Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz

Published: February 7, 2012 doi: 10.3791/3622
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University

Summary

Bıldırcın-chick kimerik embriyo kuş nöral krest hücrelerinin göç ve nihai kaderi analiz etmek için bir yaklaşım tarif edilmiştir. Bu yöntem, aksi ayarlanmamış bir civciv embriyo içinde ayırt etmek zor göç ve farklılaşma sırasında nöral krest hücrelerinden izlemek için basit ve kolay bir tekniktir.

Abstract

Kuş embriyo yumurta içinde embriyo kolay erişim nedeniyle birçok omurgalı gelişimsel süreçleri, çalışmak için benzersiz bir platform sağlar. Bıldırcın donör doku, ovo içinde bir civciv embriyo nakli olduğu kimerik kuş embriyo, hücre popülasyonlarının, silinmez genetik etiketleme güç kuş embriyosunun tarafından sunulan manipülasyon kolaylığı ile birleştirir.

Bıldırcın civciv kimeralar, 1-3 göç eden nöral krest hücrelerinden (NCCS) izlemek için klasik bir araçtır. NCCS embriyo hücreleri gelişmekte olan nöral tüp 4 dorsal bölgede kaynaklanan geçici bir göçmen nüfus vardır. Onlar, mezenkimal geçiş için bir epitel geçmesi ve daha sonra onlar, kıkırdak 5-13, melanositlere 11,14-20, nöronlar ve glia 21-32 dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri ayırt embriyonun diğer bölgelerine göç. NCCS multipotent, ve kendi nihai kaderini etkiler.1) bunlar, 11,33-37 embriyo, 2-kaudal postero ekseni boyunca kaynaklı olduğu sinirsel tüp bölge), bunlar 38-44 geçirmek olarak komşu hücreler sinyalleri, ve 3) nihai microenvironment tarafından çalışmalar la 45,46 embriyo içinde hedef. Embriyo içinde nihai pozisyon ve kaderine, nöral tüp kökenli bu hücreler izleme, modelleme ve organogenez düzenleyen gelişim süreçlerine önemli ipuçları sunuyor.

, Donör nöral tüp (aşılama Homotopik) veya donör nöral tüp (heterotopik aşılama) farklı bölgelerinde tamamlayıcı bölgelerinde Nakli, 2,47 postero-kaudal eksen boyunca ön özellikli NCCS farklılıklar ortaya çıkarabilir. Bu teknik, daha fazla nöral tüp tek taraflı donör doku elde edilir bu tür tek taraflı bir bölmesi, nakli için uyarlanmış ve taraf kalıntıları ana embriyo yi soğukkanlı edilebilir2,47 içinde aynı örnek bir iç kontrol Elding. Bu, ayrıca ön sinirsel tüp 47 kapatıldı, HH10 sonra daha sonraki embriyolarda, beyin segmentlerinin transplantasyonu için adapte edilmiş olabilir.

Burada nöral tüpün ayrı bir segment türetilen göçmen NCCS izlemek için izin nöral tüp nakli yoluyla bıldırcın-chick kimeralar üretme teknikleri sunduk. ,, Bıldırcın özel QCPN antikor 48-56 donör kaynaklı hücre türlerinin özel etiketleme araştırmacı deneysel uç noktasında donör ve alıcı hücreleri ayırt etmek için izin verir. Bu teknik, ucuz, kolay, ve kader haritalama, izleme hücre soyu, ve postero-kaudal ekseni 45 boyunca desenlendirme öncesi olayların saptanmasını da dahil olmak üzere birçok uygulama vardır. , Kolaylığı, avyan embriyo için erişim,-chick bıldırcın graft teknikle dahil olmak üzere diğer manipülasyonlar ile kombine edilebilir fakat, lens Ablasyon 4 sınırlı değildir0, embriyonun gelişim programı salınımları ile NCCS özellikle göç akımlarının yanıt belirlemek için inhibitör molekülleri 57,58, veya ifade plazmidler 59-61 elektroporasyon yoluyla genetik manipülasyon, enjeksiyon. Ayrıca, bu aşılama tekniği fare genetik kuş embriyo manipülasyonu kolaylığı ile gücünü birleştirmek için, kraniyofasiyal morfonogenezi, ya da fare civciv kimeralar KKK katkısını incelemek için bıldırcın-ördek kimeralar gibi diğer arası kimerik embriyo oluşturmak için kullanılan olabilir . 62

Protocol

1. Istenen aşamada, inkübe civciv ve bıldırcın yumurtası

HH9 embriyo için, tipik inkübasyon sürelerinde 38 ° C 63 29-33 saat arasında değişmektedir

  1. Herhangi bir enkaz yumurta ılık su ile yıkayın.
  2. Yatay tepside tavuk yumurtası düzenleyin. Kalem ile yukarı bakacak şekilde yan işaretleyin; bu embriyo lokalize edilecektir bölge karşılık gelecektir. Bıldırcın yumurtası künt sonuna kadar inkübe edin.
  3. Yeri 38 ° C nemlendirilmiş inkübatör. Fonksiyonu sallanan açın.

