Summary
Nous avons optimisé une technique de microencapsulation comme une plate-forme efficace pour la propagation 3D et la différenciation des cellules souches embryonnaires à l'endoderme et dopaminergiques (DA) des neurones. Il fournit aussi une occasion pour le système immunitaire des cellules d'isolement de l'hôte lors de la transplantation. Cette plate-forme peut être adaptée à d'autres types cellulaires.
Abstract
Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont en train de devenir une source alternative intéressante pour la thérapie de remplacement cellulaire, car elles peuvent être multipliées en culture indéfiniment et différencié à tous les types de cellules dans le corps. Différents types de biomatériaux ont également été utilisés dans les cultures de cellules souches pour fournir un microenvironnement imitant la niche de cellules souches 1-3. Le dernier point est important pour la promotion de la cellule à cellule d'interaction, la prolifération cellulaire et la différenciation en lignées spécifiques ainsi que l'organisation des tissus en fournissant un en trois dimensions (3D) environnement 4 tel que l'encapsulation. Le principe d'encapsulation cellulaire implique le piégeage de cellules vivantes dans les limites de membranes semi-perméables dans des cultures 3D 2. Ces membranes de permettre l'échange des nutriments, l'oxygène et des stimuli à travers les membranes, tandis que les anticorps et les cellules immunitaires de l'hôte qui sont plus grandes que la taille des pores capsule sont exclus 5. Ici, nous avons préenvoyé une approche à la culture et de différencier les CSEh neurones dopaminergiques dans un microenvironnement 3D utilisant des microcapsules d'alginate. Nous avons modifié les conditions de culture de 2 à accroître la viabilité des CSEh encapsulé. Nous avons précédemment montré que l'ajout de p160-Rho-associé superhélice kinase (ROCK) inhibiteur, Y-27632 et du foetus humain fibroblastes milieu conditionné de remplacement du sérum (HFF-CM) à la plate-forme 3D a considérablement amélioré la viabilité des CSEh encapsulé dans lequel les cellules expriment définitives gènes marqueurs endodermiques 1. Nous avons maintenant utilisé cette plate-forme 3D pour la propagation de la différenciation des CSEh et efficace pour les neurones dopaminergiques. Analyses d'expression des protéines et des gènes après la phase finale de la DA de la différenciation neuronale a montré une expression accrue de la tyrosine hydroxylase (TH), un marqueur de neurones DA, plus de 100 plis au bout de 2 semaines. Nous avons supposé que notre plate-forme 3D utilisant des microcapsules d'alginate peut être utile d'étudier la prolifération et la différenciation dirigéedes CSEh à des lignées différentes. Ce système 3D permet également la séparation des cellules nourricières de CSEh au cours du processus de différenciation et possède également un potentiel pour le système immunitaire d'isolement lors de la transplantation à l'avenir.
Protocol
Toutes les procédures ci-dessous sont effectuées en utilisant des techniques aseptiques à l'intérieur d'un cabinet de classe II prévention des risques biotechnologiques. Réactifs et équipements utilisés sont répertoriés dans les tableaux ci-dessous.
1. Préparation d'alginate 1,1% (p / v)
- Ajouter 0,275 g de l'alginate de sodium purifié (haute teneur en acide glucuronique ≥ 60%, la viscosité> 200 mPa.s, et l'endotoxine ≤ 100 UE / g) dans un tube stérile de 50 ml et ajouter 25 ml de solution stérile 0,1% de gélatine préparée plus tôt (0,5 g gelatin/500 ml milli-Q H 2 O et dissous par autoclavage).
- Vortexer le tube pendant environ 30 secondes pour dissoudre partiellement la poudre d'alginate, puis placer le tube sur un mélangeur orbital à 10 xg pendant la nuit (température ambiante).
- Ajouter 2,778 ml de NaCl 9% stérile (4,5 g de NaCl/50 ml milli-Q H 2 O) à 25 ml de solution d'alginate. Vortexer le tube pendant environ 30 secondes suivi par centrifugation à 95 xg pendant 5 min.
- Conserver la solution d'alginate à 4 °; C pour stockage à court terme (1-2 mois) ou à -20 ° C pour stockage à long terme (environ un an).
2. Préparation de Bath CaCl Précipitations 2
- Dissoudre 14,7 g de CaCl 2. 2H 2 O et 2,38 g d'HEPES dans 1 litre d'eau Milli-Q H 2 O.
- Réglez le niveau de pH à 7,4.
- Stériliser la solution en utilisant un filtre de 0,22 um.
- Bain de précipitation peut être conservé à température ambiante (6-12 mois).
3. Préparation de désencapsulation solution
- Dans 500 ml de phosphate de Dulbecco Buffered Saline (D-PBS), ajouter 50 ml d'EDTA 0,5 M et 5 ml de HEPES 1M.
- Stériliser l'aide d'un filtre de 0,22 um ou autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
- Conserver la solution décapsuler à la température ambiante (6-12 mois).
4. Préparation du remplacement (SR) milieu sans sérum
- Avant d'encapsulation, préparer le milieu SR à l'avance que dedécrit dans le tableau des réactifs spécifiques et des équipements.
5. Préparation de l'inhibiteur de ROCK (Y-27632)
- Diluer Y-27632 poudre dans 0,1% sérum-albumine humaine (SAH) en D-PBS pour faire une solution à 5 mM.
6. Préparation des CSEh pour l'encapsulation
- Pré-traiter les cellules avec les médias de culture supplémenté avec 10 uM de l'inhibiteur de ROCK (RI) pendant deux heures à 37 ° C (abri de la lumière).
- Après le traitement RI, laver les cellules avec du D-PBS deux fois et déloger les cellules de plaques de culture par voie enzymatique avec accutase pendant 10 min à 37 ° C.
- Gratter doucement les cellules avec une raclette de pipette ou de la cellule et recueillir dans un tube de 15 ml. Neutraliser le accutase avec le milieu de SR dans le rapport 1:1.
- Pour préparer une suspension cellulaire unique, filtrer les cellules neutralisé à l'aide d'un filtre 40 um et de recueillir dans un endroit frais tube de 50 ml centrifugeuse.
- Calculer le nombre total de cellules dans la solution en utilisant un hématimètre. Centrifuger la suspension cellulaire 95 xg pendant 5 min et soigneusement éliminer le surnageant par la suite. Laver les cellules avec préchauffé 0,9% de NaCl. Centrifuger 95 xg pendant 5 min et éliminer le surnageant.
7. L'encapsulation des cellules
- Préparer une seringue de 1 ml attaché à un tube en plastique souple de 14G x 2 "cathéter IV. Il est utilisé pour aspirer la suspension cellulaire à être chargés sur le pousse-seringue comme le montre la figure 1.
- Remettre en suspension les cellules avec une solution d'alginate de pré-chauffée à une densité de 1,25 millions de cellules ou d'alginate ml. Mélanger doucement avec la seringue et éviter de créer des bulles.
- Mettre en place le générateur de perles, pompe à seringue et le débitmètre d'air comme le montre la figure 1. Plus de détails de ces dispositifs sont répertoriés dans le tableau des réactifs spécifiques et des équipements.
- Avec les cellules aspirées dans la seringue, jeter le tube de plastique du cathéter IV et fixer la seringue à la machine d'encapsulation. Assurez-vous que il ya un écart de 10 cm sera interpolation de la fin de la machine d'encapsulation et le point de collecte comme le montre la figure 1.
- Encapsuler les cellules en définissant la pompe à seringue à 20 ml / h, le débit d'air à 8 l / min et une pression de 100 kPa (de la taille de capsules peut être changé en modifiant le débit d'air).
- Recueillir les cellules encapsulées dans une boîte de Pétri (100 x 15 mm) remplie avec 20 ml de bain de précipitation préchauffé pendant 7 min pour stabiliser les capsules.
- Transférer les cellules encapsulées par aspiration douce en 50 tubes à centrifuger ml remplie avec 20 ml de NaCl 0,9%.
- Autoriser les capsules à s'installer dans la partie inférieure du tube, puis doucement éliminer le surnageant. Répétez le processus de lavage avec NaCl 0,9%.
- Remettre en suspension les cellules encapsulées dans un milieu de culture pré-chauffée complétée par RI (10 uM), le transfert dans un flacon de culture et incubées à 37 ° C / 5% de CO 2.
8. Différenciation des CSEh encapsulé à DA neurones
ve_content "> Le CSEh encapsulé sont traités avec RI pendant 3 jours avant leur différenciation.- Graine de la lignée cellulaire stromale souris, PA6 cellules à une densité de 1,0 x 10 4 par cm 2 dans 0,1% de gélatine revêtu T75 flacon et l'état des cellules dans un milieu PA6 DA différenciation neuronale (Tableau Matériaux) 24 heures avant la différenciation.
- Transférer les capsules dans un tube à centrifuger de 50 ml et de leur permettre de s'installer dans la partie inférieure du tube.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les capsules en PA6 cellule-milieu conditionné DA différenciation neurale.
- Culture du CSEh encapsulé avec la monocouche cellulaire PA6 (9 x 10 6 CSEh par 7,5 x 10 5 cellules PA6) pendant 28 jours avec un changement de support sur les 4 jours et chaque autre jour par la suite (ne changer que la moitié de la moyenne à chaque fois).
- Après 3 semaines de culture avec des cellules PA6, de compléter le milieu de différenciation neurale DA avec 100 ng / ml SHH et 100 ng / ml FGF8a pour la semaine restante.
9. Décapsulation des CSEh encapsulé
- Aspirer les capsules dans un tube de centrifugation de 15 ml et de leur permettre de se déposer au fond du tube. Puis jetez le surnageant avec précaution.
- Laver les capsules avec D-PBS deux fois. Laisser les capsules se déposent au fond du tube, puis retirer le surnageant.
- Ajouter 5 ml de solution décapsuler les capsules. Mélanger soigneusement la suspension par aspiration avant l'incubation à température ambiante pendant 4-5 min.
- Centrifuger les cellules décapsulé à 95 xg pendant 3 min et éliminer le surnageant.
- Laver la cellule avec le D-PBS culot suivie d'une centrifugation à 95 xg pendant 3 min. Répéter.
- Les cellules décapsulé peut encore être cultivés en monocouche ou utilisé pour l'analyse en aval.
10. Les résultats représentatifs
Le diamètre de microcapsules d'alginate est um 400-500. Le nombre de cellules au sein de la capsule était estimated en calculant le nombre total de cellules divisé par le nombre total de capsules par course. Par conséquent, environ 5,0 x 10 4 cellules par capsule a été estimée. De cela, nous supposons que le nombre maximal de cellules de la capsule peut contenir est d'environ 1,0 x 10 5. La viabilité des CSEh encapsulé est> 80% (figure 2) telle que déterminée en utilisant l'aide diacétate de carboxyfluorescéine succinimidly ester (CFDA) / iodure de propidium (PI) de dosage. Nous avons optimisé les conditions de l'encapsulation sur les CSEh en diminuant la concentration d'alginate de 2,2% à 1,1% et en changeant le bain de précipitation du chlorure de baryum au chlorure de calcium. A partir de ces conditions, nous avons montré que seules les cellules qui ont été encapsulés avec de l'alginate de calcium 1,1% pourraient survivre, proliférer et à former EB in vitro 1. Pour optimiser encore davantage la condition, les effets de milieux de culture et RI, Y-27632 ont été étudiés. Les données présentées dans la figure 2 et 3 montrent que prévente RId dissociation induite par apoptose et maintenu la viabilité cellulaire et la formation de grappes promu 1,6. En outre, la viabilité des CSEh encapsulé cultivées dans HFF-CM RI + était significativement plus élevé que les autres groupes sans supplémentation RI, mais ce n'était pas significativement différente de CSEh encapsulé cultivées en SR + RI. De même, la prolifération cellulaire à l'aide de dosage BrdU a augmenté de 25% à 75% des cellules individuelles développés en grappes (figure 3). Dosage apoptose par TUNEL a révélé que les cellules individuelles dans des microcapsules cultivées dans un milieu SR étaient apoptotique (données non présentées), alors que les grappes extraites de la CPCL-CM étaient pour la plupart négatifs pour TUNEL. Dans une certaine mesure, HFF-CM complétées par bFGF a également favorisé la survie et la prolifération des CSEh encapsulés en l'absence de Y-27632. Toutefois, le traitement par Y-27632 avant (2 heures) et après encapsulation (pendant 4 jours supplémentaires) la viabilité nettement accrue, la prolifération et la formation de grappes de CSEh encapsulédans 1,1% des microcapsules d'alginate de calcium.
Auparavant nous avons démontré que les CSEh peuvent être encapsulés avec succès différenciés pour endoderme définitif 1. Ici, nous avons examiné l'application de l'encapsulation cellulaire comme une plate-forme 3D pour différencier les CSEh encapsulé dans les neurones dopaminergiques. CSEh, qui a formé des corps embryoïdes (EB) en capsules ont été directement différenciée et sur décapsulation dans les conditions décrites ont montré une morphologie neuronale progressive (figure 4) après 2-3 jours de culture avec plus de 90% de viabilité. Analyse de l'expression génique ont montré une régulation à la baisse du marqueur pluripotent, OCT4 tout marqueur neuroprogenitor, PAX6 et DA marqueur neuronal, TH étaient régulés à la hausse après 7 jours de différenciation (figure 5A). La coloration par immunofluorescence a révélé que les CSEh différenciées étaient PAX6-positif (> 80%), mais OCT4 négatif au jour 7. En outre CSEh différenciées montré TH-positifs (> 90%) des neurones après 21 jours (figure 5B). Analyse par Western blot a également montréune régulation positive d'expression TH de 14 jours (figure 5C), tandis que PAX6 expression était régulée à la baisse après 21 jours. En comparaison, les cellules cultivées dans un environnement à deux dimensions (2D) dans des conditions similaires (par exemple RI pré-traitement pendant 2 heures et le RI de post-traitement pendant 3 jours avant la différenciation) a maintenu un pourcentage élevé de cellules PAX6-positifs (> 80 %) tout au long de la période de différenciation et n'étaient pas aussi efficaces dans la différenciation de cellules TH-positifs (<60%) que dans un environnement 3D fournies par encapsulation (figure 5A et C).
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Discussion
Plusieurs études utilisant des cellules souches embryonnaires de souris et de CSEh ont démontré les avantages de système de culture 3D dans les biomatériaux et ingénierie tissulaire 2,3. Nous avons utilisé des microcapsules d'alginate de calcium en tant que plate-forme appropriée pour étudier la propagation 3D et la différenciation des CSEh en comparaison à l'alginate de baryum depuis CSEh ont montré significativement plus élevé lorsque la viabilité encapsulé dans de l'alginate de calcium que l'alginate de baryum. Ce système de culture permet également une culture cellulaire à haute densité et l'échange des nutriments et de l'oxygène à travers la membrane 7. La différenciation spontanée à l'intérieur des capsules a été précédemment observées et il est supposé que comme CSEh indifférenciée continuent à proliférer dans des capsules, les cellules finirait arrachement des capsules et une forme tératome. Une autre application clinique de l'encapsulation est de fournir une protection immunitaire des cellules transplantées à partir de l'hôte receveur. Il est prévu que la transplantation de CSEh et edérivés EIR peut conduire à un rejet immunologique depuis le faible niveau d'expression du CMH de classe I des antigènes de CSEh indifférenciées est augmenté après la différenciation 8. Il a également été documentée que la transplantation utilise généralement des concentrations plus élevées de l'alginate dans le but de contourner le processus de rejet immunitaire 2,9. Notre étude utilise une faible concentration d'alginate (1,1%), qui est plus approprié pour la culture in vitro et la différenciation des CSEh. Il est encore à déterminer si la baisse de la concentration d'alginate, nous avons utilisé serait illicite une réponse immunitaire similaire que précédemment ainsi que les rapports en maintenant la viabilité cellulaire devraient-elles être encapsulé CSEh transplantés chez un hôte immunocompétent.
Notre protocole d'encapsulation optimisé pour encapsuler les CSEh produit taille des capsules de um de diamètre 400-500. Capsules qui sont plus petites que 400 microns ont tendance à avoir moins de cellules alors que les grandes capsules (> 500 um) RÉSULt dans une surpopulation des cellules. encapsulation CSEh nécessite une formation seule cellule, ce qui favorise également l'apoptose des cellules 6. Nous avons montré ici que les CSEh encapsulé peut continuer à survivre, proliférer et à former EB. Ceci est renforcé par pré-traitement de la CSEh avec RI avant l'encapsulation, résultant dans> 80% CSEh étant viables. Ainsi, nous avons établi un modèle pour la culture des CSEh dans des conditions de culture 3D et ont étendu ces études à la différenciation dirigée dans les neurones dopaminergiques. Bien que la technique d'encapsulation de cellules a été largement connue pour la culture cellulaire et la différenciation endodermique, la différenciation neuronale dans ces conditions n'a pas été étudié de manière approfondie 10,11. Nous avons montré ici qu'il ya une augmentation de l'expression de Pax6 et TH en utilisant des analyses d'expression génique et protéique après 7 jours par rapport au système de différenciation 2D, ce qui suggère que l'environnement 3D favorise une meilleure lignée DA neuronale de l'état pluripotent. Toutefois, les analyses ultérieures succèsh comme test de sécrétion de dopamine et le dosage de transplantation sont nécessaires pour caractériser complètement les cellules différenciées. Génération robustes fonctionnels neurones dopaminergiques est efficacement une condition essentielle pour la thérapie cellulaire pour la maladie de Parkinson est de devenir une réalité. Notre plate-forme 3D tel que proposé sur la co-culture avec des cellules DA induisant neuronaux, PA6 cellules et à haute densité système de culture cellulaire de DA CSEh différenciées neuronale via l'encapsulation est un effort dans cette direction.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par NHMRC Programme de subventions # 568969 (PSS) et de la Faculté de médecine, Université de New South Wales, Stem Cell Initiative (KSS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
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