Summary
Hemos optimizado una técnica de microencapsulación como una plataforma efectiva en 3D para la propagación y la diferenciación de células madre embrionarias para endodermo y las neuronas dopaminérgicas (DA). También proporciona una oportunidad para inmune-aislamiento de células del huésped durante el trasplante. Esta plataforma se puede adaptar para otros tipos de células.
Abstract
Las células madre embrionarias humanas) se están convirtiendo en una fuente alternativa atractiva para la terapia de reemplazo de células, ya que se puede ampliar en cultivo indefinidamente y diferenciarse a cualquier tipo de células en el cuerpo. Varios tipos de biomateriales se han utilizado también en cultivos de células madre para proporcionar un microambiente imitando el nicho de células madre 1-3. Esto último es importante para la promoción de la célula a célula interacción, la proliferación celular, y la diferenciación en linajes específicos, así como la organización del tejido, proporcionando una tridimensional (3D) 4 ambiente, tales como la encapsulación. El principio de encapsulación de células implica atrapamiento de las células vivas dentro de los confines de membranas semi-permeables en cultivos 3D 2. Estas membranas de permitir el intercambio de nutrientes, oxígeno y estímulos a través de las membranas, mientras que los anticuerpos y las células inmunes del huésped que son más grandes que el tamaño de poro cápsula se excluyen 5. En este sentido, preenvió un acercamiento a la cultura y diferenciar hESC neuronas DA en un microambiente 3D con microcápsulas de alginato. Hemos modificado las condiciones de cultivo de 2 a mejorar la viabilidad de hESC encapsulado. Anteriormente hemos demostrado que la adición de p160-Rho-asociado espiral de la bobina quinasa (ROCK) inhibidor, Y-27632, y fibroblastos de fetos humanos-medio condicionado de reemplazo de suero (HFF-CM) a la plataforma 3D mejorado significativamente la viabilidad de hESC encapsulado en la que las células expresan genes marcadores definitivos endodermo 1. Hemos utilizado esta plataforma 3D para la propagación de la diferenciación hESC y eficiente de las neuronas DA. Análisis de proteínas y genes de expresión después de la última etapa de la diferenciación neuronal DA mostró un incremento en la expresión de la tirosina hidroxilasa (TH), un marcador de las neuronas DA,> 100 veces después de 2 semanas. La hipótesis de que nuestra plataforma 3D con microcápsulas de alginato puede ser útil para estudiar la proliferación y la diferenciación dirigidade hESC a linajes diferentes. Este sistema 3D también permite la separación de células alimentadoras de hCME durante el proceso de diferenciación y también tiene potencial para inmune-aislamiento durante el trasplante en el futuro.
Protocol
Todos los procedimientos que a continuación se llevó a cabo utilizando técnicas asépticas dentro de un Gabinete de Bioseguridad Clase II. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en las tablas siguientes.
1. Preparación de 1,1% de alginato (w / v)
- Añadir 0,275 g de alginato sódico purificado (alto contenido en ácido glucurónico ≥ 60%, la viscosidad> 200 mPa s, y la endotoxina ≤ 100 UE / g) en un tubo estéril de 50 ml y añadir 25 ml de solución estéril de 0,1% de gelatina preparada anteriormente (0,5 g gelatin/500 ml mili-Q H 2 O y se disuelven en autoclave).
- Vórtice del tubo durante aproximadamente 30 segundos para disolver parcialmente el polvo de alginato a continuación, colocar el tubo en un mezclador orbital a 10 xg durante toda la noche (temperatura ambiente).
- Añadir 2,778 ml de 9% de NaCl estéril (4,5 g de NaCl/50 ml mili-Q O H 2) a 25 ml de solución de alginato. Vortex el tubo durante aproximadamente 30 segundos, seguido por centrifugación a 95 xg durante 5 min.
- Guarde la solución de alginato a 4 °; C durante almacenamiento a corto plazo (1-2 meses) oa -20 ° C para almacenamiento a largo plazo (alrededor de un año).
2. Preparación de baño de CaCl Precipitaciones 2
- Disolver 14,7 g de CaCl 2. 2H O 2 y 2,38 g de HEPES en 1 litro de Milli-Q O. H 2
- Ajuste el nivel de pH a 7,4.
- Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 micras.
- Baño de precipitación se puede almacenar a temperatura ambiente (6-12 meses).
3. Preparación de Solución decapsulating
- En 500 ml de fosfato de Dulbecco Buffered Saline (D-PBS), se añaden 50 ml de EDTA 0,5 M y 5 ml de HEPES 1M.
- Esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras o autoclave a 121 ° C durante 20 min.
- Guarde la solución decapsulating a temperatura ambiente (6-12 meses).
4. Preparación de la sustitución de suero (SR) Medio
- Antes de la encapsulación, preparar el medio de la RS en anticipación dedescrito en la Tabla de los reactivos y equipos específicos.
5. Preparación de inhibidor de ROCK (Y-27632)
- Diluir Y-27632 en polvo en 0,1% de albúmina sérica humana (HSA) en D-PBS para hacer una solución de 5 mM.
6. Preparación de hCME para la encapsulación
- Pre-tratamiento de las células con los medios de cultivo suplementado con 10 mM de inhibidor de ROCK (RI) durante dos horas a 37 ° C (protegerlo de la luz).
- Después del tratamiento de RI, lavar las células con D-PBS dos veces y desalojar las células de placas de cultivo enzimáticamente con accutase durante 10 min a 37 ° C.
- Suavemente raspar las células con el rascador pipeta o de células y recoger en un tubo de 15 ml. Neutralizar el accutase con el medio de SR en proporción de 1:1.
- Para preparar una suspensión de células individuales, filtrar las células neutralizadas mediante un filtro de 40 micras y se recogen en un tubo de centrífuga fresco 50 ml.
- Calcular el número total de células en la solución usando un hemocitómetro. Centrifugar la suspensión celular 95 xg durante 5 min y cuidadosamente descartar el sobrenadante después. Se lavan las células con pre-calentado 0,9% de NaCl. Centrifugar 95 xg durante 5 minutos y descartar el sobrenadante.
7. La encapsulación de células
- Preparar una jeringa de 1 ml unido a un tubo de plástico blando de 14G x 2 "catéter intravenoso. Esto se utiliza para aspirar la suspensión de células a ser cargados en la bomba de jeringa, como se muestra en la Figura 1.
- Resuspender las células con solución de alginato pre-calentado a una densidad de 1,25 millones de células / ml de alginato. Mezclar suavemente con la jeringa y evitar la creación de burbujas.
- Establecer el generador de talón, una bomba de jeringa y el medidor de flujo de aire como se muestra en la Figura 1. Más detalles de estos dispositivos se enumeran en la Tabla de los reactivos y equipos específicos.
- Con las células aspiradas en la jeringa, deseche el tubo de plástico de la sonda intravenosa y conecte la jeringa a la máquina de encapsulación. Asegúrese de que existe una brecha de 10 cm que interpolación el extremo de la máquina de encapsulación y el punto de recogida, como se muestra en la Figura 1.
- Encapsular las células mediante el establecimiento de la bomba de jeringa de 20 ml / h, el caudal de aire a 8 l / min y una presión de 100 kPa (el tamaño de las cápsulas puede ser cambiado mediante la alteración de la tasa de flujo de aire).
- Recoger las células encapsuladas en una placa Petri (100 x 15 mm) rellena con 20 ml de baño de precipitación precalentado durante 7 minutos para estabilizar las cápsulas.
- Transferir las células encapsuladas por aspiración suave en 50 tubos de centrífuga ml llenas con 20 ml de NaCl al 0,9%.
- Permitir las cápsulas para instalarse en la parte inferior del tubo suavemente descartar el sobrenadante. Repetir el proceso de lavado con NaCl al 0,9%.
- Resuspender las células encapsuladas en medio de cultivo precalentado suplementado con RI (10 mM), la transferencia en un frasco de cultivo y se incubaron a 37 ° C / 5% de CO 2.
8. Diferenciación de hESC encapsulado de las neuronas DA
ve_content "> El hESC encapsulado se tratan con RI durante 3 días antes de la diferenciación.- Semillas de la línea de células del estroma del ratón, PA6 células a una densidad de 1,0 x 10 4 por cm 2 en 0,1% de gelatina recubierto T75 matraz y acondicionar las células en medio PA6 DA diferenciación neuronal (Tabla de Materiales) 24 horas antes de la diferenciación.
- Transferir las cápsulas a un tubo de centrífuga de 50 ml y permitir que se asienten en el fondo del tubo.
- Descartar el sobrenadante y resuspender las cápsulas en células PA6 acondicionado medio de diferenciación neuronal DA.
- Cultura de la hESC encapsulado con la monocapa de células PA6 (9 x 10 6 hESCs por 7,5 x 10 5 células PA6) durante 28 días con un cambio de los medios de comunicación el día 4 y cada dos días a partir de entonces (cambiar sólo la mitad del medio de cada vez).
- Después de 3 semanas en cultivo con células PA6, suplementar el medio DA diferenciación neuronal con 100 ng / SHH ml y 100 ng / ml para FGF8a la semana restante.
9. Decapsulation de hCME encapsulado
- Aspirar las cápsulas en un tubo de centrífuga de 15 ml y permitir que se depositan en el fondo del tubo. A continuación, descartar el sobrenadante con cuidado.
- Lávese las cápsulas con D-PBS dos veces. Que las cápsulas se depositan en el fondo del tubo a continuación, eliminar el sobrenadante.
- Añadir 5 ml de solución decapsulating a las cápsulas. Mezclar la suspensión a fondo a través de aspiración antes de la incubación a temperatura ambiente durante 4-5 min.
- Centrifugar las células descapsulados a 95 xg durante 3 minutos y descartar el sobrenadante.
- Lavar el precipitado celular con D-PBS seguido por centrifugación a 95 xg durante 3 minutos. Repita.
- Las células descapsulados puede ser aún más cultivadas como una monocapa o utilizados para el análisis de aguas abajo.
10. Los resultados representativos
El diámetro de las microcápsulas de alginato es micras 400-500. El número de células dentro de la cápsula era ESTIMACIONESed calculando el número total de células dividido por el número total de cápsulas por ejecución. Por lo tanto, aproximadamente 5,0 x 10 4 células por cápsula fue estimada. De esto, suponemos que el número máximo de células de la cápsula puede contener es de aproximadamente 1,0 x 10 5. La viabilidad de hCME encapsulado es> 80% (Figura 2) como se determina mediante utilizando diacetato de carboxifluoresceína succinimidly éster (CFDA) / yoduro de propidio (PI) de ensayo. Hemos optimizado las condiciones de encapsulación hCME disminuyendo la concentración de alginato de 2,2% al 1,1% y cambiando el baño de precipitación a partir de cloruro de bario al cloruro de calcio. A partir de estas condiciones, se demostró que sólo las células que fueron encapsulados con alginato de calcio 1,1% podría sobrevivir, proliferar y formar EBS in vitro 1. Para optimizar aún más la condición, los efectos de los medios de cultivo y RI, Y-27632 se investigaron. Los datos presentados en la Figura 2 y 3 demuestran que prevente RId disociación de la apoptosis inducida y mantenida la viabilidad celular y la formación promovido grupo 1,6. Por otra parte, la viabilidad de hESC encapsulado cultivadas en HFF-CM + RI fue significativamente más alta que otros grupos sin suplementación de RI, sin embargo esto no fue significativamente diferente al encapsulado hESC cultivadas en RI + SR. De manera similar, la proliferación de células usando el ensayo de BrdU aumentó de 25% a 75% como células individuales desarrolladas en grupos (Figura 3). La apoptosis por TUNEL ensayo revelaron que las células individuales en microcápsulas cultivadas en medio SR fueron apoptóticas (datos no mostrados), mientras que los grupos recuperados a partir de la HFF-CM eran mayormente negativo para TUNEL. Hasta cierto punto, HFF-CM suplementados con bFGF también promueve la supervivencia y proliferación de hESCs encapsulados en ausencia de Y-27632. Sin embargo, el tratamiento con Y-27632 antes (2 horas) y después de la encapsulación (durante 4 días) viabilidad notablemente mejorada, la proliferación y la formación de agrupaciones de hCME encapsuladoen microcápsulas 1,1% de alginato de calcio.
Anteriormente hemos demostrado que hESC encapsulado puede ser exitosamente diferenciada para endodermo definitivo 1. Aquí, se analizó la aplicación de encapsulación de células como una plataforma 3D para diferenciar hESC encapsulado dentro de las neuronas DA. hESC, que se formó cuerpos embrioides (EB) en cápsulas fueron directas diferenciada y en decapsulation en las condiciones descritas mostraron una morfología neuronal progresiva (Figura 4) después de 2-3 días de cultivo con la viabilidad de más del 90%. La expresión de genes mostró una baja regulación de marcador pluripotente, Oct4, mientras que el marcador neuroprogenitoras, PAX6 y el marcador de DA neuronal, TH fueron reguladas hasta después de 7 días de la diferenciación (Figura 5). Tinción inmunofluorescente reveló que hCME diferenciada fueron PAX6-positivo (> 80%) pero OCT4 negativa en el día 7. HESC diferenciada posteriores mostraron TH-positivos (> 90%), las neuronas después de 21 días (Figura 5b). Western blot también mostróuna regulación de la expresión de TH a partir del día 14 (Figura 5 C), mientras que la expresión de PAX6 se había reducido regulado después del día 21. En comparación, las células cultivadas en medio de dos dimensiones (2D) bajo condiciones similares (por ejemplo, RI pre-tratamiento durante 2 horas y RI post-tratamiento durante 3 días antes de la diferenciación) mantiene un alto porcentaje de células PAX6-positivos (> 80 %) durante todo el período de diferenciación y no eran tan eficiente en la diferenciación de las células TH-positivas (<60%) como en el entorno 3D proporcionado por encapsulación (Figura 5A y C).
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Discussion
Varios estudios con células madre embrionarias de ratón y hESC han demostrado los beneficios del sistema de cultivo en 3D en biomateriales e ingeniería de tejidos 2,3. Se utilizó microcápsulas de alginato de calcio como una plataforma adecuada en 3D para estudiar la propagación hESC y la diferenciación en comparación con el alginato de bario ya hESC mostró la viabilidad significativamente mayor cuando se encapsula en alginato de calcio que el alginato de bario. Este sistema de cultivo también permite un cultivo de células de alta densidad y el intercambio de nutrientes y oxígeno a través de la membrana 7. Diferenciación espontánea dentro de las cápsulas se ha observado anteriormente, y se supone que, como hCME indiferenciado continúan proliferando dentro de las cápsulas, las células haría eventualmente ruptura de las cápsulas y teratoma forma 1. Otra aplicación clínica de encapsulación es proporcionar protección inmunológica de las células trasplantadas desde el recipiente receptor. Se prevé que el trasplante de hCME y THderivados EIR puede conducir al rechazo inmunológico ya que el bajo nivel de expresión de antígenos MHC de clase I de hESC indiferenciado se incrementa después de la diferenciación 8. También se ha documentado que el trasplante por lo general utiliza la mayor concentración de alginato con el fin de eludir el proceso de rechazo inmunológico 2,9. Nuestro estudio utiliza una menor concentración de alginato (1,1%) que es más adecuado para el cultivo in vitro y la diferenciación de hCME. Todavía está por determinar si la menor concentración de alginato se han utilizado sería ilícita una respuesta inmune similar, ya que anteriormente los informes, así como el mantenimiento de la viabilidad celular caso de que éstos hESC encapsulado ser trasplantados en un huésped inmunocompetente.
Nuestro protocolo de encapsulación optimizado para encapsular hESC produce el tamaño de las cápsulas de 400-500 m de diámetro. Las cápsulas que son más pequeños de 400 micras tienden a tener menor cantidad de células, mientras que las cápsulas grandes (> 500 m) result en una sobrepoblación de las células. encapsulación hESC requiere una formación única célula, que también promueve la apoptosis de las células 6. Hemos demostrado aquí que hESC encapsulado puede seguir sobreviviendo, proliferar y formar EB. Esto se ve reforzada por pre-tratamiento de la hCME con RI antes de la encapsulación, resultando en> 80% hCME ser viable. Por lo tanto, hemos establecido un modelo para hESC la cultura en condiciones de cultivo en 3D y se han extendido estos estudios para la diferenciación dirigida en neuronas DA. Aunque la técnica de encapsulación de células ha sido ampliamente conocida por el cultivo y la diferenciación celular endodérmico diferenciación, neuronal en estas condiciones no se ha estudiado a fondo 10,11. Hemos demostrado aquí que hay un incremento en la expresión de PAX6 y TH mediante análisis de genes y proteínas de expresión después de 7 días en comparación con el sistema de diferenciación 2D, lo que sugiere que el entorno 3D promueve una mejor linaje neuronal DA de estado pluripotente. Sin embargo, los análisis de más éxitoh como prueba de la secreción de dopamina y el ensayo de trasplante se requieren para caracterizar completamente las células diferenciadas. La generación de neuronas DA funcionales robustos de manera eficiente es un requisito esencial para la terapia celular para la enfermedad de Parkinson es llegar a ser una realidad. Nuestra plataforma 3D en la forma propuesta por el co-cultivo con células DA inductores neurales, células PA6 y de alta densidad del sistema de cultivo celular de las neuronas DA hESC diferenciada a través de la encapsulación es un esfuerzo en esa dirección.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por NHMRC Programa de Becas # 568969 (PSS) y la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva Gales del Sur, la Iniciativa de Células Madre (KSS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alginate (Pronova UP MVG) | NovaMatrix | 4200101 | high glucuronic acid content ≥60%, viscosity >200 mPa s, and endotoxin <100 EU/g |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| 0.9% NaCl | Baxter Internationl Inc. | AHF7123 | |
| Type J1 bead generator | Nisco engineering Inc | SPA-0447 | |
| Multi-Phaser syringe pump | New Era | Model NE-1000 | |
| Ezi-Flow Medical Flowmeter | Gascon Systems | G0149 | |
| Y-27632 | Merck & Co., Inc. | 688000 | |
| Human Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4327-1G | |
| Accutase | EMD Millipore | SCR005 | |
| 14G x 2” I.V. catheter | Terumo Medical Corp. | SR-OX1451C | |
| Knockout-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | For SR medium (basal) |
| GlutaMAX -I | Invitrogen | 35050-061 | For SR medium (2 mM) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For SR medium (20%) |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | For SR medium (2.5 U/ml) |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Invitrogen | 41400045 | For SR medium (1x) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For SR medium (0.1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For SR medium (5 mM) |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11710035 | For DA neural differentiation medium (basal) |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | For DA neural differentiation medium (10%) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360070 | For DA neural differentiation medium (1 mM) |
| MEM NEAA Solution | Invitrogen | 11140-050 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | For DA neural differentiation medium (0.1 mM) |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 1314-SH-025/CF | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
| Fibroblast growth factor 8a (FGF8a) | R&D Systems | 4745-F8-050 | For DA neural differentiation (100 ng/ml) |
References
- Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31, 505-514 (2010).
- Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation. Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).
- Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
- Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. Biomaterials for stem cell differentiation. Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).
- Cell encapsulation: promise and progress. Nat. Med. Orive, G. 9, 104-107 (2003).
- Watanabe, K. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Drukker, M. Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).
- Calafiore, R. Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus. Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).
- Cho, M. S. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).
- Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).
