Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

doi: 10.3791/3622 Published: February 7, 2012

Summary

הגישה לניתוח הגירה גורלו הסופי של העופות לפסגה תאים עצביים שליו, חומוס עוברים chimeric מתואר. שיטה זו היא טכניקה פשוטה וישירה לאיתור תאים עצביים לפסגה במהלך הגירה והבחנה שקשה אחרת להבחין בתוך העובר גוזל unmanipulated.

Abstract

עוברי העופות לספק פלטפורמה ייחודית לחקר תהליכים התפתחותיים רבים החוליות, בשל גישה קלה של עוברים בתוך הביצה. עוברי העופות chimeric, שבו הרקמה שליו התורם הושתלו העובר חומוס ב לג'ימי, לשלב את העוצמה של תיוג גנטי של אוכלוסיות תאים בל יימחה בקלות מניפולציה שהוצגו על ידי העובר העופות.

שליו, חומוס מפלצות הם כלי קלאסי עבור מעקב אחר תאים נודדים לפסגה עצביים (NCCs) 1-3. NCCs הם אוכלוסייה נודדות חולפות של התאים בעובר, אשר מקורם באזור הגבי של 4 בפיתוח בצינור העצבי. הם עוברים אפיתל המעבר mesenchymal ובהמשך נודדים לאזורים אחרים של העובר, שם הם להתמיין לסוגי תאים שונים, כולל 5-13 סחוס, מלנוציטים 11,14-20, הנוירונים גליה 21-32. NCCs הם multipotent, ואת גורלם האולטימטיבי שלהם משפיעיםenced לפי אזור 1) של הצינור העצבי שבו הם נובעים לאורך ציר rostro-הזנב של העובר 11,33-37, 2) לאותות ששיגרו התאים הסמוכים כשהם נודדים 38-44, ו - 3) microenvironment של האולטימטיבי שלהם היעד בתוך העובר 45,46. מעקב אחר התאים האלה מנקודת המוצא אל הצינור העצבי, למיקום הסופי וגורלו בתוך העובר, מספק תובנה חשובה לתוך התהליכים ההתפתחותיים המווסתים דפוסים ו organogenesis.

השתלת אזורים משלימים של הצינור העצבי התורם (homotopic השתלת) או באזורים שונים של הצינור העצבי התורם (heterotopic השתלת) יכול לגלות הבדלים במפרט מראש של NCCs לאורך ציר rostro-הזנב 2,47. טכניקה זו ניתן להתאים עוד יותר להשתיל תא החד צדדית של הצינור העצבי, כך שצד אחד נגזר רקמות התורם, ואת שרידי בצד הנגדי מוטרד בעובר המארח, ייelding הבקרה הפנימית בתוך מדגם זהה 2,47. זה גם יכול להיות מותאמים עבור השתלת קטעי מוח עוברי מאוחר יותר, לאחר HH10, כאשר בצינור העצבי הקדמי סגר 47.

כאן אנו מדווחים על טכניקות להפקת שליו, חומוס מפלצות באמצעות השתלת בצינור העצבי, אשר מאפשרים מעקב אחר NCCs נודדים שמקורם קטע נפרד של הצינור העצבי. מינים ספציפיים תיוג של התורם הנגזרות תאים עם נוגדן ספציפי QCPN שליו 48-56 מאפשרת לחוקר להבחין התורם תאים המארחות בנקודת סיום הניסוי. טכניקה זו היא פשוטה, זולה, ויש לה יישומים רבים, כולל מיפוי, גורל, השושלת תא מעקב, זיהוי דפוסים מראש אירועים לאורך ציר הזנב rostro-45. בגלל הקלות של גישה העובר העופות, הטכניקה שליו, חומוס שתל עשוי להיות משולב עם מניפולציות אחרות, כולל אך לא רק, אבלציה העדשה 40, הזרקה של מולקולות מעכבות 57,58 או מניפולציה גנטית דרך electroporation של פלסמידים הביטוי 59-61, כדי לזהות את התגובה של זרמים נודדות מיוחדות של NCCs על הפרעות בתוכנית ההתפתחות של העובר. יתר על כן, שיטה זו השתלת יכול לשמש גם כדי לייצר אחרים עוברים interspecific chimeric כמו שליו, ברווז מפלצות ללמוד תרומה NCC כדי המורפוגנזה Craniofacial או עכבר חומוס מפלצות לשלב את כוחה של הגנטיקה העכבר בקלות מניפולציה של העובר העופות . 62

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. דגירה אפרוח וביצים שליו לשלב הרצוי

עבור HH9 עוברים, זמני דגירה טיפוסי נע בין 29-33 שעות ב 38 ° C. 63

  1. לשטוף את כל הפסולת מן הביצים עם מים פושרים.
  2. סדר ביצי תרנגולות על מגש אופקי. סמן את הצד כלפי מעלה בעיפרון, זה יתאים לאזור שבו העובר יהיה מקומי. דגירה שליו סוף ביצים בוטה למעלה.
  3. מקום 38 ° C חממה humidified. הפעל את הפונקציה מתנדנד.

