Summary
우리는 endoderm 및 dopaminergic (DA) 뉴런에 전파하고 배아 줄기 세포의 분화에 대한 효과적인 3D 플랫폼으로 microencapsulation 기술을 최적화했습니다. 또한 이식하는 동안 호스트에서 세포의 면역 - 절연을위한 기회를 제공합니다. 이 플랫폼은 다른 세포 유형에 적응하실 수 있습니다.
Abstract
그들이 무기한 문화 확대와 신체의 모든 세포 유형으로 구분되기 수 있기 때문에 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 세포 대체 요법에 대한 매력적인 대안 원본으로 떠오르고있다. biomaterials 다양한 형태의도 줄기 세포 틈새는 1-3 흉내낸 microenvironment를 제공하기 위해 줄기 세포 배양에 사용되었습니다. 후자는 캡슐과 같은 3 차원 (3D) 환경 4 제공하여 특정 lineages뿐만 아니라 조직의 조직으로 휴대 전화 상호 작용, 세포 증식 및 분화를 촉진하는 것이 중요합니다. 세포 캡슐의 원리는 3D 문화 2 반 투과 세포막의 굴레 안에서 살아있는 세포의 함정 수사가 포함됩니다. 항체와 캡슐 기공 크기보다 큰 호스트에서 면역 세포가 5를 제외하고 반면 이러한 세포막은 영양소, 산소와 세포막에 걸쳐 자극의 교환하실 수 있습니다. 여기서는 사전문화적인 접근을 유도하고 알지네이트요의 microcapsules을 사용하여 3D microenvironment에 hESC 검찰의 뉴런을 차별화. 우리는 캡슐 hESC의 생존을 향상시키기 위해 문화 조건 2를 수정했습니다. 우리는 이전에 보여준 그 크게 향상 3D 플랫폼 p160-Rho-연결된 코일 - 코일 키나제 (바위) 억제제, Y-27632과 인간 태아의 fibroblast 바른 혈청 대체 매체 (hFF-CM)의 추가 캡슐 hESC의 생존 있는 세포가 최종 endoderm의 마커 유전자에게 1 표명했다. 우리는 지금 검찰의 뉴런으로 hESC하고 효율적인 분화의 번식이 3D 플랫폼을 사용 해왔다. 단백질과 유전자 표현 분석은 검찰의 연결을 분화의 마지막 단계 후 티로신 hydroxylase의 증가 표현 (TH), DA 뉴런을위한 마커, 2 주 후에> 100 폴드을 보여주었다. 우리는 알지네이트요의 microcapsules을 사용하여 Google 3D 플랫폼 확산을 공부 유용할 수있는 가상과 차별 감독각종 lineages에 hESC니다. 이 3D 시스템은 분화의 과정 중에 hESC에서 피더 세포의 분리를 허용하며 향후 이식시 면역 - 절연을위한 잠재력을 가지고 있습니다.
Protocol
아래 절차의 모든 클래스 II Biosafety 내각 안에서 무균 기술을 사용하여 수행됩니다. 사용하는 시약과 장비는 아래 테이블에 나열되어 있습니다.
1. 1.1 %의 알긴산의 준비 (W / V)
- 나트륨 알지네이트요 투석의 0.275 g을 추가 (높은 글루쿠론산 함량 ≥ 60 %, 점도> 200 MPA의 및 내독소 ≤ 100 유럽 연합 (EU) / G) 무균 50 ML 관과 (0.5g 이전 대비 25 ML 멸균 0.1 % 젤라틴 용액을 추가 gelatin/500 ML 밀리 Q H 2 O 및 autoclaving에 의해 해산).
- 부분적으로 알지네이트요 가루를 해산하기 위해 약 30 초간 소용돌이 튜브 그러면 하룻밤 사이에 10 XG에 궤도 믹서에 튜브를 삽입 (실온).
- 알지네이트요 솔루션의 25 ML에 9% 멸균 NaCl (NaCl/50 ML 밀리 Q H 2 O 4.5 g)의 2.778 ML을 추가합니다. 5 분 95 XG의 원심 분리에 의해 다음에 약 30 초간 소용돌이 튜브를.
- 4에서 알지네이트요 솔루션을 저장 °; 단기 저장 (1-2개월) 또는 -20 ° C에서 장기 보관 (년 정도)에 대한 C #.
2. CaCl 2 강수 목욕의 작성
- 밀리 Q H 2 O로 1 리터에 CaCl 2 14.7 g. 2 시간 2 O와 HEPES의 2.38 g을 용해
- 7.4로 산도 수준을 조정합니다.
- 0.22 μm의 필터를 사용하여 솔루션을 소독.
- 강수량 목욕은 실온 (6-12 개월)에 저장할 수 있습니다.
3. 솔루션 Decapsulating의 작성
- Dulbecco의 인산 500 ML에 염분 (D-PBS)를 버퍼, 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 50 ML 및 1M HEPES 5 ML에 추가합니다.
- 20 분 동안 121에서 0.22 μm의 필터 또는 압력솥 ° C를 사용하여 소독.
- 실온 (6-12 개월)에 decapsulating 솔루션을 저장합니다.
4. 세럼 교체 (SR) 중간의 작성
- 이전 캡슐에, 드로 사전에 SR 매체를 준비특정 시약 및 장비의 테이블에 scribed.
5. 바위 억제제의 준비 (Y-27632)
- 인간 D-PBS의 (HSA) 알부민 혈청 5 MM 솔루션을 만드는 0.1 %에서 Y-27632 분말을 희석.
6. 봉지를위한 hESC의 작성
- 37 ° C (빛으로부터 보호)에서 두 시간 동안 바위 억제제 (RI)의 10 μm의로 보충 culturing 미디어와 세포를 사전 처리합니다.
- RI 치료 후 37 ° C. 10 분 accutase와 효소 회 D-PBS로 세포를 씻어 문화 판에서 세포를 이동시키다
- 부드럽게 피펫 또는 셀 스크레이퍼로 세포를 데리고 15 ML 튜브에 수집합니다. 1시 1분 비율로 SR 매체와 accutase를 무력화.
- 단일 세포 현탁액을 준비하려면 40 μm의 필터를 사용하여 무력화 세포를 필터링하고 신선한 50 ML의 원심 튜브에 수집합니다.
- hemacytometer를 사용하여 솔루션의 세포의 총 수를 계산합니다. 세포 현탁액에게 5 분 95 XG을 원심 조심스럽게 나중에 뜨는 버리고. 사전 예열 0.9 % NaCl로 세포를 씻으십시오. 5 분 95 XG를 원심 분리기와 뜨는 버리고.
7. 세포의 캡슐화
- 14G X 2 "IV 카테터의 부드러운 플라스틱 튜브에 부착된 1 ML의 주사기를 준비합니다. 이것은 그림 1에서와 같이 주사기 펌프에로드되도록 세포 현탁액을 대기음하는 데 사용됩니다.
- 1,250,000 세포 / ML의 알지네이트요의 밀도에 미리 예열 알지네이트요 솔루션 세포 Resuspend. 천천히 주사기에 혼합하고 거품을 생성하지 마십시오.
- 그림 1에서와 같이 비드 발생기, 주사기 펌프 및 공기 유량계를 설정합니다. 이러한 장치의 자세한 내용은 특정 시약 및 장비의 테이블에 나열되어 있습니다.
- 주사기로 aspirated 세포로 정맥 주사 카테터의 플라스틱 튜브를 버리고 캡슐 머신에 주사기를 첨부합니다. 10cm 간격이있다는 것을 확인 십대 초반은 캡슐 머신의 끝과 수거 지점 그림 1과 같이.
- 20 ML / HR, 공기 흐름 8 L / 분의 속도 및 100 kPa (캡슐의 크기는 공기 유량을 변경하여 변경할 수있다)의 압력에서 주사기 펌프를 설정하여 세포를 캡슐.
- 캡슐을 안정화하기위한 7 분을위한 사전 예열 강수량 목욕 20 ML 가득 배양 접시 (100 X 15mm)로 캡슐화된 세포를 수집합니다.
- 0.9 % NaCl의 20 ML 가득한 50 ML의 원심 튜브에 부드러운 흡인에 의해 캡슐화된 세포를 전송합니다.
- 캡슐은 튜브의 바닥에 정착하도록 허용하는 것은 부드럽게 뜨는 버리고. 0.9 % NaCl로 세척 과정을 반복합니다.
- 문화 플라스크에 RI (10 μm의), 이체로 보완하고 37 ° C / 5% CO 2에서 incubated 사전 예열 culturing 매체에 캡슐화된 세포를 Resuspend.
8. DA 뉴런에 캡슐화된 hESC의 분화
ve_content "> 캡슐 hESC는 분화 이전 3 일간 RI으로 처리됩니다.- 종자 마우스 stromal 세포주의 1.0 × 10 4cm 2 회 0.1 %의 젤라틴 코팅 T75 술병과 조건 24 시간 분화하기 전에 검찰 신경 분화 매체 (자료 표)에 PA6 세포. 밀도에서 PA6 세포
- 50 ML의 원심 튜브에 캡슐을 전송하고 그들이 튜브의 바닥에 정착하실 수 있습니다.
- 뜨는을 취소하고 PA6 세포 바른 DA 신경 분화 매체에 캡슐을 resuspend.
- 문화 일 4 미디어 변화와 매일 함께 28일 대한 PA6 세포 단일층 (7.5 × 10 5 PA6 세포 당 9 X 10 6 hESCs)와 캡슐 hESC는 그 이후 (매체마다의 절반 밖에 변경).
- PA6 세포와 문화 3 주가 지난 후, 100 NG / ML 쉬이잇 나머지 주 100 NG / ML FGF8a 함께 검찰 신경 분화 미디어를 보완.
9. 캡슐화된 hESC의 Decapsulation
- 15 ML의 원심 튜브에 캡슐을 대기음들을 튜브 하단에 정착하실 수 있습니다. 그렇다면 신중하게 뜨는 버리고.
- 두번 D-PBS로 캡슐 씻으십시오. 다음 뜨는을 제거 캡슐은 튜브의 아래쪽에 정착하자.
- 캡슐 5 ML decapsulating 솔루션을 추가합니다. 4-5 분 상온에서 사전에 인큐베이션에 대한 열망을 통해 철저하게 정지를 섞습니다.
- 3 분 95 XG에 decapsulated 세포를 원심 분리기와 뜨는 버리고.
- 3 분 95 XG에서 원심 분리에 의해 다음에 D-PBS로 세포 펠렛 씻으십시오. 반복합니다.
- decapsulated 세포가 더 단일층으로서 교양이나 스트림 분석에 사용 될 수 있습니다.
10. 대표 결과
알지네이트요의 microcapsules의 직경 400-500 μm의입니다. 캡슐 내에서 세포의 수가 estimat였다실행 당 캡슐 총 나눈 세포의 총 수를 계산하여 에드. 따라서 캡슐 당 약 5.0 X 10 4 세포 추정되었다. 이것에서 우리는 캡슐에 포함할 수있는 세포의 최대 개수는 약 1.0 × 10 5 것을주지. 캡슐 hESC의 생존 능력은 carboxyfluorescein의 디아 세 테이트 succinimidly 에스테르 (CFDA) / propidium의 요오드화물 (PI) 분석을 사용하여 결정> 80 % (그림 2)과 같다. 우리는 1.1 %까지 2.2 %에서 알지네이트요 농도를 줄임으로써 및 바륨 염화에서 염화칼슘으로 강수량 목욕을 변경하여 hESC의 캡슐의 조건을 최적화했습니다. 이러한 조건에서 우리는 1.1 %의 칼슘 알지네이트요로 캡슐되었습니다에만 세포가 살아남을 수 있다고 보여주었다, 분아 따위에 의해 중식 및 체외 1 EBS를 형성하고 있습니다. 추가 조건을 최적화하려면 culturing 미디어 및 RI의 효과는 Y-27632는 조사되었다. 그림 2와 3에 표시된대로 데이터는 RI의 prevente을 증명D 분리 - 유도 apoptosis와 세포 생존 및 홍보 클러스터 형성 1,6을 유지. 또한, hFF-CM + RI에서 배양해 캡슐 hESC의 생존 능력은 RI의 보완없이 다른 그룹보다 훨씬 높은이었다 있으나 이것은 SR + RI에서 배양해 캡슐 hESC에 크게 다르지 않아했습니다. 마찬가지로, BrdU 분석을 사용하여 세포 증식은 클러스터 (그림 3)로 발전 단일 셀은 25 %에서 75 % 증가했다. TUNEL에 의한 Apoptosis 분석은 hFF-CM에서 검색할 클러스터 TUNEL에 대해 대부분 부정했다 반면 SR 매체에서 배양해 microcapsules에서 단일 세포 (데이터가 표시되지 않음) apoptotic라고 밝혔다. 어느 정도, bFGF와 보충 hFF-CM은 또한 Y-27632의 부재에서 생존과 캡슐 hESCs의 확산을 촉진. 그러나 Y-27632과 치료를 캡슐화하기 전에 (2 시간)과 이후 (추가 4 일간) 띄게 향상된 생존, 증식 및 캡슐의 hESC의 클러스터 형성1.1 %의 칼슘 알지네이트요의 microcapsules 인치
이전에 우리는 캡슐 hESC이 성공적으로 확정 endoderm 1로 차별 수있다 보여주었다. 여기서는 검찰 뉴런으로 캡슐 hESC를 차별화하기 위해 3D 플랫폼으로 세포 캡슐의 응용 프로그램을 조사했다. 캡슐에 embryoid 기관 (EB)를 형성 hESC는 차별화된 직접 있었는데 설명한 조건 하에서 decapsulation에 90 % 이상의 생존 능력과 문화로부터 2-3 일 후에 (그림 4) 프로 그레시브의 연결 형태를 보여주었다. neuroprogenitor 표시, PAX6과 검사의 연결 마커, TH는 차별화 7 일 (그림 5A) 이후 최대 - 규제 동안 유전자 발현 분석 pluripotent 표식의 아래쪽 규정, OCT4을 보여주었다. Immunofluorescent 염색법은 차별 hESC 하루 7 시에 PAX6 양성 (> 80 %)하지만 OCT4 음수가 있다고 밝혔다. 또한 차별화된 hESC 21 일 후에 TH - 양성 (> 90 %) 뉴런을 (그림 5B) 보여주었다. 서양 얼룩 분석도 보여주었다PAX6 표현 동안 일 14 일부터 번째 표현의 상향 조절 (그림 5C)는 21 일 이후에 아래쪽 규제. 비교에서는 전지 (사전 차별화에 대한 예 : RI 3 일간 2 시간 RI 사후 처리를위한 사전 치료) (> 80 PAX6-긍정 세포의 높은 비율을 유지 유사한 조건 하에서 (2D) 2 차원 환경에서 배양해 %) 분화 기간에 걸쳐 및 캡슐화 (그림 5A 및 C)에서 제공하는 3D 환경에서와 같이 TH 양성 세포 (<60 %)으로 차별화에서와 같이 효율이 아니었다.
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Discussion
마우스 배아의 줄기 세포와 hESC를 사용하여 여러 연구 biomaterials 및 조직 공학 2,3에서 3D 문화 시스템의 이점을 증명하고있다. 우리는 바륨 알지네이트요보다 칼슘 알지네이트요에서 캡슐 때 hESC는 상당한 높은 생존 능력을 보여주 이후 바륨 알지네이트요에 비해 hESC 전파와 차별을 공부하기 적합한 3D 플랫폼으로 칼슘 알지네이트요의 microcapsules를 사용했습니다. 이 문화 시스템은 또한 고밀도 세포 배양과 영양분과 멤브레인 7 전체 산소의 교환이 가능합니다. 캡슐 내에서 자연 차별화는 이전에 관찰되었고 그것이 같은 undifferentiated hESC은 캡슐 내에 분아 따위에 의해 번식이 계속된다고 가정되며, 세포가 캡슐 및 양식 teratoma 1 결국 브레이크 아웃한다면. 캡슐의 또 다른 임상 응용 프로그램은 호스트 수신자로부터 이식된 세포의 면역 보호 기능을 제공하는 것입니다. 그것은 예상되는 hESC와 일의 이식MHC 클래스의 표현의 낮은 수준이 나는 undifferentiated hESC의 항원이 분화 8 이후 증가되어 있기 때문에 EIR 유도체가 면역 거부 반응을 초래할 수 있습니다. 또한 이식은 보통 면역 거부 반응 프로세스에게 2,9를 회피하기 위해 알지네이트요 높은 농도를 사용한다는 걸 문서화되었습니다. 우리의 연구는 체외 문화와 hESC의 분화에 대한 더 적합 알지네이트요의 낮은 농도 (1.1 %)를 사용합니다. 그것은 결정은 아직은 우리가 사용한 알지네이트요의 낮은 농도는 이전 보고서뿐만 아니라 세포 생존을 유지하는 것은 면역 적격 호스트에서 이러한 캡슐 hESC 이식되어야 등의 불법 유사한 면역 반응 것인지.
hESC를 캡슐위한 최적의 캡슐화 프로토콜 400-500 μm의 직경의 캡슐 크기를 생산하고 있습니다. 400 μm의보다 작은 캡슐은 적은 수의 세포를 가지고하는 경향이 꽤 큰 캡슐 (> 500 μm의) resul세포의 인구 과잉의 티. hESC의 캡슐은 또한 6 apoptosis 세포를 촉진 단일 세포 형성을 필요로합니다. 우리는 캡슐 hESC는 생존을 계속할 수있는 이곳을 보였습니다 분아 따위에 의해 중식과 EB를 형성하고 있습니다. 이것은> 80 % hESC이 가능한되고 그 결과 캡슐에 앞서 RI와 hESC를 미리가 치료에 의해 향상됩니다. 따라서, 우리는 3 차원 배양 조건에서 배양 hESC로 모델을 확립하고 검찰 뉴런으로 이동 차별화에 대한 연구를 확대했습니다. 세포 캡슐 기술은 널리 이러한 조건 하에서 세포 culturing 및 endodermal 분화, 신경 분화에 대해 잘 알려져 있지만 철저 10,11 연구되지 않았습니다. 우리는 3D 환경 pluripotent 상태에서보다 검찰의 연결 혈통을 촉진한다는 제안, 2D 차별화 시스템에 비해 7 일 후에 유전자 및 단백질 발현 분석을 사용하여 증가 PAX6의 표현과 TH가있다는 것을 여기에 나타났습니다. 그러나 추가 분석의 suc도파민 분비 검사 및 이식 분석과 같은 H 완전히 차별화된 세포를 특성화해야합니다. 파킨슨병에 대한 세포 치료가 현실이 될 경우 강력한 기능 검사의 뉴런을 생성하는 것은 효과적으로 필수적인 요구 사항입니다. DA 신경 유도 세포, PA6 세포 캡슐을 통해 검찰의 연결을 차별 hESC의 고밀도 세포 배양 시스템과 공동 culturing에 대해 제안한대로 우리의 3D 플랫폼은 그 방향을 향해 노력이다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 의학 NHMRC 프로그램 권한 부여 # 568969 (PSS) 및 학부, 뉴 사우스 웨일스 대학, 줄기 세포 사업 (KSS)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
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