Analyse van de neurale lijst migratie en differentiatie door Cross-soorten transplantatie

Summary

Een benadering voor het analyseren van migratie en de uiteindelijke lot van aviaire neurale lijst cellen in kwartel-chick chimere embryo's wordt beschreven. Deze methode is een eenvoudige en directe techniek voor het opsporen van neurale lijst cellen tijdens migratie en differentiatie die anders moeilijk te onderscheiden binnen een ongemanipuleerde kippenembryo.

Abstract

Aviaire embryo's bieden een uniek platform voor het bestuderen van vele gewervelde ontwikkelingsprocessen, als gevolg van de gemakkelijke toegang van de embryo's in het ei. Chimère aviaire embryo's, waarbij kwartel donor weefsel wordt in een kippenembryo getransplanteerd in ovo, combineren de kracht van onuitwisbare genetische kenmerken van celpopulaties met het gemak van manipulatie door het aviaire embryo.

Quail-chick hersenspinsels zijn een klassiek instrument voor het opsporen van trekkende neurale lijst cellen (NCC's) ^1-3. NCC's zijn een tijdelijke trekkende populatie van cellen in het embryo, die van oorsprong in het dorsale gebied van de ontwikkeling van neurale buis ^4. Ze ondergaan een epitheliale naar mesenchymale transitie en vervolgens migreren naar andere regio's van het embryo, waar ze differentiëren in verschillende soorten cellen, waaronder kraakbeen ^5-13, melanocyten ^11,14-20, neuronen en glia ^21-32. NCC's zijn multipotente, en hun uiteindelijke lot is invloedbeïnvloed door 1) het gebied van de neurale buis waaruit zij van oorsprong langs de Rostro-caudale as van het embryo ^11,33-37, 2) signalen van naburige cellen als ze ^38-44 migreren, en 3) de micro-omgeving van hun uiteindelijke bestemming binnen het embryo ^45,46. Tracing deze cellen vanuit hun oorsprong in de neurale buis, op hun definitieve standpunt en het lot in het embryo, levert belangrijke inzicht in de ontwikkelingsprocessen die patronen en organogenese te reguleren.

Transplantatie van complementaire regio's van donor neurale buis (homotopic enten) of verschillende regio's van donor neurale buis (heterotope enten) kan onthullen verschillen in de pre-specificatie van NCC's langs de Rostro-caudale as ^2,47. Deze techniek kan verder worden aangepast aan een eenzijdige compartiment van de neurale buis, zodat een zijde uit donorweefsel transplanteren en contralaterale zijde blijft onverstoord in de gastheer embryo, yielding een interne controle binnen hetzelfde monster ^2,47. Het kan ook worden aangepast voor transplantatie van hersenen segmenten later embryo na HH10 wanneer de voorste neurale buis gesloten ^47.

Hier melden wij technieken voor het genereren van kwartel-chick hersenschimmen via neurale buis transplantatie, die het mogelijk maken voor het traceren van de trekkende NCC's afgeleid van een discrete segment van de neurale buis. Soortspecifieke kenmerken van de donor-afgeleide cellen met de kwartel-specifieke antilichaam QCPN ^48-56 kan de onderzoeker om donor en gastheercellen te onderscheiden in een experimentele eindpunt. Deze techniek is eenvoudig, goedkoop, en heeft vele toepassingen, waaronder het lot-mapping, cellijn opsporen en identificeren van pre-patronen evenementen langs de Rostro-caudale as ^45. Vanwege het gemak van toegang tot de aviaire embryo, kan de kwartel-chick graft techniek worden gecombineerd met andere bewerkingen, met inbegrip van maar niet beperkt tot lens ablatie ⁴0, injectie van remmende moleculen ^57,58, of genetische manipulatie via elektroporatie van meningsuiting plasmiden ^59-61, om de reactie van bepaalde trekkende stromen van NCC's tot verstoringen in ontwikkeling van het embryo-programma te identificeren. Bovendien kan deze enten techniek ook gebruikt worden om andere interspecifieke chimere embryo's, zoals kwartel-eend hersenschimmen genereren NCC bijdrage aan craniofaciale morfogenese, of muis-chick hersenschimmen om de kracht van de muis genetica te combineren met het gemak van manipulatie van de aviaire embryo te bestuderen ^62.

Protocol

1. Incubate kuiken en kwarteleitjes op de gewenste fase Voor HH9 embryo's, typische incubatietijd varieert 29 tot 33 uur bij 38 ° C 63 Was de puin van de eieren met lauw water. Horizontaal Leg eieren op de tray. Markeer de zijde naar boven met potlood, dit komt overeen met de regio waar het embryo zal worden gelokaliseerd. Incubeer kwarteleitjes stomp eindigen. Plaats in 38 ° C bevochtigde incubator. Zet schommelen functie. <p class="…

Discussion

Het enten van kwartel neurale buis in gastheercellen kippenembryo's die hier beschreven is een eenvoudige en goedkope techniek voor het opsporen van specifieke subpopulaties van het migreren van NCC's afkomstig uit verschillende regio's langs de Rostro-caudale as ^21,67-69. Deze techniek maakt gebruik van de bereikbaarheid van aviaire embryo's (ten opzichte van zoogdieren embryo) en kan worden gecombineerd met andere technieken, zoals weefsel ablatie injectie remmende moleculen of genetische ma…

Materials

Reagent	Company	Catalog number
Chick eggs	Various – we use Texas A&M University’s Poultry Science Department, TX.
Quail eggs	Various – we use Ozarks Egg Company, MO.
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC)	www.poultrysupply.com	1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated	Fine Science Tools	11210-10
Scotch tape	Any office supply store
Curved Iris forceps	Fine Science Tools	11065-07
India ink	Any art supply store
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution	VWR International	101447-068
Clear Packing tape	Any office supply store
Needle pulling apparatus	Narashige, Japan	PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube	Kimble chase	34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾” Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette)	Sigma-Aldrich	A5177-52A
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter	VWR International	AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder)	Fine Science Tools	26018-17
QCPN antiserum	Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa	QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1)	Invitrogen	A21125
Ringer’s Solution (2L): 14.4g NaCl 0.34g CaCl2 0.74g KCl 0.230g Na2HPO4 0.04g KH2PO4 ddH2O to 2L Filter and autoclave	All reagents from Fisher Scientific	7647-14-5 10043-52-4 7447-40-7 7558-79-4 7778-77-0