2. להכין ביצים חלונאות ו לנתיחה

  1. הסר ביצים מ חממה, ואת לעקר ראשי עם אתנול 70%. מומלץ לרסס על אתנול ולנגב אותו במהירות עם מגבת נייר או Kimwipe כדי למנוע ספיגת אתנול דרך קליפת הביצה.
  2. עוף במקום ביצה על בעל ביצה הפרט (אנו משתמשים בצלחת פטרי מרופדת במגבות נייר מקופלות, למשל, "Kimwipes"). באמצעות מלקחיים AA, הקש חול קטןדואר אל פני השטח העליון של קליפת בסוף המחודד של הביצה.
  3. הסר 1.5-3mL אור אלבומין מן הביצה עוף עם מחט המזרק 18 ½ G ו 5 מ"ל במזרק. עדיף להכניס את המחט בצורה אנכית לתוך החור, עם שפוע מול סוף המחודד של הביצה (איור 2 א). בדרך זו, כאשר אלבומין יבוטל, יש סיכון קטן של פגיעה בטעות חלמון באמצעות שאיבה. מחק אלבומין. פעולה זו תפחית את החלמון ואת העובר בתוך הביצה, כדי לאפשר לחלון להיפתח קליפת הביצה.
  4. נגב את החור עם אתנול 70% כאמור לעיל ואת החותם אותו עם נייר דבק. חשוב קליפת הביצה המקיף את החור הוא נטול לחלוטין של אלבומין יבש או דבק לא לאטום.
  5. עם מלקחיים AA, הקש על עוד חור לתוך השטח העליון ניכרת של ביצה האופקי, לא בדיוק בשיא. יש להיזהר לא לתת את מלקחיים להגזים דרך קליפת הביצה כדי למנוע נזק חלמון או העובר.
  6. בתוךבהלבשה צד אחד של מלקחיים מעוקלים איריס לתוך במקביל חור להפגיז את הביצים. צובט על הקליפה, עבודה בתנועה סיבובית כדי לשבור כמה ~ 2 ס"מ בחלון בקוטר של פגז ביצים עוף. מחק את קליפת הביצה להסירו. לחלופין, מכסים את פני השטח העליון של הביצה עם האריזה קלטת ולהשתמש זוג מספריים כדי לגזור את החלון. זו מקטינה את הסיכוי של פסולת קליפת הביצה ליפול. העובר אמור להופיע כדיסק אטום על גבי החלמון. לבטל את כל הביצים מופרות (מזוהה על ידי כתם לבן קטן על פני השטח של חלמון, או אי קיומו של blastoderm).
  7. מזריקים כמות קטנה של הודו דיו (דילול 1:10 בתמיסת רינגר של סטרילית המכילה "פן / סטרפטוקוקוס" אנטיביוטיקה: הריכוז הסופי 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 100 מיקרוגרם פניצילין / סטרפטומיצין מ"ל) מתחת blastoderm לסייע בבימוי העובר. השתמש במזרק 1 מ"ל ו 26 וחצי מחט המזרק G, התכופף לתוך זווית ° 45 בבסיס המחט, עם שיפוע כלפי מעלה, לחילופין, אחד מאy להשתמש משך זכוכית pipet פסטר pipetting הפה המנגנון (משקפי מגן בעת ​​כיפוף מחט המזרק או שבירת מחט זכוכית). לנקב את קרום החלמון מחוץ למתחם של blastoderm והחלק את קצה המחט מתחת העובר, קרוב לפני השטח של חלמון אך לא את השכבות עובריים (איור 2 ב). להזריק רק דיו דיו כדי לשרטט את העובר, ולאחר מכן לסגת בזהירות את המחט (איור 2 ג). הזרקת דיו יותר מדי יכול לגרום למוות העובר. חשוב לא להכניס שום בועות אוויר מתחת העובר, כמו זה יכול להיות מקור הזיהום. הערה: כל פתרון של רינגר להשתמש בהליך זה היא עיקור ומכיל פן / דלקת כמוגדר לעיל. פוספט סטרילית בופר סליין (PBS) גם חלופה מקובלת על פתרון של הצלצול בכל השלבים של פרוטוקול זה.
  8. שלב העובר על פי המבורגר המילטון 63 ולהקליט את הבמה על קליפת הביצה בדיו קבע או עיפרון. בשלבים מוערכים ביותר תחת stereomicroscopy, עם סיבים אופטיים "מתכווננת" מקורות אור בהם יש עומס חום מוגבלת.
  9. החל 2-3 טיפות פתרון רינגר סטרילית של חם על פני השטח של העובר כדי למנוע התייבשות וזיהום. באופן זמני לאטום את החלון עם parafilm נמתח על פני הביצה.
  10. חזור על שלבים 2.2-2.9 עם כל הביצים חומוס לפני תחילת הניסויים השתלות.
  11. מאז עוברים שליו משמשים רק רקמות התורם, בצעדים לג'ימי 2.2-2.9 יכול להשמיט. להכנת לג'ימי לשעבר של עוברים התורמות, ביצי שליו מודגרת בצד בוטה ופתחתי באזור זה עם מלקחיים מעוקלים כדי לחשוף את העובר. באמצעות מספריים המבתרים, לעשות ארבעה חתכים בצורת ריבוע דרך הממברנה vitelline ו blastoderm מחוץ לעובר (לוודא כי כל קיצוץ לפגוש). באמצעות מלקחיים מעוקלים איריס, בעדינות לתפוס קצה אחד לחתוך ולהרים את העובר מן הביצה ולהעביר אותו לפתרון אצבעות בצלחת פטרי. לחלופין, ניתן להשתמש עקומתד איריס מלקחיים להרים את העובר נכרת מתחת, או כף העובר או פיפטה העברת פלסטיק לחתוך את החלק הרחב של הגליל, ניתן להשתמש כדי להעביר את העובר מתוך הביצה. הוצא בעדינות את הממברנה vitelline עם # 5 מלקחיים. לאסוף את עוברי שליו הנותרים לעיל, ושלב אותם תחת מיקרוסקופ לנתח.

