Ett tillvägagångssätt för att analysera migration och slutligen öde fågel neurallistceller i vaktel-chick chimära embryon beskrivs. Denna metod är en enkel och okomplicerad teknik för att spåra neurallistceller under migration och differentiering som annars är svåra att skilja inom ett obehandlade kycklingembryo.
Fågelembryon ger en unik plattform för att studera många ryggradsdjur utvecklingsprocesser, på grund av enkel tillgång av embryon i ägget. Chimära fågelembryon, där vaktel donatorvävnad transplanteras in i en brud embryo i ovo, kombinerar kraften i outplånlig genetiska märkning av cellpopulationer med enkel manipulation presenteras av aviär embryot.
Quail-chick chimärer är ett klassiskt verktyg för att spåra migrerande neurallistceller (NCC) 1-3. NCC är en övergående vandrande population av celler i embryot, som har sitt ursprung i den dorsala regionen av att utveckla neuralröret 4. De genomgår en epitelial till mesenkymal övergången och därefter migrera till andra delar av embryot, där de differentieras till olika celltyper, inklusive brosk 5-13, melanocyter 11,14-20, nervceller och glia 21-32. NCC är multipotenta, och deras slutliga öde är inflytandepåverkas mest av 1) den region av neuralröret, i vilken de har sitt ursprung längs rostro-kaudala axel av embryot 11,33-37, 2) signaler från angränsande celler, eftersom de migrerar 38-44, och 3) mikromiljön hos deras slutliga destination inom embryot 45,46. Spåra dessa celler från deras utgångspunkt i neuralröret till den slutliga position och öde i embryot, ger viktiga insikter i de utvecklingsprocesser som reglerar mönstring och organogenesen.
Transplantation av kompletterande områden av donator neuralrörsdefekter (homotop ympning) eller olika regioner om givarens neuralrörsdefekter (heterotopisk ympning) kan avslöja skillnader i pre-specifikation NCC längs rostro-caudal axeln 2,47. Denna teknik kan vidare anpassas att transplantera en ensidig utrymme i neuralröret, så att en sida är härledd från donatorvävnad, och den kontralaterala sidan resterna ostörda i värden embryot, yiElding en intern kontroll inom samma prov 2,47. Den kan även anpassas för transplantation av hjärnan segment i senare embryon efter HH10, när den främre neuralröret har stängt 47.
Här rapporterar vi tekniker för att generera vaktel-chick chimärer via neuralröret transplantation, som möjliggör spårning av flyttande NCC som härrör från en diskret segment av neuralröret. Art-specifik märkning av givar-härledda celler med vaktel-specifika QCPN antikroppen 48-56 gör det möjligt för forskaren att skilja donator och värdceller på experimentstadiet slutpunkten. Denna teknik är enkel, billig, och har många tillämpningar, inklusive öde-mapping, cellhärstamning spårning och identifiering av pre-mönstring evenemang längs rostro-caudal axeln 45. På grund av möjligheterna till aviär embryot kan vaktel-chick transplantat tekniken kombineras med andra manipulationer, inklusive men inte begränsat till objektiv ablation 40, injektion av inhiberande molekyler 57,58 eller genetisk manipulering via elektroporering av expressionsplasmider 59-61, för att identifiera svaret hos vissa migrerande strömmar av NCC till störningar i embryots utvecklingsprogrammet. Dessutom kan denna ympningstekniken också användas för att generera andra interspecifika chimära embryon som vaktlar-Duck chimärer att studera NCC bidrag till kraniofacial morfogenes, eller mus-chick chimärer att kombinera kraften i musen genetik med enkel manipulation av aviär embryot 62 i
Ympning av vaktlar neuralröret till embryon värd brud som beskrivs här är en enkel och billig teknik för att spåra specifika subpopulationer av migrera NCC kommer från olika regioner längs rostro-caudal axeln 21,67-69. Denna teknik drar fördel av den lättillgänglighet för fågelembryon (jämfört med däggdjursceller embryon) och kan kombineras med andra tekniker, såsom vävnadsablation, injektion av inhiberande molekyler, eller genetisk manipulering via elektroporering av expressionsplasmider f?…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar medlemmar Lwigale laboratorium för kritik av manuskriptet. SLG stöds av en Ruth L. Kirschstein NRSA stipendium från National Eye Institute (F32 EY02167301). Pyl stöds av National Eye Institute (EY018050).
Reagent | Company | Catalog number |
Chick eggs | Various – we use Texas A&M University’s Poultry Science Department, TX. | |
Quail eggs | Various – we use Ozarks Egg Company, MO. | |
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC) | www.poultrysupply.com | 1502 |
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated | Fine Science Tools | 11210-10 |
Scotch tape | Any office supply store | |
Curved Iris forceps | Fine Science Tools | 11065-07 |
India ink | Any art supply store | |
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution | VWR International | 101447-068 |
Clear Packing tape | Any office supply store | |
Needle pulling apparatus | Narashige, Japan | PE-21 |
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube | Kimble chase | 34500 99 |
Pulled glass pipette, made from 5¾” Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A |
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette) | Sigma-Aldrich | A5177-52A |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 |
Tungsten wire, 0.1mm diameter | VWR International | AA10404-H2 |
Needle holders (Nickel-plated pin holder) | Fine Science Tools | 26018-17 |
QCPN antiserum | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | QCPN |
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1) | Invitrogen | A21125 |
Ringer’s Solution (2L):
|
All reagents from Fisher Scientific |
|