Analyse av Neural Crest Migrasjon og differensiering av Cross-arter Transplantation

Summary

En tilnærming for å analysere migrasjon og eventuell skjebne av aviær neural crest cellene i vaktel-chick chimeric embryoer er beskrevet. Denne metoden er en enkel og grei teknikk for sporing neural crest cellene under trekket og differensiering som ellers er vanskelig å skille innenfor en unmanipulated kylling embryo.

Abstract

Avian embryoer gir en unik plattform for å studere mange virveldyr utviklingsprosesser, på grunn av enkel tilgang av embryoene i egget. Chimeric avian embryo, der vaktel donor vev blir transplantert inn en kylling embryo i ovo, kombinere kraften uutslettelige genetisk merking av celle populasjoner med enkel manipulasjon presenteres av aviær embryo.

Quail-chick chimeras er et klassisk verktøy for å spore vandrende neural crest cellene (NCCer) ^1-3. NCCer er en forbigående vandringer populasjon av celler i embryoet, som stammer i den dorsale delen av å utvikle nevralrøret ^4. De gjennomgår en epitelial til mesenchymale overgang og deretter migrere til andre regioner av embryoet, hvor de differensiere i ulike celletyper, inkludert ^5-13 brusk, melanocytter ^11,14-20, nevroner og gliaceller ^21-32. NCCer er multipotent, og deres endelige skjebne er innflytelsepåvirket av 1) den delen av nevralrøret hvor de stammer langs Rostro-kaudal aksen av embryoet ^11,33-37, 2) signaler fra nabocellene som de vandrer ^38-44, og 3) mikromiljøet av deres endelige destinasjon i fosteret ^45,46. Følge disse cellene fra deres synspunkt opprinnelse i nevralrøret, til sin endelige posisjon og skjebne innenfor fosteret, gir viktig innsikt i de utviklingsprosesser som regulerer mønster og organogenesen.

Transplantasjon av komplementære områder av donor nevralrøret (homotopic pode) eller ulike regioner av donor nevralrøret (heterotop pode) kan avsløre forskjeller i pre-spesifikasjon av NCCer langs Rostro-kaudal aksen ^2,47. Denne teknikken kan videre tilpasses transplantere en ensidig kupé av nevralrøret, slik at den ene siden er avledet fra donor vev, og motsatt side restene uaffisert i verten embryo, yiElding en intern kontroll innenfor samme prøve ^2,47. Det kan også tilpasses for transplantasjon av hjernen segmenter i senere embryoer, etter HH10, når den fremre nevralrøret har stengt ^47.

Her rapporterer vi teknikker for å generere vaktel-chick chimeras via nevralrøret transplantasjon, som gir mulighet for sporing av trekkende NCCer avledet fra en diskret del av nevralrøret. Artsspesifikk merking av donor-deriverte celler med vaktel-spesifikt QCPN antistoff ^48-56 tillater forskeren å skille donor og vertsceller ved eksperimentelle endepunktet. Denne teknikken er enkel, billig, og har mange bruksområder, inkludert skjebne-mapping, celle avstamning sporing, og identifisere pre-mønster hendelser langs Rostro-kaudal aksen ^45. På grunn av den enkle tilgangen til avian embryo, kan vaktel-chick pode teknikk kombineres med andre manipulasjoner, inkludert men ikke begrenset til objektiv ablasjon ⁴0, injeksjon av hemmende molekyler ^57,58, eller genetisk manipulering via electroporation av uttrykk plasmider ^59-61, for å identifisere responsen av bestemte trekkende strømmer av NCCer til forstyrrelsene i embryoet utviklingstrinn program. Videre kan dette pode teknikken også brukes til å generere andre interspecific chimeric embryoer som vaktel-Duck chimeras å studere NCC bidrag til kraniofaciale morphogenesis, eller mus-chick chimeras å kombinere kraften til musen genetikk med den enkle manipulering av aviær embryoet . ⁶²

Protocol

1. Inkuber dama og vaktler egg til ønsket scene For HH9 embryoer, typiske inkubasjonstider varierer fra 29-33 timer ved 38 ° C. 63 Vask eventuelle rester fra eggene med lunkent vann. Ordne kylling egg på brett horisontalt. Marker den siden som vender opp med blyant, og dette vil tilsvare den regionen hvor embryoet vil bli lokalisert. Inkuber vaktel egg butte enden opp. Plass i 38 ° C fuktet inkubator. Slå på gyngefunksjon. <p class="j…

Discussion

Den pode av vaktel nevralrøret inn vert kyllingembryo beskrevet her er en enkel og billig teknikk for å spore spesifikke subpopulasjoner trekkende NCCer kommer fra ulike regioner langs Rostro-kaudal aksen ^21,67-69. Denne teknikken tar nytte av enkel tilgang til avian embryoer (i forhold til pattedyr embryoer) og kan kombineres med andre teknikker, for eksempel vev ablasjon, injeksjon av hemmende molekyler, eller genetisk manipulasjon via electroporation av uttrykk plasmider, til eksperimentelt undersøke re…

Materials

Reagent	Company	Catalog number
Chick eggs	Various – we use Texas A&M University’s Poultry Science Department, TX.
Quail eggs	Various – we use Ozarks Egg Company, MO.
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC)	www.poultrysupply.com	1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated	Fine Science Tools	11210-10
Scotch tape	Any office supply store
Curved Iris forceps	Fine Science Tools	11065-07
India ink	Any art supply store
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution	VWR International	101447-068
Clear Packing tape	Any office supply store
Needle pulling apparatus	Narashige, Japan	PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube	Kimble chase	34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾” Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette)	Sigma-Aldrich	A5177-52A
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter	VWR International	AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder)	Fine Science Tools	26018-17
QCPN antiserum	Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa	QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1)	Invitrogen	A21125
Ringer’s Solution (2L): 14.4g NaCl 0.34g CaCl2 0.74g KCl 0.230g Na2HPO4 0.04g KH2PO4 ddH2O to 2L Filter and autoclave	All reagents from Fisher Scientific	7647-14-5 10043-52-4 7447-40-7 7558-79-4 7778-77-0