3. מכינים את העובר המארח לקבל שוחד

  1. הסר parafilm מן המארח (חומוס) העובר באמצעות מחט טונגסטן חידד או # 5 מלקחיים, לקרוע חור קטן בקרום vitelline על האזור הרצוי של הצינור העצבי (איור 3 א).
  2. הוסף טיפה של תמיסת רינגר לעובר. לדאוג לשמור את העובר שקוע לחלוטין בפתרון של רינגר במהלך ההליך כולו על מנת למנוע התייבשות של הרקמה. המשך להוסיף טיפות של תמיסת רינגר אל פני השטח של העובר באמצעות פיפטה העברת במידת הצורך.
  3. באמצעות מחט זכוכית משך בזהירות את מקורי ו CAחתכים רוחביים udal המתאימים לאורך והאזור עניין הצינור העצבי הגבי. (מחטים זכוכית משכתי נוצרות מתוך צינורות סיליקון נימי זכוכית אשר היו משך תחת חום עם מחט משיכת המנגנון.) עבור שתלי חד צדדיים החתכים צריך רק להרחיב את לומן של הצינור העצבי הגבי, ועל שתלי בין שתי המדינות, לקבל את פני חתכים הצינור העצבי כל הגב. ואז לחתוך בילטרלי בין הצינור העצבי הגבי ו והמזודרם הפרקסיאלית.
  4. בזהירות להפריד explant נכרת מן הצינור העצבי ואז להסיר אותו מעובר על ידי aspirating אל micropipette זכוכית (איור 3 ב).

4. מכינים את רקמת שתל מתורם

  1. בחר בשלב בהתאמה העובר שליו. להחזיק את העובר למטה עם מלקחיים AA, להסיר את הקרום vitelline, והבלו לאזור דומה בגודל של הצינור העצבי כמתואר לעיל (3.3-3.4) (איור 3A'-B "). בהתאם לצרכים של הניסוי, האזור הזה יכול להיותהאזור המשלים של צינור המארח (חומוס) עצבית או מאזור אחר לאורך ציר rostro-הזנב. (הערה: על שתלי אזוריים גדולים יותר, לרבות מלאים שתלי בצינור העצבי, החוקרים מומלץ להוסיף העיכול פרוטאז בשלב זה להסיר את כל רקמת mesenchymal חסיד של רקמות התורם לפני השתלה עם זאת, עבור הגב שתלי קטנים בצינור העצבי בשלבים המוקדמים. כפי המפורט כאן, העיכול פרוטאז אין צורך בצינור העצבי כמו מופרד בקלות על ידי טכניקות כירורגיות בלבד מ mesenchyme הסמוך.)

5. השתלת רקמות

  1. Aspirate explant התורם אל micropipette כוס המכילה בתמיסת רינגר. להיזהר לא להציג את כל בועות לתוך פיפטה.
  2. העברת explant סמוך לאזור נכרת של המארח חומוס. באמצעות מחט זכוכית משך, המזרח explant בעדינות להדריך אותה באזור ablated (איור 3 ג).
  3. בזהירות להוסיף כמה טיפות של תמיסת רינגרלעובר על מנת למנוע התייבשות. תשמרי על עצמך כדי למנוע נשירה נוזלי ישירות באתר שתל מכיוון שהדבר עלול לעקור את השתל.
  4. לאטום את החלון עם האריזה קלטת. ודא כי הקלטת חותמות האזור כולו ביצה חלונות. פעולה זו מונעת התייבשות וזיהום של העובר במהלך הדגירה לאחר מכן.
  5. להחזיר את הביצה החממה עד לשלב הרצוי. ודא כי פונקציית "נדנדה" כבוי בזמן דוגרים על מפלצות. ביצים ניתן פנה בעדינות ביד פעמיים ביום כמו זה עשוי להגביר את יכולת הקיום שלהם אם בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות ממוקדות.

