinom (MCF7) och neuroblastomceller (SH-SY5Y). I den första fasen av experiment ville vi följa morfologiska förändringar över tid efter behandling med JCTH-4 och TAM ensamma och i kombination i MCF7 cells. MCF7 celler övervakades under 18 timmar, vilket framgår av Video 1 produceras av time-lapse mikroskopi med bilder faskontrast, med lösningsmedel behandling (kontroll) under 48 timmar, dessa celler uppvisade inga större förändringar i morfologi. I motsats, efter 48 timmars 1 pM JCTH-4-behandling, uppvisade dessa celler morfologiska förändringar som är förknippade med apoptos såsom krympning, blåsbildning, apoptotisk kropp bildning, såsom visas i bild 2. Å andra sidan, framställs TAM-behandling enbart i MCF7-celler en mycket distinkt morfologi inklusive punktata inneslutningar som indikerar autophagosomes associerade med autophagy (Video 3). Mycket minimal apoptotiska morfologi observerades och celler i allmänhet uppvisade god morfologi jämförbar med lösningsmedelskontroll behandlade MCF7 celler. Intressant nog, i närvaro av TAM var apoptotiska induktion genom JCTH-4 drastiskt förbättras såsom visas med ökad apoptotisk morfologi i MCF7-celler efter 48 timmar som illustrated i Video 4.

I den andra fasen av experiment använde vi fluorescerande färgämnen för att utvärdera induktion av apoptos. Efter 72 timmar och 48 timmar i 1 | iM JCTH-4-behandling i MCF7-och SH-SY5Y-celler respektive Hoechst färgämne som används och för att övervaka nukleär morfologi. Resultaten indikerade kondenserad, ljust färgade kärnor tillsammans med apoptotiska kroppar i MCF7-och SH-SY5Y-celler, som indikerar apoptotisk induktion (Fig. 2a, b). TAM behandling med enbart gav minimal apoptotiska kärnkraft morfologi i MCF7 och SH-SY5Y celler, kärnor var stora, runda och svagt färgas med Hoechst jämförbar med lösningsmedel kontrollgruppen (Fig. 2a, b). I samförstånd med Video 4, kärnor av MCF7 och SH-SY5Y-celler visade en markant ökning av apoptotiska morfologi med kombinationsbehandlingen efter 72 timmar (Fig. 2a, b).

För att verifiera apoptotiska induktion, cellerna utvärderades för phosphatidylserine utläggning, en markör för apoptos, via en Annexin V bindningsanalys 17. MCF7 och SH-SY5Y-celler behandlades under 72 respektive 48 timmar med 1 | iM JCTH-4 ensamt och i kombination med 10 | iM TAM var positiva för Annexin V-bindning, som visas med den gröna fluorescensen, vilket bekräftar den induktion av apoptos (fig 3a, b ). Ingen uppenbar utläggning av fosfatidylserin observerades i MCF7-och SH-SY5Y-celler behandlade med enbart TAM, såväl som i NFF celler behandlade med alla de ovan nämnda behandlingarna grupperna efter 72 timmar (fig 3c). Därför inducerar JCTH-4 ensamt och i kombination med TAM selektivt apoptos i MCF7-och SH-SY5Y-celler.

För att kvantifiera effekten av JCTH-4 ensamt och i kombination med TAM, WST-1-en kolorimetrisk analys för cellviabilitet, en indikator av aktiv cellmetabolism, utfördes på MCF7 och NFF celler behandlades i 72 timmar och SH-SY5Y-celler behandlades under 48 timmar.Jämfört med de lösningsmedelsbaserade kontrollgrupperna minskade 1 pM JCTH-4 aktiva cellmetabolism med över 50%, medan 10 nM TAM ensam uppvisade ingen signifikant skillnad i både MCF7 och SH-SY5Y-celler (fig. 4a, b). Intressant i MCF7-och SH-SY5Y-celler, resulterade tillsatsen av TAM till JCTH-4 insult i en synergistisk minskning av cellmetabolism. NFF celler var drastiskt mindre känsliga för både JCTH-4 ensamt och JCTH-4 med TAM (fig. 4c). Därför visar JCTH-4 selektiv synergistisk aktivitet med Tam i MCF7 och SH-SY5Y celler.

Mitokondriell Inriktning av JCTH-4

För att se om JCTH-4 riktar mitokondrier att inducera apoptos mitokondriell membranpotential i hela celler och ROS generationens i isolerade mitokondrier övervakades. MCF7-celler behandlades under 72 timmar och färgades med TMRM. 1 pM JCTH-4 minskade MMP, indikeras genom förlust av röd fluorescens (fig 5a). Emellertid, med the tillsättning av 10 M TAM har en större spridning av MMP observerats, medan 10 M TAM ensamt hade ingen uppenbar effekt på MMP.

Som ökar ROS-generering har förknippats med mitokondriemembranet permeabilisering och apoptosinduktion var produktionen av ROS bedömas med Amplex röda färgämnet i isolerade mitokondrier från SH-SY5Y-celler behandlade med 1 pM JCTH-4 och 10 | iM TAM, ensamma och i kombination 18 -20. Fluorescensavläsningar uttrycktes som relativa fluorescensenheter (RFU). Ökningar i ROS-generering observerades med JCTH-4 och TAM enbart (Fig. 5b). Intressant nog gav kombinationsbehandling en större ökning i ROS-produktionen. En väl känd inducerare av ROS-produktionen i mitokondrier, PQ, användes som en positiv kontroll.

Induktion av autophagy genom JCTH-4 och TAM

Autophagic induktion har associerats med kemoterapeutiska förolämpning av många olika föreningar (fig. 6a). Noterbart var intensiteten av färgning MDC störst med kombinationen behandling, följt av TAM enbart och JCTH-4 ensamt.

Under autophagy, mikrotubulus-associerat protein 1 lätt kedja 3 (LC3) normalt ligger i cytosolen (LC3-I), lipiderad med fosfatidyletanolamin och därefter lokaliserad till autophagosomal membran (LC3-II) 2. För att verifiera induktionen av autophagy, var nivåerna av LC3-II utvärderades i MCF7-celler som behandlats under 72 timmar via Western blot-analyser. 1 M JCTH-4 inducerade något omvandlingen av LC3-I till LC3-II medan 10 M TAM fram en större autophagic svar (Fig.6b). Intressant resulterade kombinationsbehandling i den största induktion av autophagy, vilket ger en LC3-II till LC3-I förhållande som är större än 3. Därför visar dessa resultat autophagic induktion i MCF7-celler genom JCTH-4 och TAM ensamma och i kombination, med den största responsen i celler med kombinationsbehandlingen.

Kompletterande Video 1. Cellulär morfologi MCF7 celler som behandlats med lösningsmedel kontroll. MCF7-celler övervakades mellan 48 och 66 timmar efter lösningsmedelskontroll behandling (DMSO) med time-lapse mikroskopi med bilder faskontrast. Cellerna hölls vid 37 ° C och 5% CO2. Bilder fångades 400 gångers förstoring. Klicka här för att titta på video .

Kompletterande Video 2. Induktion av apoptotiska cellulär morfologi i MCF7 celler som behandlats med JCTH-4. MCF7-celler övervakades mellan 48 och 66 timmar efter behandling witH 1 M JCTH-4 med time-lapse mikroskopi med bilder faskontrast. Cellerna hölls vid 37 ° C och 5% CO2. Bilder fångades 400 gångers förstoring. Klicka här för att titta på video .

Kompletterande Video 3. Induktion av autophagic cellulär morfologi i MCF7 celler som behandlats med TAM. MCF7-celler övervakades mellan 48 och 66 timmar efter behandling med 10 M TAM med time-lapse mikroskopi med bilder faskontrast. Cellerna hölls vid 37 ° C och 5% CO2. Bilder fångades 400 gångers förstoring. Klicka här för att titta på video .

Kompletterande Video 4. Förbättrad apoptotiska morfologi genom JCTH-4 med TAM i MCF7 celler. MCF7-celler övervakades mellan 48 och 66 timmar efter behandling med både 1 pM JCTH-4 och 10 | iM TAM användning tidsförlopp mikroskopi med fasen fortsRast bilder. Cellerna hölls vid 37 ° C och 5% CO2. Bilder fångades 400 gångers förstoring. Klicka här för att titta på video .

