En tilnærming for å analysere migrasjon og eventuell skjebne av aviær neural crest cellene i vaktel-chick chimeric embryoer er beskrevet. Denne metoden er en enkel og grei teknikk for sporing neural crest cellene under trekket og differensiering som ellers er vanskelig å skille innenfor en unmanipulated kylling embryo.
Avian embryoer gir en unik plattform for å studere mange virveldyr utviklingsprosesser, på grunn av enkel tilgang av embryoene i egget. Chimeric avian embryo, der vaktel donor vev blir transplantert inn en kylling embryo i ovo, kombinere kraften uutslettelige genetisk merking av celle populasjoner med enkel manipulasjon presenteres av aviær embryo.
Quail-chick chimeras er et klassisk verktøy for å spore vandrende neural crest cellene (NCCer) 1-3. NCCer er en forbigående vandringer populasjon av celler i embryoet, som stammer i den dorsale delen av å utvikle nevralrøret 4. De gjennomgår en epitelial til mesenchymale overgang og deretter migrere til andre regioner av embryoet, hvor de differensiere i ulike celletyper, inkludert 5-13 brusk, melanocytter 11,14-20, nevroner og gliaceller 21-32. NCCer er multipotent, og deres endelige skjebne er innflytelsepåvirket av 1) den delen av nevralrøret hvor de stammer langs Rostro-kaudal aksen av embryoet 11,33-37, 2) signaler fra nabocellene som de vandrer 38-44, og 3) mikromiljøet av deres endelige destinasjon i fosteret 45,46. Følge disse cellene fra deres synspunkt opprinnelse i nevralrøret, til sin endelige posisjon og skjebne innenfor fosteret, gir viktig innsikt i de utviklingsprosesser som regulerer mønster og organogenesen.
Transplantasjon av komplementære områder av donor nevralrøret (homotopic pode) eller ulike regioner av donor nevralrøret (heterotop pode) kan avsløre forskjeller i pre-spesifikasjon av NCCer langs Rostro-kaudal aksen 2,47. Denne teknikken kan videre tilpasses transplantere en ensidig kupé av nevralrøret, slik at den ene siden er avledet fra donor vev, og motsatt side restene uaffisert i verten embryo, yiElding en intern kontroll innenfor samme prøve 2,47. Det kan også tilpasses for transplantasjon av hjernen segmenter i senere embryoer, etter HH10, når den fremre nevralrøret har stengt 47.
Her rapporterer vi teknikker for å generere vaktel-chick chimeras via nevralrøret transplantasjon, som gir mulighet for sporing av trekkende NCCer avledet fra en diskret del av nevralrøret. Artsspesifikk merking av donor-deriverte celler med vaktel-spesifikt QCPN antistoff 48-56 tillater forskeren å skille donor og vertsceller ved eksperimentelle endepunktet. Denne teknikken er enkel, billig, og har mange bruksområder, inkludert skjebne-mapping, celle avstamning sporing, og identifisere pre-mønster hendelser langs Rostro-kaudal aksen 45. På grunn av den enkle tilgangen til avian embryo, kan vaktel-chick pode teknikk kombineres med andre manipulasjoner, inkludert men ikke begrenset til objektiv ablasjon 40, injeksjon av hemmende molekyler 57,58, eller genetisk manipulering via electroporation av uttrykk plasmider 59-61, for å identifisere responsen av bestemte trekkende strømmer av NCCer til forstyrrelsene i embryoet utviklingstrinn program. Videre kan dette pode teknikken også brukes til å generere andre interspecific chimeric embryoer som vaktel-Duck chimeras å studere NCC bidrag til kraniofaciale morphogenesis, eller mus-chick chimeras å kombinere kraften til musen genetikk med den enkle manipulering av aviær embryoet . 62
Den pode av vaktel nevralrøret inn vert kyllingembryo beskrevet her er en enkel og billig teknikk for å spore spesifikke subpopulasjoner trekkende NCCer kommer fra ulike regioner langs Rostro-kaudal aksen 21,67-69. Denne teknikken tar nytte av enkel tilgang til avian embryoer (i forhold til pattedyr embryoer) og kan kombineres med andre teknikker, for eksempel vev ablasjon, injeksjon av hemmende molekyler, eller genetisk manipulasjon via electroporation av uttrykk plasmider, til eksperimentelt undersøke re…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker medlemmene av Lwigale laboratorium for kritikk av manuskriptet. SLG er støttet av en Ruth L. Kirschstein NRSA Fellowship fra National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL støttes av National Eye Institute (EY018050).
Reagent | Company | Catalog number |
Chick eggs | Various – we use Texas A&M University’s Poultry Science Department, TX. | |
Quail eggs | Various – we use Ozarks Egg Company, MO. | |
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC) | www.poultrysupply.com | 1502 |
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated | Fine Science Tools | 11210-10 |
Scotch tape | Any office supply store | |
Curved Iris forceps | Fine Science Tools | 11065-07 |
India ink | Any art supply store | |
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution | VWR International | 101447-068 |
Clear Packing tape | Any office supply store | |
Needle pulling apparatus | Narashige, Japan | PE-21 |
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube | Kimble chase | 34500 99 |
Pulled glass pipette, made from 5¾” Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A |
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette) | Sigma-Aldrich | A5177-52A |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 |
Tungsten wire, 0.1mm diameter | VWR International | AA10404-H2 |
Needle holders (Nickel-plated pin holder) | Fine Science Tools | 26018-17 |
QCPN antiserum | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | QCPN |
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1) | Invitrogen | A21125 |
Ringer’s Solution (2L):
|
All reagents from Fisher Scientific |
|