6. הכן עוברים chimeric עבור חתך

  1. על קצה ניסיוני, לחתוך את הסרט מכסה את החלון בעזרת מספריים עדינים.
  2. לתפוס את הקצה של blastoderm עם מעוקל איריס מלקחיים (הקלה ביותר לעשות עם משוננת טיפים), ואז לחתוך את העובר מן החלמון עם 4 חתכים גדולים מחוץ לגבולות blastoderm. העברת העובר לצלחת פטרי המכילה בתמיסת רינגר. תשמרי על עצמך כדי לצמצם את החשיפה של העובר לאוויר על מנת למנוע התייבשות של הרקמה.
  3. תחת stereomicroscopy, להפריד בעדינות את הממברנה vitelline מ blastoderm באמצעות מספר 5 מלקחיים.
  4. בזהירות להסדיר את העובר בצלחת, כך העובר הוא בכיוון זהה כפי שהיה ביצה, עם קרום מסביב פרושות.
  5. השתמש לנתח מחטים העשויים טונגסטן 64 חוטים כדי להסיר בצורה נקייה blastoderm סביב מעובר על ידי סידור מחט בגבול העובר ורקמות extraembryonic, עם אורך של תיל טונגסטן במקביל לחלק התחתון של המנה. שימוש בתנועה ניסור עדין לחתוך את הרקמות.
  6. מוציאים בזהירות את amnion עם # 5 מלקחיים. בשלב זה ייתכן, אם רוצים לנתח עוד את האזור של עניין, או לעזוב את כל העובר.
  7. מעבירים את העובר כדי paraf קרח קר 4%ormaldehyde ורוק לילה ב 4 ° C.
  8. הכינו דגימות ולהטביע על חתך cryo-או פרפין.

עקוב אחר רקמות מורכבים בתוך העובר המארח. קיימות מספר טכניקות לזיהוי רקמות שליו בתוך העובר חומוס, כולל זיהוי של שליו nucleoli ידי מכתים hematoxylin (גרעינים שליו יש גדולים מאוד, תכלילים צביעה כהה יותר גרעינים חומוס), התגובה Feulgen-Rossenbeck, acridine כתום או biz-benzamide כתם בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים, או immunolabeling עבור שליו אנטיגנים ספציפיים 3,47,65,66. כאן אנו משתמשים אנטיגן QCPN ו-mount סטנדרטי כולו או בסעיף טכניקות immunofluorescence לזהות תאים עצביים לפסגה שליו שליו ב-חומוס מפלצות (איור 4). טכניקה זו מספקת גמישות מרבית בתכנון הניסוי, כפי immunofluorescence QCPN ניתן גם בשילוב עם נוגדנים אחרים כדי לזהות תאים הבדיל הנגזרות רקמות התורם (שליו). השתמש standaדרך הר שלם או immunofluorescence טכניקות סעיף לתייג שליו הנגזרות תאים מפלצות.

7. נציג תוצאות

תמונה מייצגת של האזור מורכבים של הצינור העצבי לאחר 6 שעות של דגירה מחדש (כדי HH11) מציגה שילוב צפוי של רקמות התורם מורכבים (שליו) לתוך שורה (חומוס) בצינור העצבי (תרשים 4 א). עוברים מראה אינטגרציה מושלמת של השתל, או התפתחות אסימטרית של האזור או somites גולגולתי לאחר reincubation אמור להיות מושלך.

לחצות קטע דרך האזור מורכבים על HH11 NCCs מופע שכותרתו עם HNK-1 נודדות רוחבית מן הצינור העצבי. תאים שליו התורמים זרם NCC הנדידה, וכן הצינור העצבי, מסומנים בבירור עם QCPN (איור 4B).

בשלבים מאוחרים יותר, שליו NCC שמקורם בתאי ניתן לייחס את רקמת היעד הסופי. תאים QCPN שכותרתו משובצים בתוך mesenchyme העובר גוזלתהליך לסתי ב E5 (איור 4C).

נוגדנים QCPN ניתן לשלב בקלות עם נוגדנים אחרים לבחון את הבידול של שליו הנגזרות NCCs בסביבה המארח. שליו NCC הנגזרות עצב סנסורי trigeminal מסומנים על ידי QCPN ו Tuj1 נוגדנים (איור 4D).

איור 1
באיור 1. סקירה כללית של הליך ניסיוני ומכשירים הנדרשים. Host) (חומוס) ו התורמות (שליו) עוברים צריך להיות השלב בהתאמה. לתייג את הזרם NCC התורם גנגליון trigeminal maxillo ו-mandibular באזור, HH9 הוא אידיאלי. ב HH9, בצינור העצבי מתחיל לסגור באזור מקורי, אבל עדיין לא אטום לחלוטין. קו אפור דיאגרמות מייצג את קו האמצע של הצינור העצבי הסגירה. הקווים הלבנים המנוקדים להצביע על קווי לחתוך עבור גוזמות באזור המוח התיכון של הצד הימני של הצינור העצבי מן המארח תורם להםbryos. האזור נכרת העובר המארח נמחק ואת רקמות התורם מושתלים כדי ליצור את העובר chimeric. ב) הכלים הדרושים, כולל: מזרק) 5 מ"ל עם 18 ½ מחט G המזרק, ב) 1 מזרק מ"ל עם 26 ½ מחט G המזרק כפופות ב 45 דיו ° בהודו זווית, ג), ד ') קלטת האריזה ברור, ה) פיפטה זכוכית בפה pipetting המנגנון, ו) 60 מ"מ-פטרי צלחת, ז) AA מלקחיים, ח) מעוגלים עם מלקחיים איריס משוננת טיפים i) # 5 מלקחיים, מספריים י) בסדר, יא) חידד תיל טונגסטן, ל ') הוציא מחט זכוכית, מ') parafilm ריבועים.

איור 2
איור 2. הכנת ביצים ועוברים.) חתך דיאגרמה של הביצה, כולל נקודת הכניסה האידיאלית של 18 ½ מחט המזרק G לנסיגה של אור אלבומין. ב) לאחר נסיגה ~ 3mL של אלבומין אור, החלמון ואת העובר בתוך הביצה מוריד, ומאפשר לחוקרים לחתוך "חלון" (חיצים) ב tהוא קליפת לגשת העובר. דיו בהודו, 1:10 מדולל בתמיסה סטרילית של רינגר, אז יכול להיות מוזרק מתחת blastoderm לספק לעומת זאת על הבימוי קל של העוברים. ג) צ'יק העובר לאחר דיות.

איור 3
איור 3. סכמטי ודוגמאות של hh 9 עוברים שלב התורם המארח בכל שלב של הליך השתלת. העובר) אפרוח המארח. קווים מקווקווים מציינים היכן בדיאגרמה קרום vitelline יש נקרע לגשת לאזור הגולגולת של השתלת. נקרע פעם דש משולש של קרום vitelline יש קלופים caudally. תיבת בתמונה מצביע על השיבוץ נעשה שימוש (לפני הספירה). ') העובר שליו התורם. התמונה היא של עובר התורם נכרת מן הביצה והניח לתוך צלחת פטרי לנתיחה של רקמת השתל. תיבת בתמונה מצביע על השיבוץ נעשה שימוש (ב '). קווים מקווקווים ב תרשים סכמטי (א ') מציינים היכן vitelline וקרומים חלמון יש לחתוך על מנת להסיר tהוא עובר מן הביצה. ב) מארח עובר באזור עם המוח התיכון חד צדדי של הצינור העצבי נכרת (חיצים לבנים) מחכה השתל. הקו המקווקו בדיאגרמה סכמטית מציין היכן קיצוצים צריך להיעשות כדי צינור בלו עצבית באזור המוח התיכון. ) ב 'העובר התורם עם הגב רקמות בצינור העצבי שתל נכרת (רקמת השתל מצוין באמצעות ראשי חץ שחור). קו מקווקו בתרשים מציין היכן הקיצוצים צריכים להיעשות העובר שליו לרקמות התורם הבלו על השתלת חד צדדית של אזור המוח התיכון של הצינור העצבי. ג) העובר chimeric לאחר השתלת explant של הצינור העצבי הגבי שליו לאזור המוח התיכון בחורה.

איור 4
באיור 4. Immunofluorescence שליו גילוי ספציפי QCPN אנטיגן הגרעיני תורם הנגזרות התאים בעובר chimeric.) כולו הר דמותו של HH11 כימרה (מורכבים על HH9) מראה מכתים QCPN באדום, ואת HNK-1 מכתים (סמן של נודדות NCCs) בתוךירוק. הגדלה 10x, נוף הגב. ב) חתך רוחב של העובר (א '), מראה QCPN חיובי שליו תאים שמקורם בצינור העצבי ואת NCC הנדידה שיתוף מוכתם HNK-1 (בירוק). בהגדלה 40X. ג) חתך בתהליך לסתי של E5 כימרה (מודגרות עבור השתל 3 ימים הודעה), מראה QCPN חיובי NCC שמקורם בתאים (אדום) אשר היגרו מאזור מורכבים של הצינור העצבי למיקום הסופי של העובר. בהגדלה 10X. ד) סעיף באמצעות תרומה E5 מראה כימרה של שליו נגזר NCC כדי גנגליון trigeminal (אדום) והבחנה אל TuJ1 חיובי נוירונים (ירוק). בהגדלה 40X. * NCCs: MP, תהליך לסתי, NT, בצינור העצבי, גנגליון TG, trigeminal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השתלת של הצינור העצבי שליו לעוברי חומוס המארחות המתוארת כאן היא טכניקה פשוטה וזולה לאיתור subpopulations ספציפיות של העברת NCCs שמקורם באזורים שונים לאורך ציר הזנב rostro-21,67-69. שיטה זו מנצלת את הקלות של גישה עוברי העופות (לעומת עוברי יונקים) ו ניתן בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון אבלציה רקמות, הזרקה של מולקולות מעכבות או מניפולציה גנטית דרך electroporation של פלסמידים הביטוי, כדי לבדוק באופן ניסויי התגובה של אוכלוסיות מסוימות נודדות NCC לאותות התפתחותיים שונים בתוך עוברים 47,69.

שליו, חומוס מפלצות הן כלי רב עוצמה לבדיקת הגירה NCC והתמיינות, ואת הטכניקה הזאת יכולה להיות מותאם כוללים השתלה של רקמות אחרות מלבד הצינור העצבי. השתלת רקמת שליו לעובר האפרוח הוא ומבוססת techniquדואר 13,21,70-76, אבל נלמד הטובה ביותר על ידי הפגנה ויזואלית, כמו microdissection של אזורים קטנים של צינורות עצביים דורשת מוטוריקה עדינה מאוד.

מכיוון שליו שמקורם בתאי ניתן להבחין בקלות באמצעות immunostaining עם QCPN שליו ספציפית נוגדנים מתאי חומוס המארחות, את הפוטנציאל ההתפתחותי של NCCs הנובעות אזורים ספציפיים של הצינור העצבי ניתן להסיק בידול של התורם (שליו) תאים על הניסוי נקודת הסיום, למשל, נוכחות של תאים החיוביים QCPN באזור הקרנית periocular, ואחרי השתלת בצינור העצבי לאזור שליו המוח התיכון של עוברים חומוס ב HH9 עולה כי הרכס העצבי נודדים מאזור זה להצמיח האנדותל הקרנית stroma 77. שתלי בצינור העצבי בכל HH9-10 עולה התרומה NCC כדי גנגליון trigeminal וקשתות branchial. כמו כן, שליו הנגזרות עצב סנסורי ניתן לעקוב באמצעות אחר, שליו נוירון מסוים (qn) נוגדנים 78,79.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים אנשי המעבדה Lwigale לביקורת של כתב היד. SLG נתמך על ידי ל 'רות Kirschstein NRSA אחוות מן הלאומי Eye Institute (F32 EY02167301). PYL נתמך על ידי National Eye Institute (EY018050).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chick eggs Various
Quail eggs Various
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC) Poultry Supply 1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated Fine Science Tools 11210-10
Scotch tape Any Supplier
Curved Iris forceps Fine Science Tools 11065-07
India ink Any Supplier
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution VWR international 101447-068
Clear Packing tape Any Supplier
Needle pulling apparatus Narishige International PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube Kimble Chase 34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette) Sigma-Aldrich A5177-52A
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter VWR international AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder) Fine Science Tools 26018-17
QCPN antiserum Developmental Studies Hybridoma Bank QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1) Invitrogen A21125
Ringer’s Solution (2L):
  • 14.4g NaCl
  • 0.34g CaCl2
  • 0.74g KCl
  • 0.230g Na2HPO4
  • 0.04g KH2PO4
  • ddH2O to 2L
  • Filter and autoclave
Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-79-4
  • 7778-77-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Douarin, G., Renaud, D. Morphologic and physiologic study of the differentiation in vitro of quail embryo precardial mesoderm. Bull. Biol. Fr. Belg. 103, (3), 453-468 (1969).
  2. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods. Mol. Biol. 461, 337-350 (2008).
  3. Le Douarin, N. A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology. Dev. Biol. 30, (1), 217-222 (1973).
  4. Noden, D. M. An analysis of migratory behavior of avian cephalic neural crest cells. Dev. Biol. 42, (1), 106-130 (1975).
  5. Johnston, M. C. A radioautographic study of the migration and fate of cranial neural crest cells in the chick embryo. Anat. Rec. 156, (2), 143-155 (1966).
  6. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. I. Skeletal and connective tissues. Dev. Biol. 67, (2), 296-312 (1978).
  7. Oka, K. The role of TGF-beta signaling in regulating chondrogenesis and osteogenesis during mandibular development. Dev. Biol. 303, (1), 391-404 (2007).
  8. Chai, Y. Fate of the mammalian cranial neural crest during tooth and mandibular morphogenesis. Development. 127, (8), 1671-1679 (2000).
  9. Lengele, B., Schowing, J., Dhem, A. Embryonic origin and fate of chondroid tissue and secondary cartilages in the avian skull. Anat. Rec. 246, (3), 377-393 (1996).
  10. Le Douarin, N. M., Ziller, C., Couly, G. F. Patterning of neural crest derivatives in the avian embryo: in vivo and in vitro studies. Dev. Biol. 159, (1), 24-49 (1993).
  11. Lallier, T. E. Cell lineage and cell migration in the neural crest. Ann. N.Y. Acad. Sci. 615, 158-171 (1991).
  12. Nakamura, H. Mesenchymal derivatives from the neural crest. Arch. Histol. Jpn. 45, (2), 127-138 (1982).
  13. Le Lievre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 34, (1), 125-154 (1975).
  14. Rawles, M. E. The Development of Melanophores from Embryonic Mouse Tissues Grown in the Coelom of Chick Embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26, (12), 673-680 (1940).
  15. Rawles, M. E. The Pigment-Forming Potency of Early Chick Blastoderms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26, (1), 86-94 (1940).
  16. Mosher, J. T. Intrinsic differences among spatially distinct neural crest stem cells in terms of migratory properties, fate determination, and ability to colonize the enteric nervous system. Dev. Biol. 303, (1), 1-15 (2007).
  17. Dupin, E., Le Douarin, N. M. Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene. 22, (20), 3016-3023 (2003).
  18. Faraco, C. D., Vaz, S. A., Pastor, M. V., Erickson, C. A. Hyperpigmentation in the Silkie fowl correlates with abnormal migration of fate-restricted melanoblasts and loss of environmental barrier molecules. Dev. Dyn. 220, (3), 212-225 (2001).
  19. Selleck, M. A., Bronner-Fraser, M. Avian neural crest cell fate decisions: a diffusible signal mediates induction of neural crest by the ectoderm. Int. J. Dev. Neurosci. 18, (7), 621-627 (2000).