Figur 1
Figur 1. Strukturell jämförelse av PST till en syntetisk 7-deoxi-analog. (A) Kemisk struktur av pankratistatin (PST). (B) Kemisk struktur av JC-TH-acetat-4 (JCTH-4).

Figur 2
Figur 2. JCTH-4 inducerar nukleär apoptotiska morfologi med ökad aktivitet med TAM. Nukleär morfologi av (a) MCF7 och (b) SH-SY5Y-celler behandlades under 72 respektive 48 timmar med de indikerade koncentrationerna av Tam och JCTH-4 färgades med Hoechst-färgämne. Kontrollgrupper behandlades med lösningsmedel (DMSO). Bilder togs vid 400x förstoring på ett fluorescensmikroskop. Skalstreck = 15 pm.

Figur 3
Figur 3. JCTH-4 orsaker fosfatidylserin utläggning ensamma och i kombination med TAM selektivt i cancerceller. Annexin V-bindning till externaliserats fosfatidylserin utvärderades för att verifiera induktionen av apoptos induktion i (a) MCF7 (72 timmar), (b) SH-SY5Y (48 timmar), och (c) NFF (72 timmar) celler behandlade med JCTH-4 och TAM vid de angivna koncentrationerna. Kontrollgrupper behandlades med lösningsmedlet (DMSO). Bilder togs vid 400x förstoring på ett fluorescensmikroskop. Skalstreck = 15 pm.

Figur 4
Figur 4. TAM ökar lönsamheten minskning med JCTH-4 selektivt i cancerceller. 96-brunnars plattor såddes wie (en) MCF7, (b) SH-SY5Y, och (c) NFF celler och behandlades med JCTH-4 och TAM vid de angivna koncentrationerna. MCF7 och NFF celler behandlades i 72 timmar och SH-SY5Y behandlades under 48 timmar. Skicka läkemedelsbehandling och inkubering WST-1-reagens sattes till varje brunn och absorbansen avlästes vid 450 nm och uttrycktes som en procentandel av kontrollen (DMSO). Statistik utfördes med GraphPad Prism version 5,0. Värdena är uttryckta som medelvärde ± SD från kvadruplikat av 3 oberoende experiment. MCF7: * p <0,001, ** p <0,0001 mot kontroll; # p <0,05 kontra 1 pM JCTH-4; † p <0,0001 jämfört med 10 | iM TAM. SH-SY5Y: * p <0,0005 mot kontroll; # p <0,005 kontra 1 pM JCTH-4; † p <0,005 kontra 10 pM TAM. NFF: * p <0,005 kontra 10 pM TAM + 1 | iM JCTH-4 i MCF7-celler; # p <0,01 kontra 10 pM TAM + 1 | iM JCTH-4 i SH-SY5Y-celler.

Figur 5
Figur 5. JCTH-4 och TAM verkar på mitokondrier. (En) MCF7-celler odlades på täckglas och behandlades med de indikerade koncentrationerna av läkemedel under 72 timmar och färgades med TMRM att utvärdera MMP. Celler i kontrollgruppen behandlades med lösningsmedlet (DMSO). Bilderna togs vid 400x förstoring på ett fluorescensmikroskop. Skalstreck = 15 pm. (B) isolerade mitokondrier från SH-SY5Y-celler behandlades med JCTH-4 och TAM vid de angivna koncentrationerna och ROS-produktion bestämdes med Amplex röda substrat i närvaro av pepparrotsperoxidas (HRP). Till kontrollgruppens cellerna behandlades med lösningsmedlet (DMSO). Paraquat (PQ) användes vid en koncentration av 250 pM som en positiv kontroll. Fluorescensavläsningar erhölls efter 2 timmars behandling vid Ex. 560 nm och EM. 590 nm och uttrycks som relativa fluorescencE-enheter (RFU). Statistik erhölls med GraphPad Prism version 5,0. Data är representativa för 3 oberoende experiment med liknande trender. Värdena är uttryckta som medelvärde ± SD av kvadruplikat i 1 oberoende test. * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,001 mot kontroll; # p <0,05 kontra 1 pM JCTH-4; † p <0,05 kontra 10 pM TAM; @ p <0,05 mot 250 jiM PQ.

