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Neuroscience

Análisis de la migración de la cresta neural y la diferenciación de las especies cruzadas Trasplante

Published: February 07, 2012
doi:
10.3791/3622
,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,Rice University

Summary

Un enfoque para el análisis de la migración y el destino final de las aves las células de la cresta neural en la codorniz, pollo embriones quiméricos se describe. Este método es una técnica simple y directa para el seguimiento de las células de la cresta neural durante la migración y la diferenciación que son difíciles de distinguir dentro de un embrión de pollo no manipulado.

Abstract

Embriones de aves proporcionar una plataforma única para el estudio de muchos procesos de desarrollo de vertebrados, debido a la facilidad de acceso de los embriones dentro del huevo. Quiméricos embriones de aves, en los que se trasplantan tejidos de donantes de codorniz en un embrión de pollo in ovo, se combinan el poder de etiquetado indeleble genética de las poblaciones de células con la facilidad de manipulación presentada por el embrión aviar.

Pollo Codorniz-quimeras son una herramienta clásica para el seguimiento de las células migratorias de la cresta neural (CCN) 1-3. NCC son una población flotante migratorio de las células en el embrión, que se originan en la región dorsal del tubo neural en desarrollo 4. Se someten a un epitelio mesenquimal de transición y posteriormente migrar a otras regiones del embrión, donde se diferencian en varios tipos de células incluyendo el cartílago 5-13, 11,14-20 melanocitos, neuronas y células de 21-32. NCC son multipotentes, y su destino final es influirinfluenciados por 1) la región del tubo neural en el que se originan a lo largo del eje rostro-caudal del embrión 11,33-37, 2) las señales de las células vecinas a medida que migran 38-44, y 3) el microambiente de su última destino en el embrión 45,46. Seguimiento de estas células desde su punto de origen en el tubo neural, a su posición final y el destino en el embrión, aporta datos importantes en los procesos de desarrollo que regulan los patrones y la organogénesis.

El trasplante de regiones complementarias del tubo neural de los donantes (homotópica injerto) o las diferentes regiones del tubo neural del donante (injerto heterotópico) puede revelar las diferencias en la pre-especificación de los países contribuyentes netos a lo largo del eje rostro-caudal 2,47. Esta técnica puede ser adaptado para el trasplante unilateral de un compartimiento del tubo neural, de tal manera que una parte se deriva de tejido de un donante, y los restos lado contralateral imperturbable en el embrión de acogida, yiElding un control interno dentro de la misma muestra, 2,47. También se puede adaptar para el trasplante de segmentos cerebrales de embriones posteriores, después de HH10, cuando el tubo neural anterior ha cerrado 47.

Aquí mostramos las técnicas para la generación de pollos de codorniz-quimeras mediante el trasplante del tubo neural, lo que permite el seguimiento de los países contribuyentes netos migratorios derivados de un segmento discreto del tubo neural. Específicos de una especie de etiquetado de las células derivadas del donante con el anticuerpo específico de la codorniz QCPN 48-56 permite al investigador para distinguir los donantes y las células huésped en el punto final experimental. Esta técnica es sencilla, barata y tiene muchas aplicaciones, incluyendo el destino de mapeo, linaje de células de seguimiento, y la identificación de pre-eventos de modelado a lo largo del eje rostro-caudal 45. Debido a la facilidad de acceso para el embrión aviar, la técnica de injerto codorniz-polluelo puede combinarse con otras manipulaciones, incluyendo pero no limitado a ablación lente 40, la inyección de moléculas inhibidoras 57,58, o la manipulación genética a través de electroporación de 59-61 plásmidos de expresión, para identificar la respuesta de determinados flujos migratorios de los países contribuyentes netos a las perturbaciones en el programa de desarrollo del embrión. Además, esta técnica de injerto también puede utilizarse para generar otros embriones interespecíficos quiméricos tales como codorniz-pato quimeras para estudiar la contribución NCC a la morfogénesis craneofacial, o quimeras pollo ratón para combinar el poder de la genética del ratón con la facilidad de manipulación del embrión aviar 62.

Protocol

1. Incubar de pollo y huevos de codorniz a la etapa deseada Para HH9 embriones, los tiempos típicos de incubación van desde 29-33 horas a 38 ° C. 63 Lave todos los residuos de los huevos con agua tibia. Organizar los huevos de gallina en la bandeja en posición horizontal. Marcar la cara superior con lápiz; esto corresponderá a la región donde se localiza el embrión. Incubar los huevos de codorniz final contundente arriba. Lugar en los 38 ° C…

Discussion

El injerto de tubo neural codorniz en embriones de pollo de acogida se describe aquí es una técnica sencilla y de bajo costo para el seguimiento de subpoblaciones específicas de la migración de los países contribuyentes netos provenientes de diferentes regiones a lo largo del eje rostro-caudal 21,67-69. Esta técnica aprovecha las ventajas de la facilidad de acceso a los embriones aviares (en comparación a los embriones de mamíferos) y se puede combinar con otras técnicas, tales como la ablación del …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a los miembros del laboratorio Lwigale para la crítica del manuscrito. SLG se apoya en una Ruth L. Kirschstein NRSA beca del National Eye Institute (F32 EY02167301). PYL es apoyada por el National Eye Institute (EY018050).

Materials

Reagent Company Catalog number
Chick eggs Various – we use Texas A&M University’s Poultry Science Department, TX.  
Quail eggs Various – we use Ozarks Egg Company, MO.  
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC) www.poultrysupply.com 1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated Fine Science Tools 11210-10
Scotch tape Any office supply store  
Curved Iris forceps Fine Science Tools 11065-07
India ink Any art supply store  
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution VWR International 101447-068
Clear Packing tape Any office supply store  
Needle pulling apparatus Narashige, Japan PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube Kimble chase 34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾” Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette) Sigma-Aldrich A5177-52A
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter VWR International AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder) Fine Science Tools 26018-17
QCPN antiserum Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1) Invitrogen A21125
Ringer’s Solution (2L):
  • 14.4g NaCl
  • 0.34g CaCl2
  • 0.74g KCl
  • 0.230g Na2HPO4
  • 0.04g KH2PO4
  • ddH2O to 2L
  • Filter and autoclave
 All reagents from Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-79-4
  • 7778-77-0
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Griswold, S. L., Lwigale, P. Y. Analysis of Neural Crest Migration and Differentiation by Cross-species Transplantation. J. Vis. Exp. (60), e3622, doi:10.3791/3622 (2012).
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