Summary
לבצע הערכה מהירה של הפונקציה של הגנים בהתפתחות קליפת המוח, אנו מתארים שיטות הקשורות
Abstract
קליפת המוח מכוון את התפקודים הקוגניטיביים. מבנה זה 6 שכבות נוצרת באופן בפנים ואחת בחוץ, האחרון, שבו הנוירונים הראשונים שנולדו להישאר קרוב יותר החדר ואילו נוירונים שנולדו האחרונות להעביר בעבר הנוירונים שנולדו הראשונים לקראת פני השטח של המוח 1. בנוסף העברה עצבית 2, תהליך מפתח לתפקוד קליפת המוח הנורמלי הוא הסדרת המורפוגנזה עצבית 3. בעוד המורפוגנזה עצבי ניתן ללמוד במבחנה בתרבויות העיקריות, יש הרבה מה ללמוד מהדרך שבה תהליכים אלה מוסדרים בסביבות רקמות.
אנו מתארים טכניקות לניתוח ההגירה העצבית ו / או המורפוגנזה של פרוסות organotypic של קליפת המוח 4,6. וקטור pSilencer שונה משמש המכיל גם מקדם U6 שמניע את RNA כפולים חדים תקועים ואת קלטת ביטוי נפרד המקודד חלבון ה-GFP מונע ביה CMV האמרגן 7-9. הגישה שלנו מאפשר הערכה מהירה של ליקויים תוצאה neurite על מציאה מסוים של גנים מועמדים ונעשה בו שימוש בהצלחה המסך של הרגולטורים של תוצאה neurite 8. כי רק קבוצת משנה של תאים יביע המבנים RNAi, את פרוסות organotypic לאפשר ניתוח פסיפס של פנוטיפים פוטנציאליים. יתר על כן, כי ניתוח זה נעשה אומדן של קרוב בסביבה vivo, הוא מספק עלות נמוכה אלטרנטיבה מהירה לדור של בעלי חיים מהונדס או נוק אאוט לגנים של תפקוד קליפת המוח ידוע. לבסוף, בהשוואה בטכנולוגיה electroporation vivo, את ההצלחה של הניסויים electroporation לשעבר ב vivo אינה תלויה בפיתוח ניתוח מיומן מיומנות ניתן לבצע עם זמן אימון קצר ומיומנות.
Protocol
1. הכנת פתרונות תרבות ותקשורת (לא וידאו)
- הכן 1 ליטר תמיסת מלח מאוזנת האנק של השלם (HBSS) המכיל HBSS 1x, 2.5 מ"מ (Hepes pH7.4), 30 מ"מ D-גלוקוז, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4 ו 4 מ"מ NaHCO 3. להוסיף מים מזוקקים פעמיים (DDH 2 O). סנן לעקר עם מסנן 0.2 מיקרומטר, וחנות ב 4 ° C.
- הכן את התרבות פרוסת בינוני באמצעות 35 מ"ל בסל בינוני איגל התקשורת, 12.9 מ"ל של HBSS מלא, 20 מ"מ D-גלוקוז (1.35 מ"ל של תמיסת M 1), 1 mM Glutamax (0.25 מ"ל של תמיסת 200 מ"מ), 0.5 מ"ל של פניצילין סטרפטומיצין-100x המניות. סנן לעקר עם מסנן 0.2-מיקרומטר, ולאחר מכן להוסיף חום מומת סוס סרום לריכוז הסופי של 5%.
- הכן פתרון Laminin עובד על ידי הפיכת 1 מ"ג / מ"ל פתרון Laminin המניה עם מים סטריליים deionized מזוקקים. הכן 100 aliquots μL ב 0.5 מ"ל צינורות eppendorf ולהקפיא ב -80 ° C.
- הכן פולי-L-ליזין עובד כל כךlution ידי הוספת 5 מ"ל סטרילי H 2 O ל 5 מ"ג של פולי-L-ליזין לעשות 1 מ"ג / מ"ל פתרון המניות. הכן 1 aliquots מ"ל ו ההקפאה ב -20 ° C.
- הכן פתרון הציפוי על ידי דילול 1 מ"ל של פולי-L-ליזין 100 μL של laminin לנפח סופי של 12 מ"ל עם מים סטריליים. להפוך את הפתרון הזה טריים בכל פעם.
2. הכנת הוספת פורסים Organotypic (לא וידאו)
- הכן שתי שש גם צלחות עם הוספת 1 לכל תרבות גם באמצעות מלקחיים סטריליות. הוסף 2 מ"ל סטרילי DDH 2 O מתחת מוסיף תרבות.
- הוסף 1 מ"ל של תמיסת ציפוי על גבי קרום נזהר שלא לנקב את קרום. דגירה לילה חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- הסר מדיה ציפוי ולשטוף עם קרום סטריליים H 2 0 3 פעמים. בואו מוסיף יבש לפני השימוש. הוסף 1.8 מ"ל של מדיום פרוסת תרבות מקום 37 ° C חממה. לעטוף את הצלחות בשימוש עם Parafilmוחנות ב 4 ° C עד 4 שבועות.
3. הכנות לקראת electroporation (לא וידאו)
- הכן בונה RNAi עבור electroporation. כפולות גדיל רנ"א מוסיף חדים היו משובטים לתוך וקטור pSilencer. מכיל פלסמיד: 1) מקדם U6 שמניע את הדור גדיל RNA כפול, ו 2) קלטת ביטוי GFP מונע על ידי האמרגן CMV 8,9. פלסמיד זה תוארה קודם לכן על ידי קונישי ועמיתיו 9 ועוד 7,8. פלסמידים הם מטוהרים באמצעות ערכת maxi-Prep Qiagen, ולהשתמש בהם בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל.
- כדי להמחיש DNA תוך הזרקת אותה, להכין את הצבע 0.5% במהירות פתרון ירוק ולהשתמש בו ב 1:20 עם ה-DNA להיות מוזרק (בדרך כלל 20 μL של ה-DNA עם μL 1 של ירוק מהיר). שאריות DNA מהיר צבע תערובת ירוקה ניתן לאחסן ב -20 ° C עד שבוע.
- ביתור השטח נקי, dissectiכלי נג ו כלי vibratome עם אתנול 70%. לצנן HBSS מושלמת כל כך קר קרח. צ'יל vibratome כלי בידי אריזה קרח סביבו בתוך vibratome עם מעט מים לקירור מהיר. הכן 3% נמוך נקודת ההיתוך agarose באמצעות HBSS שלמים. מיקרוגל דקות 1. הימנע מעל רותחים. לשמור על 42 מעלות צלזיוס waterbath עד לשימוש.
- Electroporation פרמטרים מוגדרים באופן הבא. עבור E15 השימוש העובר 35 V, 5 פעימות, 100 מרחק MS, MS 900 במרווחים בין הפולסים. בעלי חיים גדולים יותר, כדי להבטיח electroporation, השתמש מתח גבוה עד 50 V או להגדיל את מספר פעימות עד 8 פעימות. כדי למנוע נזק לרקמות אצל בעלי חיים צעירים יותר, השתמשו בפולסים או פחות או עד 2 קטניות מתח נמוך עד 25 ו 'פרמטרים אלה עשויים להיות מגוונים וקבע באופן אמפירי בהתאם לגיל של בעל החיים.
4. דיסקציה ו electroporation (וידאו)
- לאחר והרדמת חסד נשים בהריון, לנתח עוברים אל HBSS קרח שלמים. קהפרק אחד העובר בתוך שקי שליה האישיים שלהם.
- לנתח את העובר ולנתק את הראש אחרי החוליה הראשונה. לשמור על HBSS קרח שלמים.
- להזרקה, הצב את הראש על פיסת Parafilm על גבי צלחת פטרי. שימוש בהתאמה אישית המילטון במזרק (ראה לוח ט) להזרים כ 6-8 μL של ה-DNA: מהיר תערובת צבע ירוק דרך החדר השלישי כדי למלא את שני החדרים הצדדיים של שלפוחית קליפת המוח. לחלופין, ניתן לעשות הזרקה ישירות לתוך החדר כל לרוחב.
- עבור electroporation vivo לשעבר, השתמש BTX-פינצטה אלקטרודות פלטינה. מניחים את האלקטרודה החיובית כלפי הצד של קליפת אתה רוצה electroporate העליון של הראש כלומר על קליפת המוח הגב.
- לאחר electroporation, דגירה ראשי על קרח דק 'לפחות 5 לפני הניתוחים.
- לנתח מוחות של HBSSby קרה כקרח עושה חתך קטן בצד של הראש לקלף את עור בצידי הראש. לאחר מכן, עםמלקחיים עדינים לקלף בעדינות והפיה מהמוח. הסר את המוח ללא פגע מן הגולגולת, נזהר שלא לפגוע בקליפה.
5. הטבעת ואת חתך של קליפת המוח Electroporated (וידאו)
- להעביר 3% נמוך נקודת ההיתוך agarose לתוך תבנית גדולה מונחת על קרח. תחתית התבנית יתחיל לגבש מהר יותר אשר ימנע מן המוח שוקע לתחתית של התבנית. בעדינות, להעביר את המוח עם מלקחיים יפים אחד אחד לאחר הסרת עודפי חיץ עם Kimwipe או נייר פילטר. השתמש עצה 10 pipet μL כדי לערבל את המוח בתוך התבנית על מנת להבטיח ממשק מרבי בין agarose ורקמות במוח.
- המזרח המוח כדי לוודא שכל המוחות הם בכיוון זהה וברמה על אותו agarose. בואו agarose לחזק דקות בערך 5. השתמש דבק מלכד (דבק מטורף) לצרף את אבני agarose כך נורות חוש הריח הם בעמידה. לאחר אבני מחוברים, מיד מוסיפים אנילספירה HBSS קרים וקוצצים את agarose לעשות פרוסות בודדות בטוח מתקבלים על המוח כל אחד.
- לחתוך את אבני, קבע מהירות של vibratome למהירות נמוכה (כ 1/2 לכל היותר) ולקבוע את תדירות הרטט להב על ההגדרה הגבוהה ביותר. צור -250 מיקרומטר פרוסות עבות העטרה. אחזור פרוסות בעזרת מרית בסדר כפוף ולהעבירם בארות רקמות עם מברשת או מלקחיים בסדר.
- בשכונה תרביות רקמה, להעביר את פרוסות לתוך מוסיף מצופים. הוספת 500 μL של התקשורת והתרבות פרוסה כדי להוסיף כל לעשות העברה קלה. עד 5 פרוסות יכול להיות ממוקם בכל הוספה. הסר מדיה עודף מהחלק העליון של הפרוסות ואת דגירה על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified.
6. תרבות וניתוח של פרוסות Organotypic (וידאו)
- כדי לשמור על פרוסות בריאים, מדיה טריים יש להוסיף לפחות פעם ביומיים מתחת קרום ידי החלפת מחצית התקשורת בכל פעם.
- על מנת לנתח את פרוסות אחרי Dימים esired בתרבות, לתקן את הפרוסות הממברנה. לשטוף עם חיץ 1x מלוחים פוספט (PBS) ב 37 מעלות צלזיוס שלוש פעמים במשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, לתקן עם Paraformaldehyde 4% (PFA) לילה ב 4 מעלות צלזיוס או שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- פרוסות ניתן לנתח עם סמנים תאיים שונים או מוכתמים Hoechst לבד לדמיין תאים electroporated ולא electroporated. Permeabilize ולחסום פרוסות של 2 שעות בטמפרטורת החדר עם סרום עיזים 10%, טריטון 0.1% ב 1x PBS עם טלטול עדין.
- כתם עם Hoechst עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר, לשטוף 3 פעמים עם 10 דקות 1x PBS פעם עם טלטול עדין.
- לעלות פרוסות לחתוך את הקרום עם אזמל, ולהשתמש מלקחיים עדינים להעביר את הקרום המכיל פרוסות זכוכית חלבית מחליק בתא מים. עד 5 פרוסות יכול להיות ממוקם בכל שקופית זכוכית. הסרה של עודפי מים, ולהוסיף טיפה של פתרון Flourmount על כל פרוסה המוח. בעדינות להניח coverslip על גבי פרוסות המוח ולהסירy בועות אוויר. ניתוח פרוסות באמצעות מיקרוסקופ confocal.
7. פרפין הטבעת אלטרנטיבית של פרוסות Organotypic (לא וידאו)
- פרוסות Organotypic יכול גם להיות מוטבע על פרפין לניתוח עדין מורפולוגי, לשם כך הקרום המכיל את פרוסות organotypic יכול להיות קבוע ב 4% PFA כמתואר לעיל.
- הפרוסות קבועים המוטבעים 1% agarose (לפני לחמם 37 ° C), ביסוס בקרח למשך 30 דקות. אבני agarose אז יכול להיות שלאחר קבוע PFA 4% על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- בלוק agarose המכיל פרוסת organotypic לאחר מכן ניתן יהיה מוטבע פרפין ומעובד immunofluorescence כפי שתואר קודם לכן 10.
8. נציג תוצאות
ייצוג שבתרשים של electroporation של קליפת התרבות Murine של פרוסות organotypic מוצג באיור 1. שיטה זו היא אסטרטגיה יעילה אונסיד הערכת תפקוד של גנים המעורבים בהתפתחות עצבית 11. בהתאם לכמות ה-DNA electroporated ואת השלב העוברי על electroporation, יעילות transfection ישתנו. פרוסות יתחיל להביע את ה-GFP לפחות 8 שעות לאחר electroporation ותאי יעבור את הרצף הרגיל של אירועים neurogenic (התפשטות, הגירה, והבחנה עצבית מוקדמת) בתרבות. תרשים 2 מציג פרוסת המוח electroporated כי הוא מביע ביקורת pSilencer-GFP וקטור ניתן לראות אבות נוירונים, הנוירונים נודדים נוירונים הבדיל ב פרוסה. פרוסות Organotypic ישמור המורפולוגיה שלהם כל עוד הם נשמרים בממשק התקשורת אוויר טוב על הקרומים וניתן להשתמש בו עד לפחות 5 ימים בתרבות.
באיור 1. איור של electroporation vivo לשעבר ואת פרוסת organotypicassay תרבות. E14.5 עוברים הם גזור החוצה, והזריקו בנפרד כדי להמחיש את האתר עם הזרקת ה-DNA מעורבב עם צבע ירוק ומהירה. ה-DNA ניתן להזריק בשני החדרים הצדדיים כמו מתואר באיור או החדר השלישי כדי למלא את החדרים הצדדיים. לאחר ההזרקה, המוח הם electroporated electroporator עם גל מרובע, הצבת אלקטרודה חיובית בצד הרצוי של המוח. המוח המוטבעים 3% נמוך נקודת ההיתוך agarose ו מחולק באמצעות vibratome. 250 פרוסות המוח מיקרומטר ממוקמות על 0.4 מיקרומטר מוסיף ותרבותיים עד שבוע. GFP ניתן לראות לאחר 8 שעות transfection הודעה.
איור 2. ניתוח של פרוסות המוח electroporated. פרוסות המוח Electroporated הוכתמו על Hoescht. קליפת המוח הגב מראה אבות עצביים electroporated על אזור חדרית (VZ). נוירונים קורטיקאל צלחת (CP) הם תחום אזור שוליים (MZ). חיצים לבנים מראים נוירונים נודדים. במקרה זה, המוח הוזרקו ב E15.5 ו electroporated עם וקטור בקרת pSilencer GFP. קטעים מייצגים explants קורטיקליים 4 ימים לאחר electroporation. בר בהיקף 100 מיקרומטר.
פתרון בעיות:
- יעילות נמוכה transfection: התאם את הריכוז של ה-DNA משמש מיקרוגרם לפחות 1 / μL. השתמש תמיד ב-DNA נקי מאוד הכנה מקסי אם השימוש צורך אנדו ללא Quiagen ערכת לטהר את ה-DNA.
- תאים transfected באזור המוח שונה מהרצוי 1: ודא אלקטרודות ממוקמים בצורה נכונה עם מיקום האלקטרודה החיובית כלפי צד של המוח לקבל electroporated.
- פרוסות Organotypic לאבד את המורפולוגיה: התקשורת שנה כל יום ולהבטיח הפרוסות לא צף בתקשורת
- פרוסות יורד agarose כפי שהם נמצאים לחתוך vibratome: ודא כי ממשק טוב הוא עשה כאשר הטבעה במוחם של היתוך נמוכה נקודת agarose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות אלה מעורבים electroporation vivo לשעבר של פלסמידים קידוד כפולה גדילי RNA סיכות ראש 8 והתרבות של פרוסות organotypic 4 מספקים מספר יתרונות בולטים. ראשית, שיטות אלו מאפשרים הערכה מהירה של RNAi הנגזרות פנוטיפים. הכללתו של ה-GFP קלטת קידוד ביטוי וקטור pSilencer אותו המכיל מקדם U6 שמניע את סיכת ראש כפול גדילי RNA מאפשר זיהוי ואפיון מהיר של תאים electroporated עם וקטור RNAi. בנוסף ליעילות בזמן, שיטות אלה הם מאוד חסכונית בהשוואה לדור של קווי בנוקאאוט מספר. שנית, לעומת 12 electroporation הטכנולוגיה הישרדות הדורש אימון ופיתוח מיומנות יותר כדי להבטיח את הישרדותו של בעל החיים וההצלחה של electroporation, בשיטות שתוארו כאן ניתן לבצע עם זמן אימון קצר ומיומנות. בהישרדות vivo שלurgeries הם שקועים גם בשיעור הבסיסי כישלון שעלולות להיות קשורות עם חיה (האם הגור) לתחלואה. בעלי חיים אלה לעיתים קרובות צריך להיות מוערך על ידי צוות מיומן סביר ו / או וטרינרים ממתקן החי. שלישית, כי הם בתרבית של עד 5 ימים או יותר במבחנה, הם מאפשרים לנו להתמודד עם מגוון רחב של שאלות הקשורות התפשטות העצבית, קביעת גורל התא, העברה עצבית ו בשלבים הראשונים של התבגרות העצבית (תוצאה neurite). רביעית, כי אנחנו פועלים בתרבות, אנחנו יכולים גם להוסיף גורמים חיצוניים כדי לבדוק את תפקידם של גורמי גדילה וסוכני תרופות במנגנונים התפתחותיות שתוארו. חמישית, הגישה electroporation לשעבר vivo עדיפה על הגישה אקדח גנים, כי זה מאפשר מיקוד של אזורים ספציפיים של המוח על ידי דווקא מכוונת את האלקטרודות. לבסוף, לעומת התמרה ויראלית של פרוסות organotypic הגישה electroporation מאפשר tra גבוה יותרnsfection היעילות של תאים ראשוניים.
שיטות אלה צריך מספר מגבלות. אלא אם כן את הטכניקה פרוסת משתנה כדי לקיים תרבות תקופות ארוכות יותר, השיטות האלה לא יכול להיות אידיאלי כדי להעריך synaptogenesis או התפתחותית האירועים המתרחשים מאוחר יותר. מגבלה נוספת עשויה להיות שחזור של התוצאות תלויה מאוד במיקום האלקטרודה. בפועל יש צורך להבטיח electroporation האזור במוח אותו דבר המגדיל שחזור של התוצאות. בסופו של דבר, שמירה על ממשק אוויר / נוזל הוא גם חיוני כדי להבטיח את פרוסות בריאים. כפי שתואר לעיל, אנו צופים כי הכישורים האלה ניתן לרכוש בקלות על ידי קוראי יופיטר, וכי את היתרונות של שיטות אלו עולים באופן משמעותי את המגבלות שניתן את היישום המתאים. לסיכום, neurodevelopment חוליות נשלטת על ידי מספר רב של גנים. המורפוגנזה עצבי בפרט היא נושא מאוד מעניין וחשוב. גישה זו מאפשרתהשיטה היעילה ביותר לתפקוד ההקרנה גנים במהלך neurodevelopment ועשוי לשמש במגוון רחב מאוד של מטרות הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר שירין Bonni למתן pSil-GFP מבנה, ד"ר אלפר Uzun להמחשה של איור 1, ואת מתקן bioimaging לדוק עבור מיקרוסקופיה confocal. EMM נתמך על ידי פרס קריירה למדע רפואי Wellcome בורוז קרן, פרס חוקרים NARSAD יאנג, ו-NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01. SBL נתמך על ידי NIH NCRR COBRE RR018728 P20-01, וקיבל תמיכה PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX Technologies | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX Technologies | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX Technologies | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | Leica Microsystems | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | Falcon BD | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | Falcon BD | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Low Melting Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma-Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma-Aldrich | H4034 |
References
- Angevine, J. B. Jr, Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