  20. Stocker, K. M., Sherman, L., Rees, S., Ciment, G. Basic FGF and TGF-beta 1 influence commitment to melanogenesis in neural crest-derived cells of avian embryos. Development. 111, (2), 635-645 (1991).
  21. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Experimental analysis of the migration and differentiation of neuroblasts of the autonomic nervous system and of neurectodermal mesenchymal derivatives, using a biological cell marking technique. Dev. Biol. 41, (1), 162-184 (1974).
  22. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. II. Neural tissues. Dev. Biol. 67, (2), 313-329 (1978).
  23. Barraud, P. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (49), 21040-21045 (2010).
  24. Li, H. Y., Say, E. H., Zhou, X. F. Isolation and characterization of neural crest progenitors from adult dorsal root ganglia. Stem Cells. 25, (8), 2053-2065 (2007).
  25. Carney, T. J. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133, (23), 4619-4630 (2006).
  26. Maro, G. S. Neural crest boundary cap cells constitute a source of neuronal and glial cells of the PNS. Nat. Neurosci. 7, (9), 930-938 (2004).
  27. Bronner-Fraser, M. Molecular analysis of neural crest formation. J. Physiol. Paris. 96, (1-2), 3-8 (2002).
  28. Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Development. 128, (20), 3949-3961 (2001).
  29. Britsch, S. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15, (1), 66-78 (2001).
  30. Bronner-Fraser, M. Origin of the avian neural crest. Stem Cells. 13, (6), 640-646 (1995).
  31. Jessen, K. R., Mirsky, R. Neural development. Fate diverted. Curr. Biol. 4, (9), 824-827 (1994).
  32. Le Douarin, N., Dulac, C., Dupin, E., Cameron-Curry, P. Glial cell lineages in the neural crest. Glia. 4, (2), 175-184 (1991).
  33. Chan, W. Y., Cheung, C. S., Yung, K. M., Copp, A. J. Cardiac neural crest of the mouse embryo: axial level of origin, migratory pathway and cell autonomy of the splotch (Sp2H) mutant effect. Development. 131, (14), 3367-3379 (2004).
  34. Bronner-Fraser, M. Segregation of cell lineage in the neural crest. Curr. Opin. Genet. Dev. 3, (4), 641-647 (1993).
  35. Peters-vander Sanden, M. J., Luider, T. M., vander Kamp, A. W., Tibboel, D., Meijers, C. Regional differences between various axial segments of the avian neural crest regarding the formation of enteric ganglia. Differentiation. 53, (1), 17-24 (1993).
  36. Kuratani, S., Bockman, D. E. Capacity of neural crest cells from various axial levels to participate in thymic development. Cell Tissue Res. 263, (1), 99-105 (1991).
  37. Leblanc, G. G., Epstein, M. L., Bronner-Fraser, M. E. Differential development of cholinergic neurons from cranial and trunk neural crest cells in vitro. 137, (2), 318-330 (1990).
  38. Golding, J. P., Trainor, P., Krumlauf, R., Gassmann, M. Defects in pathfinding by cranial neural crest cells in mice lacking the neuregulin receptor ErbB4. Nat. Cell. Biol. 2, (2), 103-109 (2000).
  39. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R. Cranial neural crest migration: new rules for an old road. Dev. Biol. 344, (2), 543-554 (2009).
  40. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Semaphorin3A/neuropilin-1 signaling acts as a molecular switch regulating neural crest migration during cornea development. Dev. Biol. 336, (2), 257-265 (2009).
  41. Killian, O. lesnicky, Birkholz, E. C., A, D., Artinger, K. B. A role for chemokine signaling in neural crest cell migration and craniofacial. Dev. Biol. 333, (1), 161-172 (2009).
  42. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67, (1), 47-56 (2007).
  43. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the chick. Dev. Dyn. 232, (4), 939-949 (2005).
  44. Kanzler, B., Foreman, R. K., Labosky, P. A., Mallo, M. BMP signaling is essential for development of skeletogenic and neurogenic cranial neural crest. Development. 127, (5), 1095-1104 (2000).
  45. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51, (3), 145-165 (2009).
  46. Goldstein, A. M., Nagy, N. A bird's eye view of enteric nervous system development: lessons from the avian embryo. Pediatr. Res. 64, (4), 326-333 (2008).
  47. Le Douarin, N., Dieterlen-Lievre, F., Creuzet, S., Teillet, M. A. Quail-chick transplantations. Methods Cell. Biol. 87, 19-58 (2008).
  48. Wingate, R. J., Lumsden, A. Persistence of rhombomeric organisation in the postsegmental hindbrain. Development. 122, (7), 2143-2152 (1996).
  49. Karagenc, L., Sandikci, M. Tissue distribution of cells derived from the area opaca in heterospecific quail-chick blastodermal chimeras. J. Anat. 216, (1), 16-22 (2010).
  50. Teague, W. J., Jayanthi, N. V., Lear, P. V., Johnson, P. R. Foregut mesenchyme contributes cells to pancreatic acini during embryonic development in a chick-quail chimera model. Pediatr. Surg. Int. 21, (3), 138-142 (2005).
  51. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131, (16), 3967-3980 (2004).
  52. He, L. Three different fates of cells migrating from somites into the limb bud. Anat. Embryol. (Berl). 207, (1), 29-34 (2003).
  53. Huang, R., Zhi, Q., Christ, B. The relationship between limb muscle and endothelial cells migrating from single somite. Anat. Embryol. (Berl). 206, (4), 283-289 (2003).
  54. Hidalgo-Sanchez, M., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. Fgf8 and Gbx2 induction concomitant with Otx2 repression is correlated with midbrain-hindbrain fate of caudal prosencephalon. Development. 126, (14), 3191-3203 (1999).
  55. Verberne, M. E., Gittenberger-de Groot, A. C., Poelmann, R. E. Lineage and development of the parasympathetic nervous system of the embryonic chick heart. Anat. Embryol. (Berl). 198, (3), 171-184 (1998).
  56. Burns, A. J., Douarin, N. M. The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system. Development. 125, (21), 4335-4347 (1998).
  57. Debby-Brafman, A., Burstyn-Cohen, T., Klar, A., Kalcheim, C. F-Spondin, expressed in somite regions avoided by neural crest cells, mediates inhibition of distinct somite domains to neural crest migration. Neuron. 22, (3), 475-488 (1999).
  58. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Dev. Biol. 306, (2), 750-759 (2007).
  59. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, (1), 43-48 (2001).
  60. Chen, Y. X., Krull, C. E., Reneker, L. W. Targeted gene expression in the chicken eye by in ovo electroporation. Mol. Vis. 10, 874-883 (2004).
  61. Sato, F., Nakagawa, T., Ito, M., Kitagawa, Y., Hattori, M. A. Application of RNA interference to chicken embryos using small interfering RNA. J. Exp. Zool. A. Comp. Exp. Biol. 301, (10), 820-827 (2004).
  62. Lwigale, P. Y., Schneider, R. A. Other chimeras: quail-duck and mouse-chick. Methods Cell. Biol. 87, 59-74 (2008).
  63. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn. 195, (4), 231-272 (1992).
  64. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32, (1), 143-144 (1965).
  65. Le Douarin, N. M. A Feulgen-positive nucleolus. Exp. Cell. Res. 77, (1), 459-468 (1973).
  66. Feulgen, R., Rossenbeck, H. Mikroskopisch-chemischer Nachweis einer Nucleinsaure vom typus der Thymonucleinsiiure und die darauf beruhende elektive Faibung von Zellkemen in mikroskopischen Praparaten. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 135, 203-252 (1924).
  67. Lwigale, P. Y., Conrad, G. W., Bronner-Fraser, M. Graded potential of neural crest to form cornea, sensory neurons and cartilage along the rostrocaudal axis. Development. 131, (9), 1979-1991 (2004).
  68. Weston, J. A. A radioautographic analysis of the migration and localization of trunk neural crest cells in the chick. Dev. Biol. 6, 279-310 (1963).
  69. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. 2nd Ed, Cambridge University Press. (2009).
  70. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 30, (1), 31-48 (1973).
  71. Douarin, N. M. L. e, Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, (1), 17-40 (1975).
  72. Le Douarin, N. M., Renaud, D., Teillet, M. A., Le Douarin, G. H. Cholinergic differentiation of presumptive adrenergic neuroblasts in interspecific chimeras after heterotopic transplantations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, (2), 728-732 (1975).
  73. Houssaint, E., Belo, M., Le Douarin, N. M. Investigations on cell lineage and tissue interactions in the developing bursa of Fabricius through interspecific chimeras. Dev. Biol. 53, (2), 250-264 (1976).
  74. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V., Houssaint, E., Belo, M. Ontogeny of the avian thymus and bursa of Fabricius studied in interspecific chimeras. Ann. Immunol. (Paris). 127, (6), 849-856 (1976).
  75. Fontaine, J., Le Douarin, N. M. Analysis of endoderm formation in the avian blastoderm by the use of quail-chick chimaeras. The problem of the neurectodermal origin of the cells of the APUD series. J. Embryol. Exp. Morphol. 41, 209-222 (1977).
  76. Narayanan, C. H., Narayanan, Y. On the origin of the ciliary ganglion in birds studied by the method of interspecific transplantation of embryonic brain regions between quail and chick. J. Embryol. Exp. Morphol. 47, 137-148 (1978).
  77. Lwigale, P. Y., Cressy, P. A., Bronner-Fraser, M. Corneal keratocytes retain neural crest progenitor cell properties. Dev. Biol. 288, (1), 284-293 (2005).
  78. Lwigale, P. Y. Embryonic origin of avian corneal sensory nerves. Dev. Biol. 239, (2), 323-337 (2001).
  79. Tanaka, H., Kinutani, M., Agata, A., Takashima, Y., Obata, K. Pathfinding during spinal tract formation in the chick-quail chimera analysed by species-specific monoclonal antibodies. Development. 110, (2), 565-571 (1990).
ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griswold, S. L., Lwigale, P. Y. Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation. J. Vis. Exp. (60), e3622, doi:10.3791/3622 (2012).More

Griswold, S. L., Lwigale, P. Y. Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation. J. Vis. Exp. (60), e3622, doi:10.3791/3622 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter