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Neuroscience

크로스 종 이식에 의한 신경 크레스트 마이 그 레이션과 차별화 분석

Published: February 07, 2012
doi:
10.3791/3622
,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,Rice University

Summary

메추라기 – 병아리 키메라 배아에서 조류 신경 능선 세포의 마이 그 레이션 및 최종 운명을 분석을위한 접근 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 unmanipulated 여자의 배아 내에 구별하기 어렵습니다 별도로 마이 그 레이션과 차별화하는 동안 신경 능선 세포를 추적하는 단순하고 간단 기법입니다.

Abstract

조류 배아는 난자 내에서 배아의 쉬운 접근으로 인해 많은 척추 발달 과정을 연구하기위한 독특한 플랫폼을 제공합니다. 메추라기의 공여 조직을 비켜에서 여자의 배아에 이식되는 배아 키메라 조류는 조류 배아에 의해 수여 조작의 용이성과 세포 인구의 씻을 수없는 유전 라벨의 파워를 결합.

메추리 – 여자는 chimeras 1-3 철새 신경 능선 세포 (NCCs)를 추적하는 고전적인 도구입니다. NCCs는 개발 신경 튜브 4 지느러미 지역에서 발생한 배아에서 세포의 과도 철새 인구입니다. 그들은 mesenchymal 전환으로 상피를 받아야하고 이후 그들이 연골 5-13, melanocytes 11,14-20, 뉴런과 glia 21-32 등 다양한 세포 유형으로 차별 배아의 다른 지역으로 마이 그 레이션. NCCs는 multipotent 있으며, 그들의 궁극적인 운명은 influ입니다1) 그들은 배아 11,33-37, 2 rostro – 꼬리 축을 따라 발생한하는 신경 튜브 지역) 그들은 38-44을 마이 그 레이션으로 인접 세포로부터 신호를, 그들의 궁극 3) microenvironment에 의해 enced 배아 45,46 이내 도착. 배아 내에서 그들의 최종 위치와 운명에, 신경 튜브의 원산지 그들의 관점에서 이러한 세포를 추적, patterning 및 organogenesis 조절 발달 과정에 중요한 통찰력을 제공합니다.

기증자 신경 튜브 (접목 homotopic) 또는 기증자 신경 튜브 (접목 heterotopic)의 다른 지역의 상호 보완적인 지역의 이식은 rostro – 꼬리 축 2,47 함께 NCCs 사전 사양의 차이를 밝힐 수 있습니다. 이 기술은 더 이상 한쪽은 기증자의 조직에서 파생되는 이러한 신경 튜브의 일방적인 구획을 이식하기 위해 적응하고, contralateral 사이드 유적 호스트 배아, 이순신에 교란되지 않은 수동일한 샘플 2,47 내에서 내부 통제를 elding. 앞부분은 신경 튜브 47 폐쇄되면 또한, HH10 후, 나중에 태아의 뇌 세그먼트의 이식을위한 적응하실 수 있습니다.

여기 신경 튜브의 이산 세그먼트에서 파생된 철새 NCCs의 추적을 허용 신경 튜브 이식를 통해 메추라기 – 여자는 chimeras 창출을위한 기술을보고합니다. 메추라기 특정 QCPN 항체 48-56 가진 기증자 파생 세포의 종 특정 레이블은 연구자가 실험 종료 시점에서 기증자와 호스트 세포를 구별할 수 있습니다. 이 기술은 저렴, 간단하고, 운명 – 매핑, 추적 세포 혈통, 그리고 rostro – 꼬리 축을 따라 45 미리 patterning 이벤트를 식별하는 등 많은 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 때문에 조류 배아에 대한 접근의 용이성으로 인해 메추라기 – 여자 그래프트 기술을 포함한 다른 조작, 결합 수 있지만 렌즈 절제 4 국한되지0, 배아의 발달 프로그램의 perturbations에 NCCs의 특정 철새 스트림의 반응을 파악하기위한 억제 분자 57,58, 또는 표현 plasmids 59-61의 electroporation을 통해 유전자 조작의 주입. 또한이 접목 기술은 또한 조류 배아의 조작의 용이성과 함께 마우스 유전학의 전원을 결합하는 craniofacial morphogenesis, 또는 마우스 여자는 chimeras에 NCC의 공헌을 공부하고 같은 메추라기 – 오리 chimeras 등 다른 이종 간의 키메라 배아를 생성하는 데 사용할 수 있습니다 . 62

Protocol

1. 원하는 단계까지 품어 병아리와 메추라기 달걀 HH9 배아 들어, 일반적인 배양 시간은 38 ° C. 63시 29~33시간 이르기까지 다양 미지근한 물로 달걀에서 모든 파편을 씻으십시오. 수평 트레이에있는 닭 계란을 마련. 연필 함께 직면하고있는 측면을 선택,이 배아는 현지 예정 지역에 해당됩니다. 메추라기 알을 뭉툭한 끝을 품어. 38 장소 ° C humidifie…

Discussion

호스트 여자는 배아에 메추라기 신경 튜브 접목은 rostro – 꼬리 축 21,67-69 따라 여러 지역에서 냄새가 나는데 NCCs 마이 그 레이션의 특정 subpopulations를 추적을위한 간단하고 저렴한 기술이다 여기에서 설명한. 이 기술은 실험적으로 검토하기 위해, 조류 배아 (같은 포유류의 배아에 비해)에 대한 접근의 용이성 활용과 같은 표현 plasmids의 electroporation을 통해 조직 절제, 억제 분자의 주입, 또?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 원고의 비판에 대한 Lwigale 실험실의 구성원 감사드립니다. SLG는 국립 안과 연구소 (F32 EY02167301)에서 루스 L. Kirschstein NRSA 원정대에 의해 지원됩니다. PYL은 국립 안과 연구소 (EY018050)에 의해 지원됩니다.

Materials

Reagent Company Catalog number
Chick eggs Various – we use Texas A&M University’s Poultry Science Department, TX.  
Quail eggs Various – we use Ozarks Egg Company, MO.  
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC) www.poultrysupply.com 1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated Fine Science Tools 11210-10
Scotch tape Any office supply store  
Curved Iris forceps Fine Science Tools 11065-07
India ink Any art supply store  
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution VWR International 101447-068
Clear Packing tape Any office supply store  
Needle pulling apparatus Narashige, Japan PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube Kimble chase 34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾” Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette) Sigma-Aldrich A5177-52A
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter VWR International AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder) Fine Science Tools 26018-17
QCPN antiserum Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1) Invitrogen A21125
Ringer’s Solution (2L):
  • 14.4g NaCl
  • 0.34g CaCl2
  • 0.74g KCl
  • 0.230g Na2HPO4
  • 0.04g KH2PO4
  • ddH2O to 2L
  • Filter and autoclave
 All reagents from Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-79-4
  • 7778-77-0
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Griswold, S. L., Lwigale, P. Y. Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation. J. Vis. Exp. (60), e3622, doi:10.3791/3622 (2012).
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