2. Pencereleme ve diseksiyon için yumurta hazırlayın

  1. Inkübatör gelen yumurta çıkarın ve üstleri% 70 etanol ile sterilize edin. Bu etanol püskürtün ve bir kağıt havlu ya da Kimwipe kabuğu ile, etanol herhangi bir emilimini önlemek için hızlı bir şekilde silip en iyisidir.
  2. Tek bir yumurta tutucusu (katlanmış kağıt havlu ile kaplı bir Petri, örneğin, "Kimwipes" kullanın) üzerine Yeri tavuk yumurtası. AA forcepsi, küçük bir hol dokunune kabuğunun yumurtanın sivri uç üst yüzeyi içine.
  3. 1.5-3ml, 18 ½ G derialtı iğne ve 5 ml şırınga ile tavuk yumurtası albumin ışık çıkarın. Bu, yumurta (Şekil 2A) sivri ucuna bakacak şekilde konik, delik içine iğne dikey eklemek için en iyisidir. Bu şekilde, albumin geri çekildiğinde, yanlışlıkla emme yoluyla sarısı zarar verme riski vardır. Albümin atın. Bu adım, kabuğu açılacak bir pencere için izin vermek için yumurtanın içindeki yumurta sarısı ve embriyo düşürecektir.
  4. Yukarıda açıklanan ve seloteyp ile yapıştırın% 70 etanol ile delik silin. Bu deliği çevreleyen kabuğu tamamen yoksun albümin ve kuru ya da yapışkan mühür önemlidir.
  5. AA forseps ile değil, oldukça apekste, yatay yumurta belirgin üst yüzeyi başka bir delik dokunun. Sarısı ya da embriyo zarar görmesini önlemek için forseps kabuğu ile çok ileri gitmesine izin vermemeye özen gösterin.
  6. Içindebir tarafı delik paralel yumurta kabuğu içine kavisli iris forseps Sert. Tavuk yumurta kabuğu çapı penceresinde ~ 2 cm kırmak için bir dairesel hareketlerle çalışan kabuk pinching. Kaldırılan kabuğu atın. Alternatif olarak, yumurta paketleme bandı ile üst yüzeyini kaplayan ve pencereden dışarı kesmek için bir makas kullanın. Bu kabuğu enkaz yumurtanın içine düşme olasılığını en aza indirir. Embriyonun yumurta sarısı üstüne opak bir disk olarak görünmesi gerekir. Herhangi bir döllenmemiş yumurta (blastoderm arasında küçük beyaz yumurta sarısının yüzeyinde leke, ya da yokluğu ile tanımlanır) atın.
  7. Hindistan mürekkep, embriyo düzeylendirme ile yardımcı blastoderm altında: küçük bir miktarı ("Pen / Strep nihai konsantrasyonu 100 mg / mL penisilin, 100 ug / ml streptomisin içeren steril Ringer çözeltisi içinde 1:10 oranında seyreltildi antibiyotik) enjekte ediniz Alternatif olarak, bir anne; 1 ml şırınga ve 26 ½ G derialtı iğne, iğne üssünde 45 derecelik açı içine eğildi, eğim yukarı bakacak şekilde kullanın.y çekti cam Pasteur pipeti ve ağız pipetleme cihazı (derialtı iğne bükme veya cam iğne kırılma esnasında koruyucu gözlük) kullanın. Dışından blastoderm yumurta sarısı membranı ve yüzey sarısı, iğne ucu altındaki embriyo kaydırarak Ponksiyona ancak embriyonik katmanların (Şekil 2B). Embriyonun ana hatlarıyla için yeterli mürekkep enjekte edilir, sonra dikkatli bir iğne (Şekil 2C) çekebilirsiniz. Çok fazla mürekkep enjekte embriyo ölüme yol açabilir. Bu kontaminasyon için bir kaynak olabileceği gibi, embriyo altında hava kabarcığı enjekte etmek için önemlidir. NOT: Bu prosedür içinde kullanılan tüm Ringer çözeltisi olarak sterilize edildi ve, Pen / Strep yukarıda tanımlandığı gibi içerir. Steril fosfat tamponlu salin (PBS) de bu protokolün tüm adımları Ringer çözümü için kabul edilebilir bir alternatif.
  8. Stage göre embriyo Hamburger ve Hamilton 63 ve kalıcı mürekkep veya kalem kabuğu aşama kaydedebilirsiniz. Aşamaları iyi stere altında değerlendiriliromicroscopy, sınırlı bir ısı yükü olan fiber optik "deveboynu" ışık kaynakları.
  9. Uygula 2-3 dehidratasyon ve kirlenmeyi önlemek için embriyo yüzeye sıcak steril Ringer çözeltisi düşer. Parafilm yumurta yüzey üzerine gerilmiş Geçici penceresini kapatın.
  10. Tekrar nakli deneyleri başlayan önce tüm civciv yumurta ile 2,2-2,9 adımları yineleyin.
  11. Bıldırcın embriyoları sadece donör doku için kullanılan bu yana, ovo adımları 2,2-2,9 atlanabilir. Donör embriyo ex ovo hazırlanması için, bıldırcın yumurtası, künt yan inkübe edilir ve embriyo ortaya çıkarmak için kavisli bir forseps ile bu bölgede açıldı. Diseksiyon makas kullanarak, embriyo dışında vitellin membran ve blastoderm (tüm kesimler karşıladığından emin olun) ile bir kare şeklinde dört kesim yapmak. Kavisli bir iris forseps kullanarak, hafifçe bir kesim kenarını kavramak ve yumurta embriyo kaldırın ve bir Petri kabındaki Ringers çözüm aktarmak. Alternatif olarak, bir eğri kullanabilird iris yumurta embriyo transfer etmek için kullanılır olabilir, altına veya bir embriyo kaşık veya silindir geniş kısmı kesip plastik transferi pipet eksize embriyo kaldırmak için forseps. Yavaşça vitellin membran # 5 forseps ile çıkarın. Yukarıdaki gibi kalan bıldırcın embriyolarının toplayın ve bunları mikroskop altında sahneleyecek.

