Summary
At foretage en hurtig vurdering af funktionen af gener i udviklingen af cerebral cortex, beskriver vi fremgangsmåder, der involverer
Abstract
Hjernebarken dirigerer højere kognitive funktioner. Denne seks lagdelt struktur er dannet i en indvendig-først ud-sidste måde, hvor de første fødes neuroner forbliver tættere til ventriklen, medens de sidste fødes neuroner migrerer forbi den første fødes neuroner mod overfladen af hjernen 1. Ud over neuronal migration 2, er en vigtig fremgangsmåde til normal cortical funktion regulering af neuronale morfogenese 3. Mens neuronal morfogenese kan studeres in vitro i primære kulturer, der er meget at lære fra, hvordan disse processer er reguleret i væv miljøer.
Vi beskriver teknikker til at analysere neuronal migration og / eller morfogenese i organotypiske skiver af hjernebarken 4,6. En pSilencer modificerede vektor anvendes, som indeholder både en U6 promotor, der driver de dobbeltstrengede hairpin RNA og et separat ekspressionskassette, der koder for GFP-protein drevet bya CMV-promotoren 7-9. Vores fremgangsmåde giver mulighed for hurtig vurdering af defekter i neuritudvækst på specifik knockdown af kandidatgener og er blevet anvendt i en screening for regulering af neuritudvækst 8. Fordi kun en undergruppe af celler vil udtrykke RNAI konstruktionerne de organotypiske skiver tillader en mosaik analyse af potentielle fænotyper. Endvidere, fordi denne analyse udføres i en nær tilnærmelse til in vivo-miljø, men tilvejebringer en billig og hurtig alternativ til generering af transgene eller knockout dyr gener med ukendt cortical funktion. Endelig, i sammenligning med in vivo elektroporation teknologi, er succes ex vivo elektroporation forsøg, der ikke afhængig af dygtige kirurgi udvikling af færdigheder og kan udføres med en kortere uddannelse tid og dygtighed.
Protocol
1. Forberedelse Kultur Solutions og medier (ikke video)
- Fremstille en liter komplet Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) indeholdende 1X HBSS, 2,5 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM D-glucose, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 og 4 mM NaHCO3. Tilsættes dobbelt destilleret vand (ddH2O). Filtersteriliser med en 0,2 um filter og opbevares ved 4 ° C.
- Forberede skive dyrkningsmedium under anvendelse af 35 ml Basal Medium Eagle media, 12,9 ml komplet HBSS, 20 mM D-glucose (1,35 ml af 1 M opløsning), 1 mM Glutamax (0,25 ml af en 200 mM opløsning), 0,5 ml Penicillin -streptomycin 100x lager. Filtersteriliser med en 0,2 um filter, tilsæt derefter varmeinaktiveret hesteserum til en slutkoncentration på 5%.
- Fremstille Laminin arbejdsopløsning ved at en 1 mg / ml laminin stamopløsning med sterilt destilleret deioniseret vand. Fremstilling af 100 pi alikvoter i 0,5 ml Eppendorf-rør og fryse ved -80 ° C.
- Forbered Poly-L-lysin arbejder såresolution ved tilsætning af 5 ml sterilt H2O til 5 mg af poly-L-lysin for at gøre en 1 mg / ml stamopløsning. Fremstilling af 1 ml prøver og fryse ved -20 ° C.
- Fremstille coating-opløsning ved at fortynde 1 ml poly-L-lysin og 100 pi af laminin til et slutvolumen på 12 ml med sterilt vand. Gør denne løsning frisk hver gang.
2. Forberedelse Organotypiske Slice Indsætter (ikke i video)
- Forbered to seks-brønds plader med en kultur indlæg per brønd med sterile pincetter. Tilsæt 2 ml sterilt ddH2O under de kultur skær.
- Tilsæt 1 ml af coatingopløsningen på toppen af membranen og undgå at punktere membranen. Inkuber natten over i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Fjern belægning medier og vask membran med sterile H 2 0 tre gange. Lad indsætter tørre før brug. Tilsættes 1,8 ml skive dyrkningsmedium og anbringes i 37 ° C inkubator. Pak de ubrugte pladerne med Parafilmog opbevar ved 4 ° C i op til 4 uger.
3. Forberedelse til Elektroporation (ikke video)
- Forberede RNAi konstruktioner til elektroporation. Dobbelt-strengede RNA-hairpin insertioner blev klonet ind i en pSilencer vektor. Plasmidet indeholder: 1) en U6 promotor, der driver den dobbelte RNA produktion og 2) en GFP-ekspressionskassette drevet af CMV promotoren 8,9. Dette plasmid er tidligere blevet beskrevet af Konishi og kolleger 9 og andre 7,8. Plasmider oprenset under anvendelse af en Qiagen maxi-prep-kit og anvendes i en koncentration på 1 mg / ml.
- For at visualisere DNA under injektion det fremstilling af en 0,5% fast green farveopløsning og bruge det til 01:20 med DNA, der skal injiceres (sædvanligvis 20 ul af DNA med en pi fast green). Overs DNA-fast green farvestofblanding kan opbevares ved -20 ° C i op til en uge.
- Ren dissektion område dissecting værktøjer og vibratome kar med 70% ethanol. Chill komplette HBSS, således at det er iskold. Chill vibratome fartøj ved at pakke isen omkring det inde i vibratome med lidt vand for hurtig afkøling. Fremstilling af 3% agarose med lavt smeltepunkt ved hjælp af komplet HBSS. Mikroovn i 1 min. Undgå over kogende. Opbevares i en 42 ° C vandbad indtil brug.
- Elektroporeringsteknikker parametre er indstillet som følger. For en E15 foster brug 35 V,. 5 impulser, 100 ms længde, 900 ms interval mellem pulser For ældre dyr, for at sikre elektroporering anvende højere spænding op til 50 V eller forøge antallet af impulser op til 8 impulser. For at undgå at beskadige vævet hos yngre dyr, enten bruge færre impulser eller op til 2 bælgfrugter og lavere spænding op til 25 V. Disse parametre kan varieres, og bestemmes empirisk afhængigt af dyrets alder.
4. Dissektion og Elektroporation (i video)
- Efter euthanizing en gravid kvinde, dissekere embryoner ud i iskold komplet HBSS. Keep hver embryo i deres individuelle placenta sække.
- Dissekere foster ud og huggede hovedet efter den første ryghvirvel. Opbevares i iskolde komplette HBSS.
- Til injektion, placeres hovedet på et stykke parafilm oven på en petriskål. Ved hjælp af specialfremstillede Hamilton-sprøjte (se tabel I) tilføre omkring 6 til 8 pi DNA: fast green farvestof blanding gennem den tredje ventrikel for at udfylde i begge laterale ventrikler i corticale vesiklerne. Alternativt kan injektionen foretages direkte i hver lateral ventrikel.
- For ex vivo elektroporation, kan du bruge BTX-pincetfladerne platinelektroder. Anbring den positive elektrode til den side af cortex du ønsker at elektroporere dvs toppen af hovedet for dorsale cortex.
- Efter elektroporation inkubere hoveder på is i mindst 5 minutter før dissekere.
- Dissekere hjerner i iskold HBSSby give et lille indsnit på siden af hovedet og afskalning af huden fra siderne af hovedet. Dernæst medfine tænger forsigtigt skalle pia fra hjernen. Fjern den intakte hjerne fra kraniet, pas på ikke at beskadige cortex.
5. Indlejring og Sektionsinddeling af Elektroporerede cortex (i video)
- Overfører 3% agarose med lavt smeltepunkt i et stort form anbragt på is. Bunden af formen, vil begynde at størkne hurtigere, som vil forhindre hjerner fra synker ned til bunden af støbeformen. Forsigtigt, overføre hjerner med fine pincet én efter én efter at fjerne overskydende buffer med en Kimwipe eller filtrerpapir. Anvende en 10 ul pipettespids til at hvirvle hjernen inde i formen for at sikre maksimal grænseflade mellem agarose og hjernevæv.
- Orient hjernen at sikre alle hjerner befinder sig i samme retning og på nogenlunde samme niveau i agarose. Lad agarose størkne i omkring 5 min. Brug limning (skør lim) til at fastgøre agarosen blokke, så de olfaktoriske pærer der står op. Når blokkene er fastgjort, straks tilføje ice kolde HBSS og trim agarose for at sikre, enkelte skiver er opnået for hver hjerne.
- At skære blokkene, indstille vibratome sin hastighed til en lav hastighed (ca. halvdelen af den maksimale), og indstil bladet vibrationsfrekvens på højeste indstilling. Generer 250-um tykke koronale skiver. Hent skiver ved hjælp af en bøjet fin spartel og overføre dem til væv brønde med en fin pensel eller en pincet.
- I vævskultur hætte, overføre skiver i belagte skær. Tilsæt 500 pi skive dyrkningsmedier til hver indsats for at foretage overførslen let. Op til 5 skiver kan placeres pr indsats. Fjerne overskydende medie fra toppen af skiverne og inkuberes ved 37 ° C i befugtet inkubator.
6. Kultur og analyse af Organotypiske Skiver (i video)
- For at opretholde sunde skiver skal frisk medium tilsættes mindst hver anden dag under membranen ved at erstatte halvdelen af mediet hver gang.
- For at analysere skiver efter desired dage i kultur, fastgøres skiver i membranen. Vaskes med 1 x phosphatbufret saltvand (PBS) ved 37 ° C tre gange i 10 minutter hver gang. Dernæst fastgøres med 4% paraformaldehyd (PFA) natten over ved 4 ° C eller i 1 time ved stuetemperatur.
- Skiver kan analyseres med forskellige cellulære markører eller farves med Hoechst alene at visualisere elektroporerede og ikke-elektroporerede celler. Permeabilisere og blokere skiver i 2 timer ved stuetemperatur med 10% gedeserum og 0,1% triton i 1x PBS med forsigtig rystning.
- Farves med Hoechst i 1 time ved stuetemperatur, vaskes 3 gange med 1X PBS 10 minutter hver gang med forsigtig rystning.
- For at montere skiver skære membranen med en skalpel, og bruge en fin pincet til at overføre membranen indeholder skiver med en matteret glas glider i et vandkammer. Op til 5 skiver kan placeres pr objektglasset. Fjern overskydende vand, og tilsæt en dråbe Flourmount opløsning til hver hjerne skive. Anbring forsigtigt et dækglas på toppen af hjernen skiver og fjerne eny luftbobler. Analysere skiver med et konfokalt mikroskop.
7. Alternativ Paraffin indlejring af Organotypiske Skiver (ikke video)
- Organotypiske skiver kan også indlejres i paraffin til en finere morfologisk analyse med henblik herpå membran indeholdende de organotypiske skiver kan fikseres i 4% PFA som beskrevet ovenfor.
- De faste skiver er indlejret i 1% agarose (præ-opvarmet til 37 ° C) og størknede i is i 30 min. Agarosen blokke kan så være post-fikseret i 4% PFA ved 4 ° C i 30 minutter.
- Agarosen blok indeholder organotypisk skive vil blive indlejret i paraffin og behandles immunfluorescens som beskrevet tidligere 10.
8. Repræsentative resultater
En skematisk repræsentation af elektroporation af murine cortex og dyrkning af organotypiske skiver er vist i fig 1. Denne fremgangsmåde er en nyttig strategi til rapid vurdering af funktionen af gener involveret i neuronal udvikling 11. Afhængigt af mængden af DNA elektroporeret og fosterstadiet ved elektroporering vil transfektionseffektivitet variere. Skiver vil begynde at udtrykke GFP mindst 8 timer efter elektroporering og celler vil undergå den normale sekvens af neurogen hændelser (proliferation, migration og tidlig neuronal differentiering) i kultur. Figur 2 viser en elektroporerede hjerne skive, der udtrykker en kontrol pSilencer-GFP vektor og man kan observere neurale stamceller, der migrerer neuroner og differentierede neuroner i skive. Organotypiske skiver vil holde deres morfologi, så længe de opretholdes i en god medie-luft-grænsefladen på membranerne og kan anvendes op til mindst 5 dage i kultur.
Figur 1. Illustration af ex vivo elektroporation og organotypisk skivekultur assay. E14.5 embryoer dissekeres ud og individuelt injiceret med DNA blandet med fast green farvestof med henblik på at visualisere injektionsstedet. DNA kan injiceres i både de laterale ventrikler, som vist i illustrationen eller den tredje ventrikel for at fylde de laterale ventrikler. Efter injektion hjerner elektroporeret med en firkantet bølge elektroporator, placere den positive elektrode på den ønskede side af hjernen. Hjernerne indlejret i 3% agarose med lavt smeltepunkt og snit ved hjælp af en vibratome. 250 um hjerne skiver anbringes på 0,4 um skær og dyrkes op til en uge. GFP kan observeres efter 8 timer efter transfektion.
Figur 2. Analyse af elektroporerede hjernen skiver. Elektroporerede hjerne skiver blev farvet for Hoescht. Dorsal cortex viser elektroporeret neuronale progenitorceller ved den ventrikulære zone (Vz). Neuroner i Cortical plade (cp) er afgrænset af den marginale zone (Mz). Hvide pile viser migrerer neuroner. I dette tilfælde blev hjerner injiceret ved E15.5 og elektroporeret med en pSilencer GFP kontrol vektoren. Sektionerne repræsenterer corticale eksplantater 4 dage efter elektroporering. Målestokken 100 um.
Fejlfinding:
- Lav transfektionseffektivitet: justeres koncentrationen af DNA anvendes til mindst 1 ug / ul. Altid anvende meget ren DNA fra en maxi præparativ eventuelt anvendes en endo-fri Quiagen kit til at oprense DNA.
- Celler transficeret i et andet hjernen område end en ønsket: Sørg for at elektroderne er placeret korrekt med den positive elektrode holdning til den side af hjernen skal elektroporeres.
- Organotypiske skiver mister morfologi: Skift medierne hver dag og sikre skiverne ikke flyder i medierne
- Skiver kommer ud af agarose som de bliver skåret i VIbratome: Sørg for, at en god brugerflade foretages, når indlejring hjernen i agarose med lavt smeltepunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Disse fremgangsmåder involverer ex vivo elektroporation af plasmider, der koder dobbeltstrenget RNA hårnåle 8 og dyrkning af organotypiske skiver 4 tilvejebringer flere forskellige fordele. Første af disse fremgangsmåder giver mulighed for en hurtig vurdering af RNAi-afledte fænotyper. Optagelse af en ekspressionskassette der koder for GFP i den samme pSilencer vektor, der indeholder U6 promotoren, som driver den dobbeltstrengede RNA-hairpin muliggør en hurtig identifikation og karakterisering af celler elektroporeret med RNAi vektoren. Ud over tid effektivitet, er disse metoder meget omkostningseffektiv sammenlignet med generering af flere knockout linier. For det andet, i sammenligning med overlevelse elektroporation teknologi, 12, der kræver længere uddannelse og kompetenceudvikling for at sikre overlevelse af dyret og succes elektroporation, her beskrevne metoder kan udføres med en kortere uddannelse tid og dygtighed. In vivo overlevelse surgeries også nedsunket af en baseline fejlrate, der kan være forbundet med dyr (mor og unger) morbiditet. Disse dyr vil ofte være nødvendigt at vurdere ved rimeligt dygtige medarbejdere og / eller dyrlæger fra dyret anlægget. For det tredje, fordi de dyrkes i op til 5 dage eller mere in vitro, giver de os mulighed for at løse en bred vifte af spørgsmål relateret til neuronal spredning, celleskæbnen beslutsomhed, neuronal migration og de tidlige stadier af neuronal modning (neuritvækst). Det fjerde, fordi vi arbejder i kultur, er vi også i stand til at tilføje eksogene faktorer for at teste rolle vækstfaktorer og farmaceutiske midler i de neurologiske beskrevne mekanismer. For det femte elektroporering fremgangsmåde ex vivo er at foretrække frem for en genkanon fremgangsmåde, fordi det tillader målretning af specifikke regioner i hjernen ved en præcis orientering elektroderne. Endelig, i forhold til viral transduktion af organotypiske skiver af elektroporering fremgangsmåde giver mulighed for en højere TRAnsfection effektiviteten af primære celler.
Disse metoder har nogle begrænsninger. Medmindre skive teknikken er modificeret til at opretholde længere kultur perioder, kan disse metoder ikke er ideelle til at vurdere synaptogenesis eller udviklingsmæssige hændelser, der forekommer senere. En yderligere begrænsning kan være, at reproducerbarheden af resultaterne er meget afhængig af elektrodeplacering. Nogle praksis er nødvendig for at sikre elektroporation i samme område af hjernen, som øger reproducerbarhed af resultaterne. Endelig, vedligeholdelse af luft / væske-grænsefladen er også afgørende for at sikre sunde skiver. Som beskrevet ovenfor, forventer vi, at disse færdigheder nemt kan erhverves af Jové læsere, og at styrken af disse metoder i høj grad opvejer de begrænsninger, givet det relevante program. Sammenfattende er vertebrat nervesystemets styres af et stort antal gener. Neuronal morfogenese i særdeleshed er en meget interessant og vigtigt emne. Denne fremgangsmåde giver mulighed forfor en meget effektiv fremgangsmåde til screening genfunktion i nervesystemets og kan tjene en meget bred vifte af forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Shirin Bonni til tilvejebringelse af pSil-GFP-konstruktion, Dr. Alper Uzun til illustration af figur 1, og Leduc Bioimaging facilitet til konfokal mikroskopi. EMM er støttet af Career Award for Medical Science fra Burroughs Wellcome Fund, en NARSAD Young Investigators Award, og NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01. SBL er støttet af NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01, og har modtaget støtte fra PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX Technologies | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX Technologies | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX Technologies | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | Leica Microsystems | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | Falcon BD | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | Falcon BD | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Low Melting Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma-Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma-Aldrich | H4034 |
References
- Angevine, J. B. Jr, Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
