Summary
Gekweekte spiercellen een inadequate model om geïnnerveerde spier recapituleren
Abstract
Menselijke primaire spiercellen aneurally gekweekt in monolaag zelden contract spontaan, omdat, bij het ontbreken van een zenuw component, celdifferentiatie is beperkt en motor neuron stimulatie ontbreekt 1. Deze beperkingen belemmeren in vitro onderzoek van vele neuromusculaire aandoeningen gekweekte spiercellen. Belangrijk is dat de experimentele beperkingen van monolayered, gekweekte spiercellen worden ondervangen door functionele innervatie van myofibers met ruggenmerg explantaten in co-culturen.
Hier wordt tonen verschillende stappen nodig zijn om een efficiënte goede innervatie van humane primaire spiercellen bereiken, waardoor differentiatie en vezels contractie af volgens de methode van Askanas 2. Om dit te doen, zijn spiercellen samen gekweekt met het ruggenmerg explantaten van de rat embryo's bij ED 13.5, met de achterwortelganglia nog aan het ruggenmerg plakjes. Na een paar dagen, de spier fileden beginnen te contracteren en uiteindelijk cross-dwarsgestreepte worden door innervatie door functionele neurieten dat uitsteekt uit het ruggenmerg explantaten dat de verbinding met de spiercellen. Deze structuur kan worden gehandhaafd gedurende maanden eenvoudig door geregelde uitwisseling van het kweekmedium.
De toepassingen van deze instrument van onschatbare waarde zijn talrijk, omdat dit een functioneel model voor multidisciplinaire analyses van de menselijke spierontwikkeling en innervatie. In feite een volledige de novo neuromusculaire installatie optreedt in een kweekschaal, waardoor een gemakkelijke meting van vele parameters bij elke stap in een fundamentele en fysiologische omgeving.
Gewoon om een paar voorbeelden, genomische en / of proteomische onderzoeken citeren kan direct worden uitgevoerd op de co-culturen. Bovendien kunnen pre-en post-synaptische effecten specifiek en afzonderlijk worden beoordeeld op de neuromusculaire verbinding, omdat beide componenten afkomstig zijn van verschillende soorten,rat en mens, respectievelijk. De zenuw-spier co-cultuur kan ook worden uitgevoerd met menselijke spiercellen geïsoleerd van patiënten die lijden aan spier-of neuromusculaire ziekten 3, en kan dus worden gebruikt als screening instrument voor kandidaat-medicijnen. Tenslotte is geen speciale apparatuur, maar regelmatige BSL2 inrichting nodig om functionele motorunit een kweekschaal reproduceren. Deze methode is dus waardevol voor de spier en de neuromusculaire onderzoekgemeenschappen fysiologische en mechanistische studies neuromusculaire functie, in normale en ziekte context.
Protocol
1. Voorbereiding van de primaire menselijke spiercel Cultuur
- Bepaal de menselijke spiercel culturen volgens de explantatie-re-explantatie techniek 4. Verwijder eerst niet-spierweefsel van de biopten. Vervolgens 1 mm 3 spier explantaten insluiten in een coagulum van plasma, waardoor fibroblasten om uit de explantaten.
- De geïntegreerde explantaten overgebracht naar een plasma-gelatine beklede schaal en laten groeien in normale groei medium (MEM aangevuld met 25% Medium 199, 10% foetaal bovine serum [FBS] 1% penicilline / streptomycine, 10 ug / ml insuline 10 ng / ml menselijke epidermale groeifactor [EGF] 12.5 ng / ml humaan fibroblast groeifactor [FGF]) in een monolaag. De cellen die uit de explantaten ontstaan onder die voorwaarden zijn spiercellen. Deze cellen blijven in een monolaag groeien na verwijdering van de explantaten.
- Culture de cellen aneurally op 0,1% gelatine beklede platen in normale groeimedium. De cellen kunnenaneurally gekweekt en versterkt nodig. Beter is spiercellen gebruiken doorgang tussen 3 en 8 de co-culturen voeren. Het is cruciaal om jonge myotubes innerveren; na dit punt, de co-culturen hebben een grote kans op falen. Bovendien moet myotubes niet te groot en te dik.
- Twee dagen voor de innervatie gepland, plaat de spiercellen op 35 mm weefselkweekschalen (of 6 wells platen) met een dichtheid van 500.000 cellen per schaaltje in normale groeimedium. Op dat dichtheid, de cellen op de juiste confluentie om de fusie te starten op de volgende dag, en de daaropvolgende innervatie de dag daarna. Met behulp van deze voorwaarden, de myotubes zijn op het juiste moment voor een optimale innervatie en dus de daaropvolgende vezels contractie.
- Op de volgende dag vervangen normale groeimedium met fusiemedium uit MEM aangevuld met 25% Medium 199, 5% FBS, 10 ug / ml insuline en 1% penicilline / streptomycine.
2. Isolati op een van de Rat Embryonale Spinal Cord Explantaten
De procedure voor het ruggenmerg explantaten isoleren wordt uitgevoerd onder een binoculaire microscoop, in Balanced Salt Solution Hank's (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14170) met 10% foetaal runderserum (FBS).
- Het is van cruciaal belang dat de rat embryo's zijn tussen de ED 13 en 14 als een andere ontwikkelingsfase in gevaar zou brengen de hele procedure. Offer een zwangere vrouw met CO 2 en het verzamelen van de hele keten embryo in HBSS medium. Isoleer elk embryo en onthoofden ze voor euthanasie.
- Ontleden het embryo ruggenmerg van de rest van het lichaam in een stuk en verwijder omliggende spier-en bindweefsel. Wees zeer voorzichtig aan de dorsale wortel klieren (DRG's) die aan het ruggenmerg om functionele innervatie zorgen te houden.
- Dwars snijden elkaar ruggenmerg dat ieder explantaat ten minste twee DRG verbonden (explantaten van 1 mm 3).
- Verwijder de fusiemedium op de spieren celkweek, waarbij een dunne laag medium op de monolaag.
- Plaats de explantaten op de spieren cellaag, vijf gelijkmatig verdeelde explantaten per 35 mm schaal.
- Voeg heel langzaam, druppelsgewijs, fusion medium op elke explant. Het is noodzakelijk medium toe te voegen voor de spiercellen te overleven, maar niet te veel te laten explantaten eerst hechten en contact maken met de cellen. Als het medium niet goed is (te sterk of te veel medium) toegevoegd, zal de explantaten drijven en zullen voldoen aan de spiercellen innerveren.
- Zodra de explantaten beginnen zich te houden, boven de fusie op middellange tot 2 ml per 35 mm schotel, en zet de gerechten heel voorzichtig terug in de incubator.
4. Onderhoud van het heterologe zenuw-spier Co-culturen
- Wijzig de fusie medium twee keer per week.
Zodra twee dagen na de innervatie is het mogelijk om het neurieten die uit elk explantaat en om contacten met de spiercellen, vertegenwoordigd door de knop structuren (Figuur 1).
Al in 4-6 dagen na de innervatie, zal een aantal individuele vezels beginnen te contracteren.
De weeën blijven voor vele maanden, onderhouden gewoon door het veranderen van het kweekmedium twee keer per week.
Na ongeveer 2 weken, het ruggenmerg explant zelf ontaardt, maar de innervatie wordt geconserveerd. Dit is normaal. Een dunne laag van zenuw component blijft op het oppervlak van de spiercel laag. Dit zenuwstelsel netwerk is voldoende om de functionaliteit van de aandrijving te handhaven.
Als de explantaten drijven in het medium de dag na innervatie, zullen ze nooit houden. Dit gebeurt wanneer de spiercel laag isonvoldoende confluent, of wanneer het medium te ruw toegevoegd. Soms zal de explant voldoet, maar geen neurieten ontstaan. Dit komt waarschijnlijk door het ontbreken van DRG is bevestigd. In dat geval ook, zal de bezenuwing niet worden vastgesteld. Manipuleer de gerechten heel voorzichtig de eerste week, omdat de explantaten nog gemakkelijk los te maken. Om de fusie media uit te wisselen, voeg de vloeistof druppelsgewijs met een minimale snelheid om cellen loslaten is uitgesloten.
Figuur 1. Ruggenmerg explantaten-spiercel co-kweken van dag 1 tot dag 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een fysiologische in vitro middel om spier-cel functie te bestuderen in normale en pathologische context is van de hoogste belang is voor de myologists, omdat spiercel culturen meestal niet herhalen het belang van meerdere cellen en cel-achtige verbindingen. De toevoeging van gezuiverde motorneuronen spier cellen niet genoeg om een functionele motorunit bereiken, aangezien de aanwezigheid van Schwann cellen vereist voor de innervatie om efficiënt 5 en het is niet topologisch (3D + speciale verdeling) relevante Het protocol hier beschreven met succes gebruikt om geïnnerveerde spiercellen te vestigen in vitro en resulteert in een complete NMJ rijping die gemakkelijk kunnen worden beoordeeld.
Muismodellen zijn nu beschikbaar voor veel neuromusculaire ziekten. Helaas zijn veel van deze modellen beperkt in termen van vertaling naar de ziekte bij menselijke patiënten, bijvoorbeeld met de muis modellen voor spinale musculaire atrofie, Duchennespierdystrofie of amyotrofische laterale sclerose. Spinale spieratrofie wordt veroorzaakt door een mutatie in het gen SMN1, die gedeeltelijk kan worden beperkt door de aanwezigheid van een tweede SMN gen in het menselijk genoom 6. In tegenstelling, de muizen genoom bevat slechts een gen voor SMN en de deletie embryonaal lethal 7. Zo om muizen spinale spieratrofie modellen ontwikkelen is een menselijk SMN2 kopie kunstmatig ingevoerd in de SMN knockout 8,9. Deze dieren nog steeds het dichtst genetische model om de humane pathologie, maar fenotype waargenomen in die muizen door de expressie van een gen dat SMN2 muizen gewoonlijk niet meer dan 10 geven. In het geval van Duchenne, de mdx muizen een gemuteerde dystrofinegen gelijk aan menselijke patiënten, maar het resultaat is veel minder ernstig dan de symptomen waargenomen bij patiënten 11. De meest gebruikte muismodel voor amyotrophic laterale sclerose, de SOD1 muizen, tot nu toe teleurgesteld in het openbaren van inzichten in de ziekte mechanismen en therapeutische benaderingen 12,13. Daarom, het ruggenmerg explantaten-spiercel co-culturen om de functie te bestuderen, genomics en proteomics kenmerken van de spier uit patiënten, in een volledig fysiologische omgeving, vormen een waardevol instrument om dergelijke complexe ziekten te bestuderen. Verder is deze hetero-soort model helpt om onderscheid te maken tussen neurogene en myogene pathologische mechanismen. 3,14,15
De co-cultuur hier gepresenteerde heeft ook een aantal beperkingen. Bijvoorbeeld, immunohistochemie experimenten op de spiercellen zijn moeilijk uit te voeren op deze structuur, omdat het zenuwuiteinde belichaamd door de explant heeft betrekking op de postsynaptische NMJ apparaat. Dit systeem kan ook worden gebruikt om de neurotrofe of myotone effecten van geneesmiddelen een geïntegreerde beoordeling en relatief volwassen cultuur systeem, maar niet de mogelijkheid high-throughputscreening, als het volume zou veel te groot. Vreemd genoeg was het homologe zenuw-spier co-cultuur met zowel de zenuwen en spieren onderdelen komen alleen van muis of rat is niet functioneel en niet te leiden tot spiercontracties. Onlangs echter, heeft homologe innervatie tussen muis satelliet spiercellen en de muis ruggenmerg explantaten met succes uitgevoerd door wijziging van de datum van embryo oogst (Callizot, Steinschneider en collega's, niet gepubliceerde resultaten). Verdere vooruitgang bij het vaststellen van routine protocollen voor homologe co-culturen kunnen helpen om de soort beperking die er bestaat voor deze techniek vandaag de dag te overwinnen.
Ondanks deze beperkingen, beschrijven we hier een methode die de studie van de vele aspecten van het spier-en motor neuron fysiologie maakt, een techniek die niet moeilijk uit te voeren, vereist geen speciaal materiaal en dat resulteert in stabiele ruggenmerg explantaten-spier co- culturen die gemakkelijk kan worden aangehouden en studied vele maanden.
Bepaalde aspecten van het protocol zijn van bijzonder belang en de speciale zorg nodig hebben om een goede innervatie te garanderen. Ten eerste, de rattenembryo's moeten tussen 13 en 14 ED oud. Tweede 500.000 cellen per 35 mm schaal zorgt het juiste niveau van cellen samenvloeiing te vergemakkelijken hechting van de explantaten die zijn toegevoegd aan de spiercellen zodra celfusie begint. Ten slotte, zoals benadrukt in het protocol, de toevoeging van het medium na de neerlegging van de explantaten op de spiercellen is het moeilijkste deel van deze procedure en moet worden uitgevoerd met uiterste zorg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Ons werk wordt ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (SNF), het Zwitsers initiatief in Systems Biology (SystemsX.ch), de Vereniging voor Musculaire Dystrofie USA (MDA), de Association Française contre les Myopathie (AFM), de Verenigde mitochondriale ziekte Foundation (UMDF), de Gebert-Rüf Stichting Zeldzame Ziekten Programme (GRF), de Zwitserse Vereniging voor Onderzoek van de spierziekten (SSEM / FSRMM), de Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und Medizinische Forschung", de Roche Research Foundation en de Universiteit van Basel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170 | |
| MEM | GIBCO, by Life Technologies | 31095 | |
| Medium 199 | GIBCO, by Life Technologies | 31153 | |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Human EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Human FGF | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Penicillin/streptomycin solution | GIBCO, by Life Technologies | 15140 |
References
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