3. Greft almak için ev sahibi embriyo hazırlayın

  1. Konak (civciv) embriyo parafilm çıkarın ve sivriltilmiş bir tungsten iğne veya # 5 forseps kullanarak, nöral tüp (Şekil 3A) istenilen bölgenin, vitellin zarında küçük bir delik gözyaşı.
  2. Bir damla embriyoya Ringer çözeltisi ekleyin. Embriyo doku kaybını önlemek için tüm prosedürü sırasında Ringer çözeltisi tamamen sular altında tutmaya özen gösterin. Ringer çözeltisi ile embriyo transferi pipet gerekirse yüzeye damla eklenerek tutun.
  3. Çekti cam iğne kullanılarak, dikkatle rostral ve yaklaşıkdorsal nöral tüp içinde faiz uzunluğu ve bölgeye karşılık devamlı iyeliğe dayalı mülkiyet hakkı transvers insizyon. (Çektiğine cam iğneler iğne aparatı çekerek ile ısı altında çektiği silikon cam kılcal tüpler üretilir.) Tek taraflı greft insizyon sadece dorsal nöral tüp lümenine genişletmek ve ikili greftler için, boydan boya kesiler yapmak tüm dorsal nöral tüp. Ardından dorsal nöral tüp ve paraxial mezoderm arasında bilateral kesti.
  4. Nöral tüp eksize eksplant dikkatle ayırmak sonra bir cam mikropipet (Şekil 3B) aspire embriyo çıkarın.

4. Donör greft doku hazırlayın

  1. Bir sahne eşleşti-bıldırcın embriyo seçin. AA forseps ile embriyo basılı tutun, vitellin membran, kaldırmak ve tüketim nöral tüp yukarıda açıklandığı gibi benzer bir büyüklükte bölgesi (3,3-3,4) (Şekil 3A'-B '). Denemenizin ihtiyaçlarına bağlı olarak, bu bölge olabilirev sahibi (civciv) nöral tüp veya postero kaudal eksen boyunca farklı bir bölge tamamlayıcı bir bölge. (Not: tam nöral tüp greft de dahil olmak üzere daha büyük bir bölgesel greftler, için, araştırmacılar donör doku nakli için önce herhangi bir yapışık mezenkimal doku kaldırmak için bu adımı bir proteaz sindirim eklemek isteyebilirsiniz Ancak, erken evrede küçük dorsal nöral tüp greft. , sinirsel tüp kolayca, cerrahi teknikler tarafından kesin olarak, bitişik mezenşimin ayrılmıştır olarak, burada açıklanan, proteaz sindirimi gerekli değildir.)

5. Graft doku

  1. Ringer çözeltisi içeren bir cam mikropipet içine donör eksplant aspire edin. Pipet içine herhangi bir kabarcıklar tanıtmak için dikkatli olun.
  2. Civciv ana eksize bölgeye bitişik eksplant aktarın. Orient, çekilmiş cam iğne, eksplant kullanma ve yavaşça ablasyon bölgesi (Şekil 3C) içine rehberlik.
  3. Ringer çözeltisi dikkatlice birkaç damlasu kaybını önlemek için embriyoya. Bu greft çıkarmak olabilir greft üzerine doğrudan sıvı bırakarak önlemek için özen gösterin.
  4. Pencere ambalaj bandı ile kapatılmalıdır. Bantları,, pencereli yumurta tüm bölge olduğundan emin olun. Bu, sonraki inkübasyon sırasında dehidrasyon ve embriyo kirlenmesini önler.
  5. ,, Istenen sahne kadar inkübatöründe yumurta döndürür. Kuruntuları kuluçkaya ise "rocking" fonksiyonu kapalı olduğundan emin olun. Yumurta yavaşça elini iki kez bir gün sonraki gelişim aşamalarında hedef ise bu onların canlılığı artırabilir tarafından açılabilir.

