Summary
Å foreta en rask vurdering av funksjon av gener i utviklingen av cerebral cortex, beskriver vi metoder som involverer
Abstract
Hjernebarken styrer høyere kognitive funksjoner. Dette seks lagdelt struktur er generert i en innside-første, utenfor-siste måte, der de første født nervecellene forblir nærmere ventrikkel, mens de siste født nervecellene vandrer forbi de første født nevronene mot overflaten av hjernen en. I tillegg til neuronal migrasjon 2, er en viktig prosess for normal kortikal funksjon regulering av nevronale morphogenesis tre. Mens neuronal morphogenesis kan studeres in vitro i primære kulturer, det er mye å lære fra hvordan disse prosessene er regulert i vev miljøer.
Vi beskriver teknikker for å analysere neuronal migrasjon og / eller morphogenesis i organotypic skiver av hjernebarken 4,6. En pSilencer endret vektor benyttes som inneholder både en U6 promoter som driver de doble strandede hårnål RNA og en separat uttrykk kassett som koder GFP protein drevet bya CMV promoter 7-9. Vår tilnærming åpner for rask vurdering av mangler i neurite utvekst på spesifikk knockdown av kandidat gener og har blitt brukt i en skjerm for regulering av neurite utvekst 8. Fordi bare en undergruppe av celler vil uttrykke RNAi konstruerer, de organotypic skiver gi rom for en mosaikk analyse av potensielle fenotyper. Videre, fordi denne analysen er gjort i en nær tilnærming til in vivo miljøet, gir det en lav pris og rask alternativ til generering av transgene eller knockout dyr for gener med ukjent kortikal funksjon. Til slutt, i sammenligning med in vivo electroporation teknologi, er suksessen til ex vivo electroporation eksperimenter ikke avhengig av dyktige kirurgi kompetanseutvikling og kan utføres med en kortere opplæringstid og dyktighet.
Protocol
1. Forbereder Kultur Solutions og media (ikke i video)
- Forbered 1 liter Complete Hank balanserte saltløsning (HBSS) inneholder 1x HBSS, 2,5 mm Hepes (pH7.4), 30 mm D-glukose, 1 mm 2 CaCl, 1 mm MgSO 4 og 4 mm NaHCO 3. Legg dobbel destillert vann (DDH 2 O). Filtrer sterilisere med en 0,2-mikrometer filter og oppbevares ved 4 ° C.
- Forbered skive kultur medium å bruke 35 ml av Basal Medium Eagle media, 12,9 mL av komplette HBSS, 20 mm D-glukose (1,35 mL 1 M løsning), 1 mm Glutamax (0,25 ml av en 200 mm løsning), 0,5 ml av Penicillin -streptomycin 100x lager. Filtrer sterilisere med en 0,2-mikrometer filter, legg deretter til varme-inaktivert hest serum til en endelig konsentrasjon på 5%.
- Forbered Laminin arbeider løsning ved å lage en 1 mg / ml Laminin stamløsning med sterilt destillert deionisert vann. Forbered 100 mL alikvoter i 0,5 ml Eppendorf rør og fryse ved -80 ° C.
- Forbered Poly-L-lysin jobbe såforurensning ved å tilsette 5 ml sterilt H 2 O til 5 mg av poly-L-lysin for å lage en 1 mg / ml stamløsning. Forbered 1 ml alikvoter og fryse ved -20 ° C.
- Forbered belegg løsning ved å fortynne 1 ml av poly-L-lysin og 100 mL av laminin til en endelig volum på 12 ml med sterilt vann. Gjør denne løsningen frisk hver gang.
2. Forbereder Organotypic Slice Setter (ikke i video)
- Forbered to seks-brønns plater med en kultur insert per brønn med steril tang. Tilsett 2 ml sterilt DDH 2 O under kulturindustrien setter.
- Tilsett 1 mL av belegget løsningen på toppen av membranen tar seg ikke å punktere membranen. Inkuber over natten i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Fjern belegg media og vask membran med sterile H 2 0 tre ganger. La setter tørre før bruk. Legg 1,8 mL skive kultur medium og plass i 37 ° C inkubator. Pakk de ubrukte platene med Parafilmog oppbevar ved 4 ° C i opptil 4 uker.
