Microcapsule الجينات كمنصة 3D لإكثار وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) إلى أنساب مختلفة
Summary
وقد الأمثل لدينا تقنية الكبسلة باعتبارها منصة 3D فعالة لنشر وتمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى الأديم الباطن والخلايا العصبية الدوبامين (DA). كما أنه يوفر فرصة للمناعة عزل الخلايا من المضيف خلال زرع. ويمكن تكييف هذه المنصة لأنواع الخلايا الأخرى.
Abstract
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) آخذة في الظهور كمصدر بديل جذاب لعلاج استبدال الخلية حيث يمكن التوسع فيها في الثقافة إلى أجل غير مسمى ومتباينة إلى أي نوع من أنواع الخلايا في الجسم. وتم أيضا أنواع مختلفة من المواد الحيوية المستخدمة في مزارع الخلايا الجذعية لتوفير المكروية محاكاة المتخصصة الخلايا الجذعية 1-3. وهذا الأخير هو هام لتعزيز الخلية الى خلية التفاعل، وتكاثر الخلايا، وتمايز في الأنساب محددة، فضلا عن تنظيم الأنسجة عن طريق توفير ثلاثي الأبعاد (3D) البيئة (4) مثل التغليف. مبدأ التغليف الخلية ينطوي انحباس الخلايا الحية داخل حدود شبه منفذ الأغشية في الثقافات 3D 2. هذه الأغشية تسمح لتبادل الاوكسجين والمغذيات والمحفزات عبر الأغشية، في حين يتم استبعاد الأجسام المضادة والخلايا المناعية من المضيف أن تكون أكبر من حجم المسام كبسولة 5. هنا، نحن مسبقاأرسلت نهجا للثقافة وتفرق hESC DA الخلايا العصبية في المكروية 3D باستخدام كبسولات الجينات. عدلت نحن شروط ثقافة 2 إلى تعزيز جدوى hESC مغلفة. أظهرنا سابقا أن إضافة ملفوف لفائف p160-رو المرتبطة المانع (روك) كيناز، Y-27632 والبشرية الجنين الليفية مكيفة المتوسطة استبدال المصل (HFF-CM) إلى منصة 3D تعزز إلى حد كبير جدوى hESC مغلفة الذي أعرب فيه خلايا نهائي الجينات علامة الأديم الباطن 1. وقد استخدمنا الآن هذه المنصة 3D لنشر التفرقة hESC وفعالة لالخلايا العصبية DA. تحليل التعبير الجيني البروتين وبعد المرحلة النهائية من تمايز الخلايا العصبية DA أظهرت تعبير زيادة هيدروكسيلاز التيروزين (TH)، وهي علامة للحصول على الخلايا العصبية DA،> 100 طيات بعد 2 أسابيع. افترضنا أن لدينا منصة 3D باستخدام كبسولات الجينات قد تكون مفيدة لدراسة انتشار الأسلحة النووية والموجهة التمايزمن hESC إلى مختلف الأنساب. هذا نظام 3D كما يسمح الفصل بين الخلايا المغذية من hESC خلال عملية التمايز، وأيضا احتمالات العزلة المناعة خلال زرع في المستقبل.
Protocol
Discussion
وقد أثبتت العديد من الدراسات التي تستخدم الخلايا الجذعية الجنينية وhESC فوائد نظام ثقافة 3D في المواد الحيوية وهندسة الأنسجة 2،3. كنا كبسولات ألجينات الكالسيوم ومنصة 3D مناسبة لدراسة انتشار hESC والتمايز مقارنة الجينات الباريوم منذ hESC أظهرت ارتفاع كبير جدوى عندما م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من جانب NHMRC برنامج منح # 568969 (PSS) وكلية الطب في جامعة نيو ساوث ويلز، الجذعية مبادرة الخليوي (KSS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Notes |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovoMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter healthcare | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era Pump Systems Inc | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R & D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R & D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Orive, G. Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
