En metode til analyse af indvandring og eventuel skæbne aviære neurale crest celler i vagtel-chick kimære embryoner er beskrevet. Denne fremgangsmåde er en enkel og ligetil teknik til sporing crista neuralis-celler under migrering og differentiering, som ellers er vanskelige at skelne i en manipuleret chick embryo.
Avian embryoner skabe en unik platform for at studere mange hvirveldyr udviklingsprocesser, som følge af den nemme adgang af embryonerne i ægget. Kimæriske fugle embryoner, som vagtler donorvæv er transplanteret ind i en kyllingeembryo i ovo og kombinerer kraften i uudsletteligt genetisk mærkning af cellepopulationer med lethed af manipulation forelagt af aviær embryo.
Quail-chick kimærer er en klassisk redskab til at spore migrerende neurale kamceller (NCCer) 1-3. NCC'erne er en forbigående vandrende population af celler i embryonet, som har oprindelse i det dorsale område af udviklingen neuralrøret 4. De gennemgår en epitelial til mesenkymale overgang og derefter migrere til andre områder af embryo, hvor de differentierer til forskellige celletyper, herunder brusk 5-13, melanocytter 11,14-20, neuroner og glia 21-32. NCC'erne er multipotente, og deres endelige skæbne er indflydelseket ved 1) den region af neuralrøret, som de stammer langs Rostro-caudale akse af embryonet 11,33-37, 2) signaler fra naboceller, når de trækker 38-44, og 3) mikromiljø deres endelige destination inden for fosteret 45,46. Sporing af disse celler fra deres udgangspunkt i neuralrøret, at deres endelige position og skæbne i embryo, giver et vigtigt indblik i de udviklingsmæssige processer, der regulerer mønster og organogenesen.
Transplantation af komplementære områder af donor neuralrøret (homotopic podning) eller forskellige regioner i donor neuralrøret (heterotop podning) kan afsløre forskelle i præ-specifikation af NCCer langs Rostro-caudale akse 2,47. Denne teknik kan tilpasses yderligere til at transplantere en ensidig rum i neuralrøret, således at den ene side stammer fra donorvæv og den kontralaterale side forbliver uforstyrrede i værten embryo, yiElding en intern kontrol inden for den samme prøve 2,47. Det kan også være indrettet til transplantation af hjernen segmenter i senere embryoner efter HH10, når den forreste neuralrøret er lukket 47.
Her rapporterer vi teknikker til generering vagtel-chick kimærer via neuralrøret transplantation, som tillader sporing af vandrende NCC'erne afledt af en diskret del af neuralrøret. Species-specifik mærkning af de donor-afledte celler med vagtel-specifikke QCPN antistof 48-56 tillader forskeren at skelne donor og værtsceller på det eksperimentelle slutpunktet. Denne teknik er enkel, billig, og har mange applikationer, herunder skæbne-mapping, celleafstamning sporing og identifikation af præ-mønster begivenheder langs Rostro-caudale akse 45. På grund af den lette adgang til aviær embryo, kan vagtel-chick transplantat teknik kombineres med andre manipulationer, herunder men ikke begrænset til linsen ablation 40, injektion af inhibitoriske molekyler 57,58 eller genetisk manipulation via elektroporering af ekspressionsplasmider 59-61, til at identificere respons bestemt migrerende strømme af NCC'erne til perturbationer i fosterets udviklingsmæssige program. Endvidere kan denne podning teknik også anvendes til at generere andre interspecifikke kimære embryoer, såsom vagtel-Ande-kimærer til at studere NCC bidrag til kraniofaciale morfogenese eller muse-chick kimærer til at kombinere kraften af muse genetik med lette manipulation af aviært embryon . 62
Den podning af vagtler neuralrøret i host kyllingeembryoer beskrevet her er en enkel og billig teknik til at spore specifikke subpopulationer af trækkende NCCer stammer fra forskellige regioner langs Rostro-caudale akse 21,67-69. Denne teknik udnytter den lette adgang til aviære embryoner (sammenlignet med pattedyr embryoner) og kan kombineres med andre teknikker, såsom vævsablation, injektion af inhibitoriske molekyler, eller genetisk manipulation via elektroporation af ekspressionsplasmider til eksperi…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker medlemmer Lwigale laboratorium for kritik af manuskriptet. SLG understøttes af en Ruth L. Kirschstein NRSA Fellowship fra National Eye Institute (F32 EY02167301). Pyl er støttet af National Eye Institute (EY018050).
Reagent | Company | Catalog number |
Chick eggs | Various – we use Texas A&M University’s Poultry Science Department, TX. | |
Quail eggs | Various – we use Ozarks Egg Company, MO. | |
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC) | www.poultrysupply.com | 1502 |
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated | Fine Science Tools | 11210-10 |
Scotch tape | Any office supply store | |
Curved Iris forceps | Fine Science Tools | 11065-07 |
India ink | Any art supply store | |
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution | VWR International | 101447-068 |
Clear Packing tape | Any office supply store | |
Needle pulling apparatus | Narashige, Japan | PE-21 |
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube | Kimble chase | 34500 99 |
Pulled glass pipette, made from 5¾” Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A |
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette) | Sigma-Aldrich | A5177-52A |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 |
Tungsten wire, 0.1mm diameter | VWR International | AA10404-H2 |
Needle holders (Nickel-plated pin holder) | Fine Science Tools | 26018-17 |
QCPN antiserum | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | QCPN |
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1) | Invitrogen | A21125 |
Ringer’s Solution (2L):
|
All reagents from Fisher Scientific |
|