3. Forberedelse for electroporation (ikke i video)
- Forbered RNAi konstruerer for electroporation. Dobbel tråd RNA hårnål setter klonet inn i en pSilencer vektor. Plasmidet inneholder: 1) en U6 promoter som driver dobbel tråd RNA generasjon, og 2) en GFP uttrykk kassett drevet av CMV promoter 8,9. Dette plasmidet er tidligere beskrevet av Konishi og kolleger 9 og andre 7,8. Plasmider er renset ved hjelp av en Qiagen maxi-prep kit, og brukes i en konsentrasjon på 1 mg / ml.
- For å visualisere DNA mens injisere det, utarbeide en 0,5% rask grønt fargestoff løsning og bruke den på 1:20 med DNA som skal injiseres (vanligvis 20 mL av DNA med en mL av rask grønn). Overs DNA-rask grønt fargestoff blandingen kan oppbevares ved -20 ° C i opptil en uke.
- Clean disseksjon området, dissecting verktøy og vibratome fartøy med 70% etanol. Chill komplette HBSS slik at det er iskaldt. Chill vibratome fartøy ved pakking is rundt det inni vibratome med litt vann for hurtig nedkjøling. Forbered 3% lavt smeltepunkt agarose hjelp komplette HBSS. Mikrobølgeovn i 1 min. Unngå over kokende. Oppbevares i en 42 ° C waterbath inntil bruk.
- Electroporation parametere er satt som følger. For en E15 embryo bruk 35 V, 5 pulser, 100 ms lengde, 900 ms intervall mellom pulsene. For eldre dyr, for å sikre electroporation, bruke høyere spenning opp til 50 V eller øke antall pulser inntil 8 pulser. For å unngå skade på vevet i yngre dyr, enten bruke færre pulser eller opptil to belgfrukter og lavere spenning opp til 25 V. Disse parametrene kan varieres, og bestemmes empirisk avhengig av alderen på dyret.
4. Disseksjon og electroporation (i video)
- Etter euthanizing en gravid kvinne, dissekere embryoer ut i iskalde komplette HBSS. KeEp hvert embryo i sine individuelle placenta sacs.
- Dissekere embryo ut og kutte hodet etter den første vertebra. Hold i iskalde komplette HBSS.
- For injeksjon, plasserer hodet på et stykke Parafilm på toppen av en petriskål. Bruke skreddersydde Hamilton sprøyte (se tabell I) injisere om 6-8 mL av DNA: rask grønt fargestoff mix gjennom tredje ventrikkel for å fylle begge laterale ventriklene i hjernebark blemmer. Alternativt kan injeksjonen gjøres direkte inn i hver lateral hjertekammer.
- For ex vivo electroporation, bruke BTX-pinsetten platina elektroder. Plasser den positive elektroden mot siden av hjernebarken du ønsker å electroporate dvs. toppen av hodet for dorsal cortex.
- Etter electroporation, inkuber hodene på is i minst 5 min før dissekere.
- Dissekere hjerner i iskaldt HBSSby lage et lite snitt på siden av hodet og peeling av huden av de sidene av hodet. Neste, medfin pinsett forsiktig skrelle bort Pia fra hjernen. Fjern intakt hjerne fra skallen, tar seg ikke å skade cortex.
5. Innebygging og Seksjonering av Electroporated Cortices (i video)
- Overfør 3% lavt smeltepunkt agarose inn i en stor mold plasseres på is. Bunnen av mugg vil begynne å stivne raskere som vil forhindre hjernen fra å synke ned til bunnen av formen. Forsiktig, overføre hjerner med fine tang én etter én etter å fjerne overflødig buffer med en Kimwipe eller filter papir. Bruk en 10 mL pipette tips til virvel hjernen inne i mold for å sikre maksimal grensesnittet mellom agarose og hjernevev.
- Orient hjernen å sikre at alle hjerner er i samme retning og på omtrent samme nivå i agarose. La agarose stivne i ca 5 min. Bruk binding lim (gal lim) til å feste agarose blokkene slik at lukt pærer er stående opp. Når blokkene er vedlagt, straks legger jegce kalde HBSS og trimme agarose å sørge for at individuelle skiver er oppnådd for hver hjernen.
- Å skjære blokkene, sette vibratome er hastigheten til en lav hastighet (omtrent halvparten av maksimum) og setter kniven vibrasjonsfrekvens på høyeste innstilling. Generer 250 mikrometer tykke koronale skiver. Hente skiver ved hjelp av en bøyd fin slikkepott og overføre dem til vev brønner med en fin børste eller tang.
- I vevskultur hette, overføre skiver inn belagte innsatser. Legg til 500 mL av slice dyrkingsmedier til hver innsatsen for å gjøre overføringen enkelt. Opptil 5 skiver kan plasseres per innsatsen. Fjern overflødig utskriftsmateriale fra toppen av skiver og inkuber ved 37 ° C i fuktet inkubator.
6. Kultur og analyse av Organotypic Slice (i video)
- For å opprettholde sunne skiver, bør friske media legges minst annenhver dag under membranen ved å erstatte halvparten av media hver gang.
- For å analysere skiver etter desired dager i kultur, fikse skiver i membranen. Vask med 1x fosfat saltløsning buffer (PBS) ved 37 ° C tre ganger i 10 min hver gang. Neste, fikse med 4% Paraformaldehyde (PFA) over natten ved 4 ° C eller for en time ved romtemperatur.
- Slices kan analyseres med ulike cellulære markører eller beiset med Hoechst alene for å visualisere electroporated og ikke-electroporated celler. Permeabilize og blokkere skiver for 2 t ved romtemperatur med 10% geit serum, 0,1% Triton i 1x PBS med forsiktig risting.
- Flekk med Hoechst for 1 time i romtemperatur, vask 3 ganger med 1x PBS 10 min hver gang med forsiktig risting.
- Slik monterer skiver klippe membranen med en skalpell, og bruke en fin pinsett til å overføre membranen inneholder skiver til en frostet glass glir i et vann kammer. Opptil fem skiver kan plasseres per glass lysbilde. Fjern overflødig vann, og tilsett en dråpe Flourmount løsning til hver hjernen skive. Stikk forsiktig en dekkglass på toppen av hjernen skiver og fjerne eny luftbobler. Analyser skiver ved hjelp av en confocal mikroskop.
7. Alternativ Parafin Embedding av Organotypic Slice (ikke i video)
- Organotypic skiver kan også bygges for parafin for en finere morfologisk analyse, for dette formål membranen inneholder organotypic skivene kan festes i 4% PFA som beskrevet ovenfor.
- De faste skiver er innebygd i 1% agarose (forvarmet til 37 ° C), og befestet i is i 30 min. De agarose blokker kan da være post-fiksert i 4% PFA ved 4 ° C i 30 min.
- Den agarose blokken inneholder organotypic skive vil da være forankret i parafin og behandlet for immunfluorescens som tidligere beskrevet 10.
8. Representative Resultater
En diagrammatisk representasjon av electroporation av murine cortex og kultur organotypic skiver er vist i figur 1. Denne metoden er en nyttig strategi for rask tilførd vurdering av funksjon av gener involvert i nevronale utvikling 11. Avhengig av mengden av DNA electroporated og fosterstadiet ved electroporation, vil transfeksjon effektivitet varierer. Slices starter uttrykker GFP minst 8 timer etter electroporation og celler vil gjennomgå den normale sekvensen av nevrogene hendelser (spredning, migrasjon, og tidlig neuronal differensiering) i kultur. Figur 2 viser en electroporated hjerne stykke som uttrykker en kontroll pSilencer-GFP vektor og man kan observere nevrale stamceller, migrerer nevroner og differensierte nevroner i stykket. Organotypic skiver vil beholde sin morfologi så lenge de blir vedlikeholdt på en god media-luft-grensesnittet på membraner og kan brukes opp til minst 5 dager i kultur.
Figur 1. Illustrasjon av ex vivo electroporation og organotypic skivekultur-analysen. E14.5 embryoer blir dissekert ut, og individuelt injisert med DNA blandet med rask grønt fargestoff for å visualisere injeksjonsstedet. DNA kan injiseres i begge laterale ventriklene som vist i illustrasjonen eller i tredje ventrikkel for å fylle laterale ventriklene. Etter injeksjon, er hjernene electroporated med en firkantet bølge electroporator, plassere den positive elektroden på ønsket side av hjernen. Hjerner er innebygd i 3% lavt smeltepunkt agarose og seksjoneres ved hjelp av en vibratome. 250 mikrometer hjernen skiver er plassert på 0,4 mikrometer innstikk og kultiveres opp til en uke. GFP kan observeres etter åtte timer etter transfeksjon.
Figur 2. Analyse av electroporated hjernen skiver. Electroporated hjernen skiver ble farget for Hoescht. Dorsal cortex viser electroporated nevrale stamceller ved ventrikulære sone (VZ). Nerveceller i Cortical plate (CP) er avgrenset av marginal sone (MZ). Hvite piler viser trekkende nerveceller. I dette tilfellet ble hjerner injisert ved E15.5 og electroporated med en pSilencer GFP kontroll vektor. Seksjonene representerer kortikale explants 4 dager etter electroporation. Scale bar 100 mikrometer.
Feilsøking:
- Lav transfeksjon effektivitet: Juster konsentrasjonen av DNA brukes til minst 1 mikrogram / mL. Bruk alltid veldig rent DNA fra en maxi prep om nødvendig bruk en endo-free Quiagen kit å rense DNA.
- Celler transfekterte i en annen hjerne område enn det som ønskelig: Sørg for at elektrodene er riktig plassert med den positive elektroden posisjon mot siden av hjernen som skal electroporated.
- Organotypic skiver miste morfologi: Endre media hver dag, og sikre at skivene ikke er flytende i media
- Slices falle av agarose som de blir kuttet i VIbratome: Sørg for at et godt grensesnitt er gjort ved innebygging hjernen i den lave smeltepunkt agarose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Disse metodene involverer ex vivo electroporation av plasmider som koder dobbel strandet RNA hårnåler 8 og kultur organotypic skiver 4 gir flere klare fordeler. Først disse metodene gir mulighet for en rask vurdering av RNAi-deriverte fenotyper. Inkludering av et uttrykk kassett koding GFP i samme pSilencer vektor som inneholder U6 arrangøren som driver den doble strandet RNA hårnål gir en rask identifisering og karakterisering av celler electroporated med RNAi vektor. I tillegg til tid-effektivitet, disse metodene er svært kostnadseffektivt i forhold til generasjonen av flere knockout linjer. Sekund, sammenlignet med overlevelse electroporation teknologi 12 som krever lengre opplæring og kompetanseutvikling for å sikre overlevelse av dyr og suksess av electroporation, metodene som beskrives her kan utføres med en kortere opplæringstid og dyktighet. In vivo overlevelse surgeries også roter seg av en baseline strykprosent som kan være assosiert med dyr (mor og valp) sykelighet. Disse dyrene vil ofte må vurderes av rimelig dyktige medarbeidere og / eller veterinærer fra dyret anlegget. Tredje, fordi de dyrkes i inntil 5 dager eller mer i vitro, de tillater oss å ta opp en rekke spørsmål knyttet til neuronal spredning, celle skjebne besluttsomhet, neuronal migrasjon og de tidlige stadier av neuronal modning (neurite utvekst). Fjerde, fordi vi jobber i kultur, er vi også i stand til å legge eksogene faktorer for å teste rolle vekstfaktorer og farmasøytiske agenter i de nevrologisk mekanismer beskrevet. Femte, er det electroporation tilnærmingen ex-vivo å foretrekke fremfor et gen pistol tilnærming fordi det tillater målretting av spesifikke områder av hjernen ved nettopp å orientere elektrodene. Til slutt, sammenlignet med viral transduksjon av organotypic skiver den electroporation tilnærmingen tillater en større transfection effektiviteten av primære celler.
Disse metodene har noen begrensninger. Med mindre stykket teknikken er modifisert til å tåle lengre kultur perioder, kan disse metodene ikke være ideelt å vurdere synaptogenesis eller utviklingsmessige hendelser som inntreffer senere. En ekstra begrensning kan være at reproduserbarheten av resultatene er svært avhengig av elektrodene skal plasseres. Noe praksis er nødvendig for å sikre electroporation av samme hjernen regionen som øker reproduserbarhet av resultater. Endelig er det vedlikehold av luft / væske-grensesnittet også avgjørende for å sikre sunne skiver. Som beskrevet ovenfor, forventer vi at disse ferdighetene kan lett kjøpt av Jove lesere, og at styrken i disse metodene i stor grad oppveie de begrensninger gitt et passende program. I sammendraget er virveldyr neurodevelopment kontrollert av et stort antall gener. Neuronal morphogenesis spesielt er et svært interessant og viktig tema. Denne tilnærmingen gjørfor en svært effektiv metode for screening gen-funksjon under neurodevelopment og kan tjene et meget bredt spekter av eksperimentelle formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Shirin Bonni for å gi pSil-GFP konstruere, Dr. Alper Uzun for illustrasjon av Figur 1, og den Leduc Bioimaging anlegget for konfokalmikroskopi. EMM støttes av Career Award for Medical Science fra Burroughs Wellcome Fund, et NARSAD Young Investigators Award, og NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01. SBL er støttet av NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01, og har fått støtte fra PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX Technologies | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX Technologies | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX Technologies | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | Leica Microsystems | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | Falcon BD | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | Falcon BD | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Low Melting Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma-Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma-Aldrich | H4034 |
References
- Angevine, J. B. Jr, Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