Figur 6
Figur 6. TAM förbättrar autophagic induktion av JCTH-4. (En) MCF7-celler odlades på täckglas och utsattes för JCTH-4 och TAM uttömning vid de angivna koncentrationerna under 72 timmar. Kontrollgruppens celler behandlades med lösningsmedlet (DMSO). Efterbehandling var MCF7-celler färgades med MDC att detektera autophagic vakuoler. Bilderna togs vid 400x förstoring på ett fluorescensmikroskop. Skalstreck = 15 pm. (B) Western blot-analyser utfördes för LC3 och β-aktin på cellysat från MCF7-celler behandlade med de indikerade koncentrationerna av läkemedel under 72 timmar. Densitometriska analyser utfördes med hjälp ImageJ programvara. Statistik utfördes med GraphPad Prism version 5,0. Värdena är uttryckta som medelvärde ± SD. * P <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005 mot kontroll; # p <0,001 kontra 1 pM JCTH-4; † p <0,001 kontra 10 pM TAM.

Förkortningar.

ER östrogenreceptor
FMN flavinmononukleotid
JCTH-4 JC-TH-acetat-4
LC3 mikrotubulus-associerat protein 1 lätt kedja 3
MDC monodansylcadaverine
MMP mitochondrIAL membranpotential
MRC mitokondriella andningskedjan
NFF normalt humant fetalt fibroblast
PQ parakvat
PST pankratistatin
RFU relativa fluorescensenheter
ROS reaktiva syrespecies
TAM tamoxifen
TMRM tetrametylrodamin metylester

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PST och liknande föreningar har visats ha anti-canceregenskaper 11-15,21. Vi har tidigare rapporterat naturligt PST att destabilisera mitokondrierna selektivt i cancerceller, som därmed inducerar apoptos genom frisättning av apoptogenic faktorer 12,14. Det är mest troligt att JCTH-4 verkar genom samma mekanism; JCTH-4 orsakas MMP kollaps i MCF7-celler som ses med TMRM färgning (fig. 5a), och ökad produktion av ROS i isolerade mitokondrier från SH-SY5Y-celler (Fig. 5b), tyder på mitokondriell dysfunktion. Sålunda är induktion av apoptos genom JCTH-4 mest sannolikt genom mitokondriell målsökning i cancerceller.

Ett stort antal skillnader mellan noncancerous och cancer celler som skulle kunna ligga till grund för cancer selektivitet med JCTH-4. Cancerceller är mycket beroende av glykolysen och mindre på mitokondrier för energiproduktion, detta fenomen kallas enär det Warburg effekten 22. Sådan metabolisk aktivitet i cancercellerna leder till hög surhet i cytosolen. Följaktligen bidrar sura cytosoliska miljön cancercell mitokondrier hyperpolarisering som har kopplats till en ökad förmåga att invadera och undvika apoptos 23. Hyperpolariztion av cancercell mitokondrier emellertid kan göra cancerceller känsliga för JCTH-4, en gång tas in i cellen, kan JCTH-4 förvärva en positiv laddning genom enzymatisk behandling och kan selektivt tas upp i cancercellen mitokondrier på grund av deras hyperpolariserade natur. Dessutom har en rad mitokondrier tillhörande antiapoptotiska proteiner har visat sig vara mycket uttryckas i cancerceller som förbjuder mitokondriemembranet permeabilisering och efterföljande genomförande av apoptos som antiapoptotiska proteiner från Bcl-2-familjen av proteiner 24-26.

I närvaro av olika former av cellulär stress, är autophagy utlöses somen pro-överlevnad svar, så cellerna att överleva under ogynnsamma förhållanden 2. Överstimulering av denna väg kan emellertid leda till omfattande nedbrytning av vitala intracellulära komponenter som ger upphov till autophagic celldöd 3. Både pro-överlevnad och pro-döden autophagic svar har satts i samband med kemoterapeutisk förolämpning 3. Mitokondriell dysfunktion genom JCTH-4 leder till oxidativ stress kan utlösa ett automatiskt standard autophagic svar. I själva verket gjorde vi observerar en del autophagic induktion tillsammans med apoptos med JCTH-4 behandling (Fig. 2a, b 3a, b 6a, b). Även TAM har väl etablerat som ett ER antagonist i ER positiva bröstcancerceller har det nyligen visats att interagera med mitokondrier, bindning till FMN platsen för Complex I 10. Vidare är TAM en väl känd inducerare av autophagy över många typer av cancerceller 3. I själva verket gjorde TAM orsaka en ökning av ROS generation isolerad mitochondria (fig. 5b). Visade sig emellertid sådan interaktion vara otillräcklig för att orsaka kollaps MMP (fig. 5a), men tillräcklig för att inducera en typisk pro-överlevnad autophagic respons. Omfattande autophagic induktion observerades när JCTH-4 och TAM användes i kombination (fig. 6a, b), vilket åtföljdes av en förstärkt cytotoxisk respons (Fig. 4a, b), vilket tyder på en pro-död autophagic svar; ändå cancercellerna dör så småningom från apoptos till följd av mitokondriell permeabilisering och apoptogenic faktor frisättning. Sådan allergi vid TAM till JCTH-4 förolämpning kan tillskrivas ökningen av ROS generation med TAM. Eftersom både Tam och JCTH-4 förmår generera oxidativ stress, kan den kombinatoriska framställningen av sådan stress med båda föreningarna leda till omfattande autophagic induktion ger upphov till en skadlig autophagic svar och / eller omfattande mitokondriell permeabilisering och efterföljande apoptos. Thär kombinerad behandling påverkar inte lönsamheten för noncancerous fibroblaster (Fig. 4c). Dessa fynd tyder på att JCTH-4 ensamt och i kombination med TAM kan användas effektivt för att behandla bröstcancer och neuroblastom utan att orsaka negativa effekter på noncancerous celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete har stötts av riddarna av Columbus kapitel 9671 (Windsor, Ontario) och en CIHR Frederick Banting och Charles Best Kanada Graduate stipendium till Dennis Ma. Tack till Robert Hodge och Elizabeth Fidalgo da Silva för deras hjälp med time-lapse mikroskopi. Tack till Katie Facecchia för att redigera time-lapse mikroskopi videor. Vi vill också tacka Sudipa juni Chatterjee och Phillip Tremblay för kritisk granskning av detta manuskript. Detta arbete är tillägnat till minne av Kevin Couvillon som förlorade sin kamp mot cancer under 2010.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SH-SY5Y cell line ATCC CRL-2266
Dulbecco’s Modified Eagles Medium F-12 HAM Sigma-Aldrich 51448C
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16000-044
MCF7 cell line ATCC HTB-22
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R 0883
Apparently normal human fetal fibroblast cell line (NFF) Coriell Institute for Medical Research AG04431B
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, High Glucose medium Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30022.01
Tamoxifen citrate salt Sigma-Aldrich T9262
35 mm glass bottom culture dishes MatTek Corp. P35G-014-C
Leica DMI6000 B inverted microscope Leica Microsystems N/A
H–chst 33342 dye Molecular Probes, Life Technologies H3570
Leica DM IRB inverted fluorescence microscope Leica Microsystems N/A
Annexin V AlexaFluor-488 Invitrogen A13201
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154-20ML
Haemocytometer Fisher Scientific 267110
WST-1 reagent Roche Group 11644807001
Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter PerkinElmer, Inc. 1420-011
Tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) GIBCO, by Life Technologies T-668
Glass tissue grinder Fisher Scientific K8885300-0002
BioRad protein assay Bio-Rad 500-0001Bottom of Form
Amplex Red Invitrogen A12222
Horseradish peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8125
SpectraMax Gemini XPS Molecular Devices 3126666
Anti-LC3 antibody raised in rabbit Novus Biologicals NB100-2220
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6728
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody Abcam ab6802
Chemiluminescence peroxidase substrate Sigma-Aldrich CPS160
Monodansylcadaverine Sigma-Aldrich 30432

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Earnshaw, W. C. Apoptosis. A cellular poison cupboard. Nature. 397, 387-389 (1999).
  2. Kroemer, G., Mariño, G., Levine, B. Autophagy and the integrated stress response. Mol. Cell. 40, 280-293 (2010).
  3. Dalby, K. N., Tekedereli, I., Lopez-Berestein, G., Ozpolat, B. Targeting the prodeath and prosurvival functions of autophagy as novel therapeutic strategies in cancer. Autophagy. 6, 322-329 (2010).
  4. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  5. Fearon, E. R. Human Cancer Syndromes: Clues to the Origin and Nature of Cancer. Science. 278, 1043-1050 (1997).
  6. Tsokos, M., Scarpa, S., Ross, R. A., Triche, T. J. Differentiation of human neuroblastoma recapitulates neural crest development. Study of morphology, neurotransmitter enzymes, and extracellular matrix proteins. The American Journal of Pathology. 128, 484-496 (1987).
  7. Schwab, M., Westermann, F., Hero, B., Berthold, F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 4, 472-480 (2003).
  8. Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Thun, M. J. Cancer statistics, 2009. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
  9. Howell, A. The endocrine prevention of breast cancer. Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 615-623 (2008).
  10. Moreira, P., Custodio, J., Morena, A., Oliveira, C., Santos, M. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J. Biol. Chem. 281, 10143-10152 (2006).
  11. Kekre, N., Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin causes early activation of caspase-3 and the flipping of phosphatidyl serine followed by rapid apoptosis specifically in human lymphoma cells. Cancer Chemother. Pharmacol. 56, 29-38 (2005).
  12. McLachlan, A., Kekre, N., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin: a natural anti-cancer compound that targets mitochondria specifically in cancer cells to induce apoptosis. Apoptosis. 10, 619-630 (2005).
  13. Griffin, C., Hamm, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis in clinical leukemia samples with minimal effect on noncancerous peripheral blood mononuclear cells. Cancer Cell Int. 10, 6 (2010).
  14. Griffin, C., Karnik, A., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin selectively targets cancer cell mitochondria and reduces growth of human colon tumor xenografts. Molecular Cancer Therapeutics. 10, 57-68 (2011).
  15. Griffin, C., McNulty, J., Pandey, S. Pancratistatin induces apoptosis and autophagy in metastatic prostate cancer cells. Int. J. Oncol. 38, 1549-1556 (2011).
  16. Collins, J., Rinner, U., Moser, M., Hudlicky, T., Ghiviriga, I., Romero, A. E., Kornienko, A., Ma, D., Griffin, C., Pandey, S. Chemoenzymatic synthesis of Amaryllidaceae constituents and biological evaluation of their C-1 analogues. The next generation synthesis of 7-deoxypancratistatin and trans-dihydrolycoricidine. J. Org. Chem. 75, 3069-3084 (2010).
  17. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R., Yan, G. Early detection of apoptosis using a fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques. 23, 525-531 (1997).
  18. Madesh, M., Hajnóczky, G. VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release. J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).
  19. Simon, H. U., Haj-Yehia, A., Levi-Schaffer, F. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction. Apoptosis. 5, 415-418 (2000).
  20. Batandier, C., Leverve, X., Fontaine, E. Opening of the mitochondrial permeability transition pore induces reactive oxygen species production at the level of the respiratory chain complex I. J Biol Chem. 279, 17197-17204 (2004).
  21. Lefranc, F., Sauvage, S., Goietsenoven, G. V. an, Mégalizzi, V., Lamoral-Theys, D., Debeir, O., Spiegl-Kreinecker, S., Berger, W., Mathieu, V., Decaestecker, C., Kiss, R. Narciclasine, a plant growth modulator, activates Rho and stress fibers in glioblastoma cells. Mol. Cancer Ther. 8, 1739-1750 (2009).
  22. Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
  23. Heerdt, B. G., Houston, M. A., Augenlicht, L. H. Growth properties of colonic tumor cells are a function of the intrinsic mitochondrial membrane potential. Cancer Res. 66, 1591-1596 (2006).
  24. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  25. Casellas, P., Galiegue, S., Basile, A. S. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem. Int. 40, 475-486 (2002).
  26. Mathupala, S. P., Rempel, A., Pedersen, P. L. Aberrant glycolytic metabolism of cancer cells: a remarkable coordination of genetic, transcriptional, post-translational, and mutational events that lead to a critical role for type II hexokinase. J. Bioenerg. Biomembr. 29, 339-343 (1997).
Förbättring av apoptotiska och Autophagic Induktion av en ny syntetisk C-1-analog av 7-deoxypancratistatin i human bröstadenokarcinoma och neuroblastomceller med Tamoxifen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).More

Ma, D., Collins, J., Hudlicky, T., Pandey, S. Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen. J. Vis. Exp. (63), e3586, doi:10.3791/3586 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter