Summary
Мы оптимизировали микрокапсулированию технике в качестве эффективного 3D платформой для распространения и дифференциации эмбриональных стволовых клеток энтодермы и дофаминергических (ДА) нейронов. Он также дает возможность иммунной изоляции клеток из принимающих при пересадке. Эта платформа может быть адаптирована и для других типов клеток.
Abstract
Эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) становятся привлекательным альтернативным источником для клеточной терапии, поскольку они могут быть расширены в области культуры на неопределенный срок и дифференцированы в любой типов клеток в организме. Различные виды биоматериалов были также использованы в культурах стволовых клеток, чтобы обеспечить микросреды имитируя ниша стволовых клеток 1-3. Последнее важно для продвижения клетки к клетке взаимодействия, клеточную пролиферацию и дифференцировку в конкретных линий, а также ткани организации путем предоставления трехмерной (3D) окружающей среды 4, такие как инкапсуляция. Принцип инкапсуляции ячейка включает в себя захват живых клеток в пределах полупроницаемых мембран в 3D культур 2. Эти мембраны позволяют обмен питательных веществ, кислорода и стимулов через мембраны, в то время как антитела и иммунные клетки от хоста, который больше, чем капсула размером пор исключены 5. Здесь мы предварительнопослал подход к культуре и дифференцировать чЭСК DA нейронов в 3D микроокружения использовании альгината микрокапсулы. Мы изменили культуру условиях 2 по повышению жизнеспособности инкапсулированных чЭСК. Ранее нами было показано, что добавление p160-Ро связанных биспиральных киназы (ROCK) ингибитор, Y-27632 и человеческих эмбриональных фибробластов с кондиционером сыворотки среднего замены (HFF-СМ) в 3D-платформа значительно повысить жизнеспособность капсулированных чЭСК , в которой клетки выразил окончательное маркерных генов энтодермы 1. Мы уже использовали этот 3D платформой для распространения дифференциации чЭСК и эффективно DA нейронов. Анализ белков и экспрессии генов после заключительного этапа DA нейронов дифференциации показал повышение экспрессии тирозингидроксилазы (TH), маркер для DA нейронов,> 100 складок через 2 недели. Мы предположили, что наши 3D-платформы с помощью альгината микрокапсулы могут быть полезны для изучения распространения и направленной дифференцировкииз чЭСК различных линий. Этот 3D-система также позволяет разделения фидерных клеток из чЭСК в процессе дифференциации, а также имеет потенциал для иммунной изоляции при пересадке в будущем.
Protocol
Все описанные ниже проводятся с использованием асептических методов внутри класса II биобезопасности Кабинета министров. Реактивы и оборудования, используемого перечислены в таблице ниже.
1. Подготовка 1,1% альгината (вес / объем)
- Добавить 0,275 г очищенного альгинат натрия (с высоким содержанием глюкуроновой кислоты ≥ 60%, вязкость> 200 мПа с, а эндотоксина ≤ 100 EU / г) в 50 мл стерильной трубки и добавить 25 мл стерильного 0,1% раствора желатина подготовленные ранее (0,5 г gelatin/500 мл Milli-Q H 2 O и растворяется автоклавирование).
- Вихревые трубки в течение примерно 30 секунд, чтобы частично растворяются альгинат порошок затем поместить трубку на орбитальном смесителе в 10 мкг на ночь (комнатной температуры).
- Добавить 2,778 мл 9% стерильный NaCl (4,5 г NaCl/50 мл Milli-Q H 2 O) в 25 мл альгинат решение. Вихревые трубы в течение 30 секунд с последующим центрифугированием при 95 мкг в течение 5 мин.
- Хранить раствор альгината при 4 °; C для кратковременного хранения (1-2 месяца) или при -20 ° С для длительного хранения (около года).
2. Подготовка CaCl 2 Осадки ванной
- Растворите 14,7 г CaCl 2. 2H 2 O и 2,38 г HEPES в 1 литре Milli-Q H 2 O.
- Отрегулируйте уровень рН до 7,4.
- Стерилизовать решения с использованием 0,22 мкм фильтр.
- Осадки ванной можно хранить при комнатной температуре (6-12 месяцев).
3. Подготовка Decapsulating решения
- В 500 мл фосфат Дульбеко буферном растворе (D-PBS), добавляют 50 мл 0,5 М ЭДТА и 5 мл 1 М HEPES.
- Стерилизовать использованием 0,22 мкм фильтр или автоклаве при температуре 121 ° С в течение 20 мин.
- Хранить decapsulating раствора при комнатной температуре (6-12 месяцев).
4. Подготовка сыворотки замены (SR) средней
- До инкапсуляции, подготовить SR средние заранее, так как де-описаны в таблице конкретных реагентов и оборудования.
5. Подготовка ингибиторов ROCK (Y-27632)
- Развести Y-27632 порошка в 0,1% сывороточного альбумина человека (HSA) в D-PBS, чтобы 5 мМ раствора.
6. Подготовка чЭСК для инкапсуляции
- Предварительная обработка клеток с культивированием СМИ с добавлением 10 мкМ ROCK ингибитор (RI) в течение двух часов при температуре 37 ° C (защиты от света).
- После того, как RI лечение, мытье клеток с D-PBS в два раза и выбить из клеток культуры пластин ферментативно с accutase в течение 10 мин при 37 ° C.
- Аккуратно очистить клетки с скребок пипетки или клетки и собирают в 15 мл трубку. Нейтрализовать accutase с SR среды в соотношении 1:1.
- Для подготовки суспензии отдельных клеток, фильтровать нейтрализованы клеток с использованием 40 мкм фильтр и собрать в свежем 50 трубы центрифуги мл.
- Подсчитать общее количество клеток в использовании решение hemacytometer. Центрифуга клеточной суспензии 95 мкг в течение 5 мин и тщательно отбросить супернатант после этого. Вымойте клеток с предварительно нагретым 0,9% NaCl. Центрифуга 95 мкг в течение 5 мин и отказаться от супернатант.
7. Инкапсуляции клеток
- Подготовить 1 мл шприц прилагается к мягкой пластиковой трубки из 14G х 2 "катетер. Это используется для аспирации суспензии клеток должны быть загружены на шприцевой насос, как показано на рисунке 1.
- Ресуспендируют клеток с предварительно нагретым альгинат решение при плотности 1,25 млн. кл / мл альгината. Аккуратно перемешайте со шприцем и избежать создания пузырей.
- Установите шарик генератор, шприцевой насос и расходомера воздуха, как показано на рисунке 1. Более подробную информацию об этих устройств приведены в таблице конкретных реагентов и оборудования.
- С клетки атмосферный в шприц, отказаться от пластиковой трубки катетер и приложить шприц к инкапсуляции машины. Убедитесь, что есть 10 см зазора между концу инкапсуляции машины и сборный пункт, как показано на рисунке 1.
- Инкапсуляция клеток путем установки шприца на 20 мл / ч, расход воздуха на 8 л / мин и давлении 100 кПа (размер капсулы может быть изменена путем изменения расхода воздуха).
- Соберите инкапсулированные клетки в чашке Петри (100 х 15 мм), заполненной 20 мл подогретого осадков ванну в течение 7 мин для стабилизации капсулы.
- Передача инкапсулированные клетки, осторожно стремление в 50 мл пробирок заполнены с 20 мл 0,9% раствора NaCl.
- Позвольте капсулы, чтобы обосноваться в нижней части трубы, то мягко отказаться от супернатант. Повторите процесс стирки с 0,9% NaCl.
- Ресуспендируют инкапсулированные клетки в предварительно нагретой культивирования среде с RI (10 мкм), передача в культуру колбу и выдерживают при 37 ° C / 5% CO 2.
8. Дифференциация Encapsulated чЭСК Д. А. Нейроны
ve_content "> инкапсулированные чЭСК относятся с RI в течение 3 дней до дифференциации.- Семенной мыши стромальной клеточной линии, ПА6 клеток при плотности 1,0 х 10 4 на см 2 в 0,1% желатином покрытием колбы T75 и состояние ПА6 клеток в DA нейронных дифференциации среднего (материалы см. таблицу) за 24 часа до дифференциации.
- Передача капсулы по 50 мл центрифужные пробирки и дать им возможность обосноваться в нижней части трубы.
- Удалите супернатант и ресуспендируют капсулы в PA6 камера с кондиционером DA нейронных среднего дифференциации.
- Культура инкапсулированные чЭСК с ПА6 клеточный монослой (9 х 10 6 ЭСК в 7,5 х 10 5 клеток ПА6) в течение 28 дней с изменением средств массовой информации на 4-й день и через день после этого (изменится только половину средней каждый раз).
- Через 3 недели в культуре клеток с ПА6, дополнять DA нейронных среднего дифференцирование 100 нг / мл SHH и 100 нг / мл FGF8a на оставшуюся неделю.
9. Декапсуляция инкапсулированных чЭСК
- Аспирируйте капсулы в 15 мл центрифужные пробирки и дать им возможность поселиться в нижней части трубы. Затем отбросить супернатант тщательно.
- Вымойте капсулы с D-PBS в два раза. Пусть капсулы оседают на дне пробирки затем удалите супернатант.
- Добавьте 5 мл decapsulating решение капсулы. Смешать подвески тщательно через стремление до инкубации при комнатной температуре в течение 4-5 мин.
- Центрифуга декапсулируются клеток на 95 мкг в течение 3 минут и удалите супернатант.
- Промойте осадок клеток с D-PBS с последующим центрифугированием при 95 мкг в течение 3 мин. Повторите.
- Декапсулируются клеток может быть дальше, как культурный монослоя или использовать для последующих анализа.
10. Представитель Результаты
Диаметр альгината микрокапсулы составляет 400-500 мкм. Количество клеток в капсулу было оцеред путем подсчета общего количества клеток, поделенное на общее количество капсул в перспективе. Таким образом, около 5,0 х 10 4 клеток в капсуле был оценен. Из этого мы исходим из того, что максимальное количество ячеек, капсула может содержать примерно 1,0 х 10 5. Жизнеспособность инкапсулированные чЭСК составляет> 80% (рис. 2), определяется с помощью использования карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidly эфира (CFDA) / пропидия йодид (PI) анализа. Мы оптимизировали условия чЭСК инкапсуляции за счет уменьшения концентрации альгината с 2,2% до 1,1%, а за счет изменения осадков ванны из хлористого бария хлорида кальция. Из этих условий, мы показали, что только те ячейки, которые инкапсулируются с 1,1% альгинат кальция может выжить, размножаются и образуют ЭТ в пробирке 1. Для дальнейшей оптимизации условий, влияние средств массовой информации и культивирования Р.И., Y-27632 были исследованы. Данные, представленные на рисунке 2 и 3 показывают, что RI preventeг диссоциации-индуцированного апоптоза и поддерживать жизнеспособность клеток и способствует формированию кластера 1,6. Кроме того, жизнеспособность капсулированных чЭСК культивировали в HFF-CM RI + была значительно выше, чем в других группах без RI добавок, однако это существенно не отличаются от инкапсулированного чЭСК культивировали в РИ SR +. Кроме того, клеточную пролиферацию использовании BrdU анализа увеличилась с 25% до 75%, как отдельные клетки превратились в кластеры (рис. 3). Апоптоз анализ по TUNEL показал, что отдельные клетки в микрокапсулы культивировали в среде SR были апоптоза (данные не представлены), а полученный кластеров HFF-CM были в основном отрицательными TUNEL. В определенной степени, HFF-CM дополнить bFGF также способствовало выживанию и распространению инкапсулированные ЭСК в отсутствие Y-27632. Тем не менее, обращение с Y-27632 до (2 часа) и после инкапсуляции (для 4 дополнительных дней) заметно усиливаются жизнеспособность, пролиферацию и формирование кластера чЭСК инкапсулированныхв 1,1% микрокапсулы, альгинат кальция.
Ранее мы показали, что инкапсулированные чЭСК можно успешно дифференцировать к окончательному энтодермы 1. Здесь мы рассмотрели применение клеточной инкапсуляции в 3D платформу дифференцировать инкапсулированные чЭСК в нейроны DA. чЭСК, которые сформировали эмбриоидные тела (ИС) в капсулах были прямыми и дифференцированных по декапсуляция в условиях, описанных показал прогрессивный нейронной морфологии (рис. 4) через 2-3 дней культуры с более чем 90% жизнеспособность. Анализ экспрессии генов показал вниз регулирования плюрипотентных маркеров, в то время как OCT4 neuroprogenitor маркер, PAX6 и DA нейронов маркер, TH выросли, регулируется через 7 дней дифференциации (рис. 5а). Иммунофлуоресцентного окрашивания показали, что дифференцированные чЭСК были PAX6-положительным (> 80%), но OCT4-отрицательных в день 7. Далее дифференцированный чЭСК показал TH-положительным (> 90%) нейронов после 21 дней (рис. 5В). Вестерн-блот анализ также показал,до регуляции TH выражение из 14-й день (рис. 5С), а PAX6 выражение было вниз регулируется после 21-й день. Для сравнения, клетки культивируют в двумерной (2D) среды при аналогичных условиях (например, RI предварительной обработки в течение 2 часов и RI после лечения в течение 3 дней до дифференциации) поддерживается высокий процент PAX6-положительных клеток (> 80 %) в течение всего периода дифференциации и были не столь эффективны в дифференциации на TH-позитивных клеток (<60%), а в 3D-среде, создаваемой инкапсуляции (рис. 5A и C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ряд исследований с использованием эмбриональных стволовых клеток и чЭСК продемонстрировали преимущества 3D-системы культуры в биоматериалов и тканевой инженерии 2,3. Мы использовали микрокапсулы альгинат кальция в качестве подходящего 3D платформой для изучения распространения чЭСК и дифференциации по сравнению с барием альгината с чЭСК показали значительно более высокие жизнеспособность, когда заключены в альгинат кальция, чем барий альгината. Эта культура также позволяет с высокой плотностью культуре клеток и обмен питательных веществ и кислорода через мембрану 7. Спонтанное дифференциации внутри капсулы ранее наблюдались и предполагается, что недифференцированные чЭСК продолжают распространяться в капсулах, клетки в конечном итоге прорыв капсулы и формы тератома 1. Другое клиническое применение инкапсуляции заключается в обеспечении иммунной защиты трансплантированных клеток от принимающей получателя. Предполагается, что трансплантация чЭСК и йОДП производные могут привести к иммунологических отказ, так как низкий уровень экспрессии МНС класса I антигенов недифференцированных чЭСК увеличивается после дифференцирования 8. Кроме того, было документально подтверждено, что трансплантация обычно используют более высокие концентрации альгината, чтобы обойти иммунную процесс отказа 2,9. Наше исследование использует более низкая концентрация альгината (1,1%), который больше подходит для в пробирке культуру и дифференциации чЭСК. Это еще предстоит определить, является ли низкая концентрация альгината мы использовали бы незаконным подобный иммунный ответ, как ранее отчетов, а также поддержания жизнеспособности клеток если эти инкапсулированные чЭСК быть пересажены в иммунокомпетентных хозяина.
Наши оптимизированный протокол инкапсуляции для инкапсуляции чЭСК производит капсулы размером 400-500 мкм диаметром. Капсулы которых меньше 400 мкм, как правило, имеют меньшее количество клеток, больше капсул (> 500 мкм) Resulт в перенаселения клеток. чЭСК инкапсуляции требует одного формированию клеток, что также способствует апоптоза клеток 6. Мы показали здесь, что инкапсулированные чЭСК может продолжать жить, размножаться и образуют EB. Это усиливается предварительной обработки чЭСК с RI до инкапсуляции, в результате чего в> 80% чЭСК быть жизнеспособным. Таким образом, мы создали модель культуры чЭСК в 3D условиях культуру и расширили эти исследования для направленной дифференцировки в нейроны DA. Хотя метод инкапсуляции клетка была широко известна для культивирования клеток и эндодермы дифференциации, нейронная дифференциация в этих условиях не были изучены 10,11. Мы показали, что здесь имеется повышенная экспрессия PAX6 и TH использованием анализа генов и экспрессии белков через 7 дней, по сравнению с 2D-системы дифференциации, предполагая, что 3D-среда способствует лучшему DA нейронов линии плюрипотентных от государства. Тем не менее, дальнейших успехов анализч, как допамин тест секреции и трансплантации анализа необходимо в полной мере характеризуют дифференцированных клеток. Создание надежных функциональных нейронов DA эффективно является важным требованием при клеточной терапии для лечения болезни Паркинсона в том, чтобы стать реальностью. Наши 3D-платформы, предлагаемые о совместном культивировании с Д. нервных клеток вызывающих, ПА6 клеток и высокой плотности культуры клеток системы дифференцированных нейронов DA чЭСК через инкапсуляции усилия, направленные на этом направлении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Программы по NHMRC грант № 568969 (PSS) и медицинского факультета Университета Нового Южного Уэльса, стволовых клеток инициативы (KSS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. Orive, G. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