6. Kesimi için kimerik embriyo hazırlayın

  1. Deneysel son noktada, ince makas kullanırken pencere kapsayan bandı kesti.
  2. Eğri iris forseps (tırtıklı ipuçları ile yapılacak en kolay) blastoderm kenarına tutun, daha sonra 4 blastoderm sınırları dışında geniş kesimler ile sarısından uzak embriyo kesilir. Ringer çözeltisi içeren Petri embriyo aktarın. Doku dehidratasyonu önlemek için, embriyonun havaya maruz kalmayı en aza indirmek için özen gösterin.
  3. Stereomikroskobi altında hafifçe # 5 forcepsi blastoderm vitellin membran ayırın.
  4. Yumurta olduğu gibi düz dışarı attı çevreleyen membran ile, embriyo, aynı yönde olması için çanak embriyo dikkatli bir şekilde düzenlemek.
  5. Tungsten teller 64 yapılan iğneler, yemeğin altına tungsten telli paralel uzunluğu ile embriyo ve extraembryonic doku sınır iğne düzenleyerek embriyo temiz, çevredeki blastoderm kaldırmak için diseksiyon kullanın. Hafif bir kesme hareketi, dokuları kesmek için kullanın.
  6. # 5 forseps ile amniyon dikkatlice çıkarın. Bu noktada, daha fazla ilgi bölge teşrih veya embriyo bütün bırakın ya da isteyebilirsiniz.
  7. Buz gibi soğuk% 4 paraf embriyo transfer4 ° C'de ve geceleme rock ormaldehyde
  8. Örnekleri hazırlayın ve, cryo veya parafin bölümlendirilmeleri için embed.

Ana embriyo içinde aşılı doku çiziniz. Hematoksilen boyama ile bıldırcın nukleoli algılama (bıldırcın çekirdeklerin, civciv çekirdekler daha çok büyük, koyu boyama kapanımlar), Feulgen-Rossenbeck reaksiyonu, akridin-turuncu ya da biz-benzamid leke de dahil olmak üzere bir civciv embriyo içinde bıldırcın doku tanımlamak için çeşitli teknikler vardır bıldırcın özgü antijenler 3,47,65,66 elektron mikroskop veya immün ile birlikte. İşte biz, bıldırcın civciv kimeralar (Şekil 4) bıldırcın nöral krest hücrelerinden tanımlamak için QCPN antijen ve standart tüm montaj veya bölüm immunofloresan teknikleri kullanın. Bu tekniğin ayrıca QCPN immunoşoresan, vericinin (Bıldırcın) dokudan türetilmiş farklılaşmış hücreler tanımlamak için diğer antikorları ile kombine edilebilir olarak, deney tasarımı en esneklik sağlar. Standa kullanınrd tüm montaj veya bölüm immunofloresan teknikleri kimeralar bıldırcın kökenli hücrelerin etiketlemek için.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Re-inkübasyon 6h sonra nöral tüp aşılı bölgenin temsili bir görüntü (HH11 için), ana bilgisayar (civciv) nöral tüp (Şekil 4A) içine aşılı donör (bıldırcın) doku beklenen birleşme gösterir. Reincubation sonra, greft eksik entegrasyon, veya, kranial bölge veya Somitlerin asimetrik gelişme gösteren Embriyolar atılmalıdır.

, HNK-1 yanal nöral tüp geçiş ile etiketlenmiş HH11 gösterisi NCCS, aşılı bölge ile kesiti. Bıldırcın hücreleri KKK göçmen akışına katkı ve nöral tüp, açıkça QCPN (Şekil 4B) ile işaretlenmiş.

Daha sonraki aşamalarda, bıldırcın KKK-türetilmiş hücreler nihai hedef dokuya izlenebilmektedir. , QCPN etiketli hücreleri civciv embriyo mezenşimin içinde serpiştirilmişE5 (Şekil 4C) maksiller süreci.

QCPN antikor kolayca,, ana çevre bıldırcın-derived NCCS farklılaşma incelemek için diğer antikorları ile kombine edilebilir. Bıldırcın KKK-türetilmiş trigeminal duysal nöronlarda QCPN ve Tuj1 antikorlar (Şekil 4D) tarafından etiketlenir.

Şekil 1.
Şekil 1. Deneysel prosedür ve gerekli aletler genel bir bakış. A) Host (civciv) ve donör (bıldırcın) embriyo aşamasında uyumlu olması gerekir. Trigeminal ganglion ve Çene-mandibüler bölgedeki katkıda KKK akışı etiketlemek için HH9, idealdir. HH9, nöral tüp rostral bölgede kapatmak için başlıyor, ama henüz tamamen kapalı değil. Diyagramlarda gri çizgi kapanış nöral tüp orta hat temsil eder. Noktalı beyaz çizgiler, ev sahibi ve donör nöral tüp sağ tarafında bir Ortabeyin bölge eksize kesme hatları gösterir embryos. Ana embriyo eksize bölge atılır ve donör doku kimerik embriyo oluşturmak için nakledilen. B) Gerekli araçlar şunlardır: a) 5 ml'lik 18 ile şırınga ½ G derialtı iğne, b) 26 ile 1 ml şırınga ½ 45 ° açılı, c) Hindistan mürekkep G derialtı iğne bükük, d) net ambalaj bandı, e) ağız pipetleme cam pipet AA forseps, aparatları, f) 60 mm-Petri, g) h) tırtıklı ipuçları, i eğri iris forseps) # 5 forseps, j) ince makas, k) l, tungsten tel bilenmiş) cam iğne, m) parafilm çekti kareler.

Şekil 2.
Şekil 2. 18 ideal ekleme noktası da dahil olmak üzere yumurta, yumurta ve embriyo hazırlanması. A) Kesitsel şeması, ½, albümin ışık çekilmesi için G derialtı iğne. B) ışık albümin ~ 3ml çekilmesi sonra, sarısı ve embriyo, araştırmacılar t bir "pencere" (oklar) kesmek için izin, yumurtanın içindeki düşürüro embriyo erişmek için kabuğu. Çini mürekkebi, steril Ringer çözeltisi seyreltilmiş 01:10, sonra embriyoların kolay evreleme için kontrast sağlamak için blastoderm altına enjekte edilebilir. C) Civciv embriyo mürekkep sonra.

Şekil 3,
Şekil 3. Şematik aşılama işlemi her aşamada ve HH aşamada 9 donör ve alıcı embriyo örnekleri A) Chick ana embriyo. , Vitellin membran greft kranial bölge erişmek için yırtılmış nereye şemada kesik çizgilerle gösterir. Vitellin membran yırtılmış sonra üçgen flep kaudal soyulmuş olmalıdır. Görüntünün Kutu (BC) içinde kullanılan inset gösterir. A ') Bıldırcın donör embriyo. Görüntü donör embriyo yumurta çıkarıldı ve greft doku diseksiyonu için Petri yerleştirilir. (B ') görüntü kutusunda kullanılan gömme gösterir. Vitelline ve sarısı membranlar t kaldırmak için nerede kesileceğini şematik diyagramı Kesikli çizgiler (A) gösteriryumurtadan çıkan embriyo. B), greft bekleyen eksize nöral tüp (beyaz oklar) tek taraflı Ortabeyin bölge ile Host embriyo. Kesimler Ortabeyin bölgede nöral tüp tüketim yapılmalıdır nerede şematik diyagramda noktalı çizgi gösterir. Dorsal nöral tüp greft dokusu ile B ') Donör embriyo (greft dokusu siyah ok uçları ile gösterilir) çıkarıldı. Kesimler nöral tüp Ortabeyin bölgede aşılama tek taraflı donör doku tüketim bıldırcın embriyo nerede yapılmalıdır diyagramda noktalı çizgi gösterir. Bıldırcın dorsal nöral tüp implantını, civciv Ortabeyin bölgeye aşılamadan sonra C) Kimerik embriyo.

Şekil 4,
Şekil 4. İmmünofloresan donör kaynaklı kimerik embriyo hücrelerinde bıldırcın özel nükleer antijen QCPN tespit chimera HH11 (de aşılı HH9), kırmızı QCPN boyama gösteren ve, HNK-1 boyanmasının (NCCS göç eden bir belirteç) A) Tüm montaj görüntü içindeyeşil. 10X büyütme dorsal görünüm. Embriyo ile nöral tüp ve göçmen KKK HNK-1 (yeşil) ile birlikte boyandı QCPN pozitif bıldırcın elde edilen hücreler gösteren (A) B) Kesit. 40X büyütme. C) chimera E5 maksiller sürecinde Çapraz bölümü (3 gün sonrası greft için inkübe), nöral tüp embriyo nihai konuma aşılı bölgeden göç etmiş QCPN-pozitif KKK kökenli hücrelerin (kırmızı) gösteren. 10X büyütmeli. D) Bölüm (yeşil) TuJ1-pozitif nöron içine trigeminal ganglion (kırmızı) ve farklılaşma KKK elde edilen bıldırcın E5 chimera gösteren katkısı ile. 40X büyütme. * NCCS; MP, maksiller süreci NT, nöral tüp; TG, trigeminal ganglion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Postero-kaudal ekseni 21,67-69 boyunca farklı bölgelerden kaynaklanan NCCS göç belirli subpopülasyonunun izlemek için basit ve ucuz bir tekniktir host civciv embriyolarının içine bıldırcın nöral tüp grefti Burada anlatılan. Bu teknik deneysel olarak araştırmak, kuş embriyoları (memeli embriyo göre) erişim kolaylığı yararlanır ve elektroporasyon yoluyla ifade plazmidlerin doku ablasyonu, inhibitör moleküllerin enjeksiyon veya genetik manipülasyon gibi diğer teknikleri ile kombine edilebilir 47,69 embriyoların içinde farklı gelişimsel ipuçları belirli bir göçmen KKK nüfusu cevabı.

Bıldırcın-chick kimeralar KKK göç ve farklılaşmayı inceleyen ve bu tekniğin nöral tüp yanı sıra diğer dokuların nakli, adapte edilebilir için güçlü bir araçtır. Civciv embriyo içine bıldırcın doku grefti köklü bir techniqu olduğununöral tüp küçük bölgeler mikrodiseksiyon çok ince motor becerileri gerektiren e 13,21,70-76, ama en iyi görsel gösteri tarafından öğrenilir.

Bıldırcın-türetilmiş hücrelerin ana civciv hücreleri aracılığı ile bıldırcın-spesifik antikor QCPN ile immünboyama kolayca ayırt edilebilir Çünkü, nöral tüpün belirli bölgelerinden kaynaklanan NCCS gelişim potansiyeli, deneysel az donör (bıldırcın) hücreler farklılaşma varılabilir bitiş noktası, örneğin,,, perioküler bölge ve korneada QCPN pozitif hücrelerin varlığı, HH9 az civciv embriyolarının Ortabeyin bölge içine bıldırcın nöral tüp greft sonra bu bölgede kornea endoteli ve stroma 77 doğuran bu göç nöral krest gösterir. Nöral tüp HH9-10 greft trigeminal ganglion ve brankiyal kemerler KKK katkısını ortaya koymaktadır. Ayrıca, bıldırcın türetilmiş duyusal nöronlar başka bir bıldırcın-nöron spesifik (QN) antikoru 78,79 ile takip edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, ifşa etmek için bir şey var.

Acknowledgments

Yazarlar yazının eleştirisi Lwigale laboratuvar üyelerine teşekkür ederim. SLG, Ruth L. Kirschstein NRSA, Ulusal Göz Enstitüsü (F32 EY02167301) Kardeşliği tarafından desteklenmektedir. PYL Ulusal Göz Enstitüsü (EY018050) tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chick eggs Various
Quail eggs Various
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC) Poultry Supply 1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated Fine Science Tools 11210-10
Scotch tape Any Supplier
Curved Iris forceps Fine Science Tools 11065-07
India ink Any Supplier
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution VWR international 101447-068
Clear Packing tape Any Supplier
Needle pulling apparatus Narishige International PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube Kimble Chase 34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette) Sigma-Aldrich A5177-52A
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter VWR international AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder) Fine Science Tools 26018-17
QCPN antiserum Developmental Studies Hybridoma Bank QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1) Invitrogen A21125
Ringer’s Solution (2L):
  • 14.4g NaCl
  • 0.34g CaCl2
  • 0.74g KCl
  • 0.230g Na2HPO4
  • 0.04g KH2PO4
  • ddH2O to 2L
  • Filter and autoclave
 Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-79-4
  • 7778-77-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Douarin, G., Renaud, D. Morphologic and physiologic study of the differentiation in vitro of quail embryo precardial mesoderm. Bull. Biol. Fr. Belg. 103 (3), 453-468 (1969).
  2. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods. Mol. Biol. 461, 337-350 (2008).
  3. Le Douarin, N. A biological cell labeling technique and its use in expermental embryology. Dev. Biol. 30 (1), 217-222 (1973).
  4. Noden, D. M. An analysis of migratory behavior of avian cephalic neural crest cells. Dev. Biol. 42 (1), 106-130 (1975).
  5. Johnston, M. C. A radioautographic study of the migration and fate of cranial neural crest cells in the chick embryo. Anat. Rec. 156 (2), 143-155 (1966).
  6. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. I. Skeletal and connective tissues. Dev. Biol. 67 (2), 296-312 (1978).
  7. Oka, K. The role of TGF-beta signaling in regulating chondrogenesis and osteogenesis during mandibular development. Dev. Biol. 303 (1), 391-404 (2007).
  8. Chai, Y. Fate of the mammalian cranial neural crest during tooth and mandibular morphogenesis. Development. 127 (8), 1671-1679 (2000).
  9. Lengele, B., Schowing, J., Dhem, A. Embryonic origin and fate of chondroid tissue and secondary cartilages in the avian skull. Anat. Rec. 246 (3), 377-393 (1996).
  10. Le Douarin, N. M., Ziller, C., Couly, G. F. Patterning of neural crest derivatives in the avian embryo: in vivo and in vitro studies. Dev. Biol. 159 (1), 24-49 (1993).
  11. Lallier, T. E. Cell lineage and cell migration in the neural crest. Ann. N.Y. Acad. Sci. 615, 158-171 (1991).
  12. Nakamura, H. Mesenchymal derivatives from the neural crest. Arch. Histol. Jpn. 45 (2), 127-138 (1982).
  13. Le Lievre, C. S., Le Douarin, N. M. Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos. J. Embryol. Exp. Morphol. 34 (1), 125-154 (1975).
  14. Rawles, M. E. The Development of Melanophores from Embryonic Mouse Tissues Grown in the Coelom of Chick Embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (12), 673-680 (1940).
  15. Rawles, M. E. The Pigment-Forming Potency of Early Chick Blastoderms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (1), 86-94 (1940).
  16. Mosher, J. T. Intrinsic differences among spatially distinct neural crest stem cells in terms of migratory properties, fate determination, and ability to colonize the enteric nervous system. Dev. Biol. 303 (1), 1-15 (2007).
  17. Dupin, E., Le Douarin, N. M. Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest. Oncogene. 22 (20), 3016-3023 (2003).
  18. Faraco, C. D., Vaz, S. A., Pastor, M. V., Erickson, C. A. Hyperpigmentation in the Silkie fowl correlates with abnormal migration of fate-restricted melanoblasts and loss of environmental barrier molecules. Dev. Dyn. 220 (3), 212-225 (2001).
  19. Selleck, M. A., Bronner-Fraser, M. Avian neural crest cell fate decisions: a diffusible signal mediates induction of neural crest by the ectoderm. Int. J. Dev. Neurosci. 18 (7), 621-627 (2000).
  20. Stocker, K. M., Sherman, L., Rees, S., Ciment, G. Basic FGF and TGF-beta 1 influence commitment to melanogenesis in neural crest-derived cells of avian embryos. Development. 111 (2), 635-645 (1991).
  21. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Experimental analysis of the migration and differentiation of neuroblasts of the autonomic nervous system and of neurectodermal mesenchymal derivatives, using a biological cell marking technique. Dev. Biol. 41 (1), 162-184 (1974).
  22. Noden, D. M. The control of avian cephalic neural crest cytodifferentiation. II. Neural tissues. Dev. Biol. 67 (2), 313-329 (1978).
  23. Barraud, P. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (49), 21040-21045 (2010).
  24. Li, H. Y., Say, E. H., Zhou, X. F. Isolation and characterization of neural crest progenitors from adult dorsal root ganglia. Stem Cells. 25 (8), 2053-2065 (2007).
  25. Carney, T. J. A direct role for Sox10 in specification of neural crest-derived sensory neurons. Development. 133 (23), 4619-4630 (2006).
  26. Maro, G. S. Neural crest boundary cap cells constitute a source of neuronal and glial cells of the PNS. Nat. Neurosci. 7 (9), 930-938 (2004).
  27. Bronner-Fraser, M. Molecular analysis of neural crest formation. J. Physiol. Paris. 96 (1-2), 3-8 (2002).
  28. Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Development. 128 (20), 3949-3961 (2001).
  29. Britsch, S. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
  30. Bronner-Fraser, M. Origin of the avian neural crest. Stem Cells. 13 (6), 640-646 (1995).
  31. Jessen, K. R., Mirsky, R. Neural development. Fate diverted. Curr. Biol. 4 (9), 824-827 (1994).
  32. Le Douarin, N., Dulac, C., Dupin, E., Cameron-Curry, P. Glial cell lineages in the neural crest. Glia. 4 (2), 175-184 (1991).
  33. Chan, W. Y., Cheung, C. S., Yung, K. M., Copp, A. J. Cardiac neural crest of the mouse embryo: axial level of origin, migratory pathway and cell autonomy of the splotch (Sp2H) mutant effect. Development. 131 (14), 3367-3379 (2004).
  34. Bronner-Fraser, M. Segregation of cell lineage in the neural crest. Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (4), 641-647 (1993).
  35. Peters-vander Sanden, M. J., Luider, T. M., vander Kamp, A. W., Tibboel, D., Meijers, C. Regional differences between various axial segments of the avian neural crest regarding the formation of enteric ganglia. Differentiation. 53 (1), 17-24 (1993).
  36. Kuratani, S., Bockman, D. E. Capacity of neural crest cells from various axial levels to participate in thymic development. Cell Tissue Res. 263 (1), 99-105 (1991).
  37. Leblanc, G. G., Epstein, M. L., Bronner-Fraser, M. E. Differential development of cholinergic neurons from cranial and trunk neural crest cells in vitro. 137 (2), 318-330 (1990).
  38. Golding, J. P., Trainor, P., Krumlauf, R., Gassmann, M. Defects in pathfinding by cranial neural crest cells in mice lacking the neuregulin receptor ErbB4. Nat. Cell. Biol. 2 (2), 103-109 (2000).
  39. Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Kasemeier-Kulesa, J. C., McLennan, R. Cranial neural crest migration: new rules for an old road. Dev. Biol. 344 (2), 543-554 (2009).
  40. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Semaphorin3A/neuropilin-1 signaling acts as a molecular switch regulating neural crest migration during cornea development. Dev. Biol. 336 (2), 257-265 (2009).
  41. Killian, O. lesnicky, Birkholz, E. C., A, D., Artinger, K. B. A role for chemokine signaling in neural crest cell migration and craniofacial. Dev. Biol. 333 (1), 161-172 (2009).
  42. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67 (1), 47-56 (2007).
  43. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the chick. Dev. Dyn. 232 (4), 939-949 (2005).
  44. Kanzler, B., Foreman, R. K., Labosky, P. A., Mallo, M. BMP signaling is essential for development of skeletogenic and neurogenic cranial neural crest. Development. 127 (5), 1095-1104 (2000).
  45. Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. Fate map of the chick embryo neural tube. Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).
  46. Goldstein, A. M., Nagy, N. A bird's eye view of enteric nervous system development: lessons from the avian embryo. Pediatr. Res. 64 (4), 326-333 (2008).
  47. Le Douarin, N., Dieterlen-Lievre, F., Creuzet, S., Teillet, M. A. Quail-chick transplantations. Methods Cell. Biol. 87, 19-58 (2008).
  48. Wingate, R. J., Lumsden, A. Persistence of rhombomeric organisation in the postsegmental hindbrain. Development. 122 (7), 2143-2152 (1996).
  49. Karagenc, L., Sandikci, M. Tissue distribution of cells derived from the area opaca in heterospecific quail-chick blastodermal chimeras. J. Anat. 216 (1), 16-22 (2010).
  50. Teague, W. J., Jayanthi, N. V., Lear, P. V., Johnson, P. R. Foregut mesenchyme contributes cells to pancreatic acini during embryonic development in a chick-quail chimera model. Pediatr. Surg. Int. 21 (3), 138-142 (2005).
  51. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  52. He, L. Three different fates of cells migrating from somites into the limb bud. Anat. Embryol. (Berl). 207 (1), 29-34 (2003).
  53. Huang, R., Zhi, Q., Christ, B. The relationship between limb muscle and endothelial cells migrating from single somite. Anat. Embryol. (Berl). 206 (4), 283-289 (2003).
  54. Hidalgo-Sanchez, M., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. Fgf8 and Gbx2 induction concomitant with Otx2 repression is correlated with midbrain-hindbrain fate of caudal prosencephalon. Development. 126 (14), 3191-3203 (1999).
  55. Verberne, M. E., Gittenberger-de Groot, A. C., Poelmann, R. E. Lineage and development of the parasympathetic nervous system of the embryonic chick heart. Anat. Embryol. (Berl). 198 (3), 171-184 (1998).
  56. Burns, A. J., Douarin, N. M. The sacral neural crest contributes neurons and glia to the post-umbilical gut: spatiotemporal analysis of the development of the enteric nervous system. Development. 125 (21), 4335-4347 (1998).
  57. Debby-Brafman, A., Burstyn-Cohen, T., Klar, A., Kalcheim, C. F-Spondin, expressed in somite regions avoided by neural crest cells, mediates inhibition of distinct somite domains to neural crest migration. Neuron. 22 (3), 475-488 (1999).
  58. Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Dev. Biol. 306 (2), 750-759 (2007).
  59. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24 (1), 43-48 (2001).
  60. Chen, Y. X., Krull, C. E., Reneker, L. W. Targeted gene expression in the chicken eye by in ovo electroporation. Mol. Vis. 10, 874-883 (2004).
  61. Sato, F., Nakagawa, T., Ito, M., Kitagawa, Y., Hattori, M. A. Application of RNA interference to chicken embryos using small interfering RNA. J. Exp. Zool. A. Comp. Exp. Biol. 301 (10), 820-827 (2004).
  62. Lwigale, P. Y., Schneider, R. A. Other chimeras: quail-duck and mouse-chick. Methods Cell. Biol. 87, 59-74 (2008).
  63. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
  64. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  65. Le Douarin, N. M. A Feulgen-positive nucleolus. Exp. Cell. Res. 77 (1), 459-468 (1973).
  66. Feulgen, R., Rossenbeck, H. Mikroskopisch-chemischer Nachweis einer Nucleinsaure vom typus der Thymonucleinsiiure und die darauf beruhende elektive Faibung von Zellkemen in mikroskopischen Praparaten. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 135, 203-252 (1924).
  67. Lwigale, P. Y., Conrad, G. W., Bronner-Fraser, M. Graded potential of neural crest to form cornea, sensory neurons and cartilage along the rostrocaudal axis. Development. 131 (9), 1979-1991 (2004).
  68. Weston, J. A. A radioautographic analysis of the migration and localization of trunk neural crest cells in the chick. Dev. Biol. 6, 279-310 (1963).
  69. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , 2nd Ed, Cambridge University Press. (2009).
  70. Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo. J. Embryol. Exp. Morphol. 30 (1), 31-48 (1973).
  71. Douarin, N. M. L. e, Jotereau, F. V. Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142 (1), 17-40 (1975).
  72. Le Douarin, N. M., Renaud, D., Teillet, M. A., Le Douarin, G. H. Cholinergic differentiation of presumptive adrenergic neuroblasts in interspecific chimeras after heterotopic transplantations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72 (2), 728-732 (1975).
  73. Houssaint, E., Belo, M., Le Douarin, N. M. Investigations on cell lineage and tissue interactions in the developing bursa of Fabricius through interspecific chimeras. Dev. Biol. 53 (2), 250-264 (1976).
  74. Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V., Houssaint, E., Belo, M. Ontogeny of the avian thymus and bursa of Fabricius studied in interspecific chimeras. Ann. Immunol. (Paris). 127 (6), 849-856 (1976).
  75. Fontaine, J., Le Douarin, N. M. Analysis of endoderm formation in the avian blastoderm by the use of quail-chick chimaeras. The problem of the neurectodermal origin of the cells of the APUD series. J. Embryol. Exp. Morphol. 41, 209-222 (1977).
  76. Narayanan, C. H., Narayanan, Y. On the origin of the ciliary ganglion in birds studied by the method of interspecific transplantation of embryonic brain regions between quail and chick. J. Embryol. Exp. Morphol. 47, 137-148 (1978).
  77. Lwigale, P. Y., Cressy, P. A., Bronner-Fraser, M. Corneal keratocytes retain neural crest progenitor cell properties. Dev. Biol. 288 (1), 284-293 (2005).
  78. Lwigale, P. Y. Embryonic origin of avian corneal sensory nerves. Dev. Biol. 239 (2), 323-337 (2001).
  79. Tanaka, H., Kinutani, M., Agata, A., Takashima, Y., Obata, K. Pathfinding during spinal tract formation in the chick-quail chimera analysed by species-specific monoclonal antibodies. Development. 110 (2), 565-571 (1990).

Tags

Nörobilim Sayı 60 Nöral krest civciv bıldırcın Chimera kader haritası hücre göçü hücre farklılaşması
Çapraz türler Nakli Sinir Crest Göç ve Farklılaşma Analiz
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Griswold, S. L., Lwigale, P. Y.… More

Griswold, S. L., Lwigale, P. Y. Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation. J. Vis. Exp. (60), e3622, doi:10.3791/3622 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter