Summary
भूखों मरना तकनीक झिल्ली organelles, और subcellular संरचनाओं microinjected अणुओं से प्रभावित ultrastructural आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया गया है. इस विधि / micromanipulation microinjection के शक्तिशाली तकनीक, confocal माइक्रोस्कोपी फ्लोरोसेंट, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जोड़ती बहु nanometer संकल्प मिलीमीटर की अनुमति. इस तकनीक के लिए आवेदनों की एक विस्तृत विविधता के लिए उत्तरदायी है.
Protocol
1. स्तनधारी सेल संस्कृति
- सामान्य चूहा (NRK) गुर्दे, सेल व्यंजन रहते हैं (किसी भी अभिकर्मक के लिए 1 टेबल देखें या चिपका photoetched कांच gridded coverslips पर अमर ग्रीवा कैंसर (HeLa), या अन्य उपयुक्त स्तनधारी कोशिका लाइनों के 37 पर संवर्धित ° सी, 5% सीओ 2, तंत्र इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है) और DMEM + 10% FBS में 1% / कलम Strep. सावधानियों एक बाँझ वातावरण बनाए रखने के लिए जब सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए रखा जाना चाहिए.
- अपने प्रयोगात्मक समय रेखा (0-5 घंटे बनाम 1-2 दिनों के बाद इंजेक्शन) के आधार पर कोशिकाओं के confluency ~ 50% करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए या 25%, क्रमशः ~.
2. Microinjection
- बफर की अपनी पसंद में सेलुलर संस्कृति ज़िम्मा पर निर्भर करता है, ~ 50 μl की एक अंतिम मात्रा के लिए वांछित प्रोटीन, डीएनए, या छोटे अणुओं, तैयार. टेक्सास लाल या Cascade ब्लू के रूप में इस तरह के अक्रिय फ्लोरोसेंट रंजकक्रम में microinjected कोशिकाओं को चिह्नित शामिल, इंजेक्शन डाई और फ्लोरोसेंट जांच के चुनाव को गैर अतिव्यापी उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्य होना चाहिए. microinjection के लिए आवश्यक ब्याज की अणु की एकाग्रता empirically निर्धारित किया जाना चाहिए, और फ्लोरोसेंट ट्रैकिंग रंजक आमतौर पर 0.5-1.0 मिलीग्राम / एमएल में उपयोग किया जाता है. आमतौर पर, rhodamine या किसी अन्य fluorophore covalently ब्याज की अपने अणु एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करने के लिए जुड़ा हुआ है, लेकिन अन्य तरीकों का पता लगाने के संवेदनशीलता के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है. अधिक जानकारी के लिए महत्वपूर्ण विचार नीचे देखें.
- एक 0.22 सुक्ष्ममापी केन्द्रापसारक फिल्टर के माध्यम से (~ 50 μl) injectant फ़िल्टर. केन्द्रापसारक फिल्टर वैक्यूम और / या सिरिंज निस्पंदन है जो मर संस्करणों संबद्ध किया गया है से अधिक पसंद कर रहे हैं.
- Microinjection सुई उत्पन्न, borosilicate ग्लास pipettes एक ज्वलंत ब्राउन micropipette डांड़ी निम्नलिखित निर्माताओं के दिशा निर्देशों का उपयोग कर खींच रहे हैं. वैकल्पिक रूप से microinjectionसुई Eppendorf जो femtotip microinjection सुइयों बनाता सहित विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है.
- ध्यान microinjection Eppendorf 20 Femtotips का उपयोग कर सुई की unmolested अंत में injectant के 4 μl विंदुक. सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले खींच लिया microinjection सुई के भीतर मौजूद हैं. Eppendorf FemptoJet एक औंधा माइक्रोस्कोप जुड़ी Injectman micromanipulator हाथ में microinjection सुई लोड. Microinjection प्रक्रिया की एक अच्छी समीक्षा के लिए पाठक visualized प्रयोगों अनुच्छेद 8 के पिछले एक जर्नल को निर्देश दिया है.
- उल्टे Zeiss माइक्रोस्कोप के पकवान धारक में gridded coverslip और संवर्धित कोशिकाओं के साथ जीवित कोशिका डिश रखें. बढ़ कोशिकाओं एक photoetched ग्रिड के भीतर और अक्षरांकीय पहचानकर्ता ग्रिड ध्यान दें, यह सभी बाद के चरणों में इस्तेमाल किया जाएगा. आदर्श रूप में, coverslip के केंद्र में कोशिकाओं का पता लगाने के रूप में बाद के चरणों coverslip के किनारों पर नमूना हस्तांतरण को सीमित कर देगा.
- मैन्युअल रूप से कम जगह में coverslip पर इंजेक्शन हाथ, और micromanipulator जोस्टिक और नियंत्रण, कम इंजेक्शन सुई का उपयोग कर नीचे तक टिप धीरे संवर्धित कोशिकाओं की सतह और सुई के इस बिंदु से आगे आंदोलन को रोकने के लिए 'प्रेस सीमा को छूता है और इस तरह नाजुक तोड़ने borosilicate ग्लास खींच लिया. सेल microinjection के अन्य सभी पहलुओं के प्रति Eppendorf FemtoJet InjectMan उपयोगकर्ता पुस्तिका के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं. microinjection तकनीक हाल ही में बैक्टीरिया से 9 व्यक्ति secreted डाह प्रोटीन को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- चुना ग्रिड के भीतर हर दूसरे सेल Microinject. कोशिकाओं ~ 50% confluency से बढ़ी, एक ~ 600 सुक्ष्ममापी 2 ग्रिड प्रति 80 कोशिकाओं (उदाहरण के चित्र में दिखाया 3A.) की उम्मीद कर सकते हैं. इसलिए, प्रतिदीप्ति और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी निरीक्षण पर, वहाँ ~ 30-40 प्रयोगात्मक और नियंत्रण कक्ष के एक n होगा.
- जीवित कोशिका पकवान वापस वांछित स्तनधारी सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखेंसमय के रूप में प्रयोगात्मक सेटअप द्वारा तय. वैकल्पिक रूप से, एक सीधे microinjection समय चूक माइक्रोस्कोपी से विश्लेषण करने के लिए आगे बढ़ने के लिए ब्याज की विशेष subcellular संरचनाओं की उपस्थिति निर्धारण करने से पहले का इंतजार कर सकते हैं.
3. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी
- अगर वांछित, जीवित कोशिका microinjected कोशिकाओं के समय चूक प्रतिदीप्ति मापन का प्रदर्शन करने के लिए, जिसके बाद, 0.1 एम cacodylate बफर (7.4 पीएच) में 2.5% glutaraldehyde के साथ मीडिया और जगह के कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. हालांकि, अगर जीवित कोशिका माप की आवश्यकता नहीं कर रहे हैं, सेल विकास मीडिया त्यागें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 5 मिलीलीटर 1xPBS में 3.7% formaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक. लगानेवाला त्यागें और 5 मिलीग्राम 1xPBS के साथ की जगह, 3.2 कदम आगे बढ़ना. नोट: यह glutaraldehyde प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के बाद पूरा हो गया है जब तक नहीं जोड़ के लिए महत्वपूर्ण है.
- एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन में photoetched gridded coverslip साथ पकवान जगह जीवित कोशिका (confocal थी लिए आवश्यक नहीं है) कदम और 5-10 उज्ज्वल क्षेत्र और उपयुक्त ग्रिड फ्लोरोसेंट छवियों को इकट्ठा करने के लिए कक्षों की व्यवस्था (4A छवि) दस्तावेज़. उन कोशिकाओं है कि निष्क्रिय इंजेक्शन डाई (4B छवि) की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्य का उपयोग किया गया microinjected है पहचानें. यह महत्वपूर्ण है कि विभिन्न magnifications (उदाहरण के 10x और 65x) पर छवियों को प्राप्त करने के क्रम में बाद इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से जुड़े कदम में microinjected कोशिकाओं की पहचान की सुविधा.
- एक confocal फ्लोरोसेंट सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, एक ग्रिड के भीतर microinjected कोशिकाओं 2.5 ऊपर चरण में पहचान की Z-ढेर इकट्ठा. उच्च बढ़ाई (100x) की जरूरत है क्रम में subcellular संरचनाओं है कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में पहचाना जाएगा साथ फ्लोरोसेंट छवियों सहसंबंधी.
- coverslips जीवित कोशिका व्यंजन के नीचे से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध coverslip हटाने के तरल पदार्थ के साथ हटा रहे हैं और सेल की ओर एक कुंवारी सेल संस्कृति 5 मिलीग्राम युक्त डिश में रखा1xPBS. coverslip इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए तो संसाधित नीचे के रूप में विस्तृत है.
4. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
- 2 मिलीलीटर 0.1 एम cacodylate बफर (7.4 पीएच) में 2.5% glutaraldehyde साथ 1xPBS बफर बदलें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. अब ऊष्मायन, आवश्यक नहीं है, जबकि subcellular संरचनाओं के रखरखाव में सहायता करेगा. नोट: अकेले formaldehyde EM विश्लेषण के लिए एक पर्याप्त लगानेवाला नहीं है.
- 2 मिलीलीटर 1% 30 cacodylate बफर के साथ तीन washes द्वारा पीछा मिनट के लिए 0.1 एम cacodylate बफर में आज़मियम tetroxide के अलावा के साथ लगानेवाला और दाग कोशिकाओं को हटाने और अंत में DDH 2 ओ के साथ सभी बफर की जगह
- मानक EM प्रोटोकॉल के बाद, इथेनॉल के एक वर्गीकृत श्रृंखला (70% से 100%) में नमूना निर्जलीकरण. EPON राल और जगह सेल पक्ष coverslip एक EPON राल से भरे ट्यूब के शीर्ष पर नीचे तैयार करो. 60 में 24 घंटे के लिए polymerization की अनुमति दें डिग्री सेल्सियस Photoetched gridded coverslip सेल साइड रखने सेEPON राल पर wn, polymerization के दौरान ब्याज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ग्रिड पैटर्न के दोनों कक्षों EPON राल स्थानांतरित कर रहा है (उदाहरण के चित्र में दिखाया 3B.).
- जल्दी से तरल नाइट्रोजन और / या उबलते पानी में डुबो कर EPON राल से coverslips निकालें. राल की सतह का निरीक्षण एक द्विनेत्री विच्छेदन गुंजाइश के तहत ब्याज की ग्रिड (ध्यान दें: ग्रिड द्रुत गति से कहा हुआ वाक्य एक दर्पण छवि के रूप में स्थानांतरण होगा) का पता लगाने के लिए. ऐसी है कि केवल ब्याज की ग्रिड EPON राल ब्लॉक के शीर्ष पर है नीचे एक बाँझ रेजर ब्लेड या स्केलपेल, ट्रिम EPON ब्लॉक का उपयोग.
- एक ultramicrotome का प्रयोग, वांछित मोटाई (~ पारंपरिक और tomographic मंदिर के लिए ~ 250 एनएम मोटाई मंदिर के लिए 70 एनएम मोटाई) में छंटनी की ब्लॉक के धारावाहिक वर्गों के अधिग्रहण. वर्गों uranyl एसीटेट और मानक प्रोटोकॉल का पालन नेतृत्व साइट्रेट के साथ कंट्रास्ट.
5. Correlative लाइट और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
- में ब्याज की कोशिकाओं को स्थानांतरितइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियों का उपयोग कर पहले के चरणों में प्राप्त की. ब्याज की एक बार microinjected कोशिकाओं स्थित किया गया है, उच्च संकल्प confocal फ्लोरोसेंट छवियों का उपयोग सेल कि ब्याज की थे भीतर क्षेत्रों की पहचान करने के लिए. उच्च संकल्प का उपयोग कर मंदिर में इन छवि. सेल परिधि और परमाणु लिफाफा निर्धारित करने के लिए जो फ्लोरोसेंट छवि z ढेर EM टुकड़ा करने के लिए मेल खाती है के रूप में इस तरह के स्थलों का उपयोग करें.
- अपनी पसंद के इमेजिंग प्रोग्राम (जैसे छवि जम्मू, Adobe Photoshop, आदि) का उपयोग करते हुए, 50% फ्लोरोसेंट छवि की अस्पष्टता को कम करने और यह मंदिर छवि जिसके साथ यह संबद्ध पर उपरिशायी. पैमाने (अनुपात विवश याद है) को एडजस्ट करने और confocal मंदिर छवि मैच की छवि के रोटेशन छवियों संरेखित करें. फ्लोरोसेंट छवि में इसके विपरीत, कुशाग्रता, आदि के लिए ठीक समायोजन संरेखण में सहायता कर सकते हैं. नोट: हमने पाया है कि heterochromatin, परमाणु लिफाफा, और सेल परिधि सहायता करने के लिए एक उत्कृष्ट स्थलों का प्रतिनिधित्व करते हैं.दो छवियों के अभिविन्यास में.
6. महत्वपूर्ण विचार
- बहुत इंजेक्शन छोटे अणु का पता लगाने में सहायता करने के लिए, ऐसे rhodamine या Fluorescein के रूप में एक फ्लोरोसेंट टैग covalently व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर संलग्न कर सकते हैं. अतिरिक्त जानकारी ectopically microinjection करने से पहले एक फ्लोरोसेंट subcellular स्थानीयकरण मार्कर प्रोटीन व्यक्त द्वारा प्राप्त की है. इसलिए, fluorophores और निष्क्रिय microinjection ट्रैकिंग डाई का चयन महत्वपूर्ण है.
- चुनें microinjection के लिए कोशिकाओं कि coverslip के केंद्र के पास से पालन कर रहे हैं और एक किनारे करने के लिए करीब ग्रिड चुनने से बचें. यह सबसे बड़ी संभावना है कि ब्याज की कोशिकाओं EPON इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया राल के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं पेश करेंगे.
- मैं कोशिकाओं के Confluencyमहत्वपूर्ण है, के रूप में एक पूरी तरह से सहधारा थाली इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप बहुत मुश्किल में microinjected कोशिकाओं की पहचान कर देगा. बल्कि, बीज कोशिकाओं ऐसी है कि वे एक छोटी प्रयोग के दिन पर ~ 50% confluency तक पहुँचते हैं, या ~ 25% एक लंबे समय तक के दिन (1-2 दिन) प्रयोग पर confluency. स्थिति और कोशिकाओं के आकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उन्मुख करने के लिए स्थलों के रूप में खाली अंतरिक्ष इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि का प्रयोग करें.
- Confocal ऑप्टिकल टुकड़ा मोटाई प्रयोग की जरूरतों के लिए tuned किया जाना चाहिए और इसलिए empirically 10 निर्धारित किया जा चाहिए.
- fixatives formaldehyde और glutaraldehyde उच्चतम ग्रेड के उपलब्ध होना चाहिए. Formaldehyde कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, अभी तक दोनों प्रोटीन और छोटे फ्लोरोसेंट अणु (जैसे rhodamine या FITC रूप) के प्रतिदीप्ति गुणों की रक्षा. हालांकि, यह संरचना उन्हें उच्च संकल्प की अनुमति के लिए सुरक्षित नहीं करेगा. Glutaraldehyde एक उच्च डिग्री करने के लिए झिल्ली और subcellular संरचनाओं analy को बरकरार रखता है EM के लिएबहन, लेकिन काफी प्रतिदीप्ति में बाधा होगी. इसलिए, दो कदम निर्धारण दोनों प्रतिदीप्ति के लिए महत्वपूर्ण है और EM माइक्रोस्कोपी. formaldehyde निर्धारण कदम अगर जीवित कोशिका माप प्रदर्शन छोड़ा जा सकता है, के रूप में अंतिम निर्धारण glutaraldehyde उपचार के द्वारा किया जा सकता है.
7. प्रतिनिधि परिणाम
इस प्रक्रिया यूकेरियोटिक सेलुलर cytoplasm में सीधे ब्याज की एक अणु देने और बहु nanometer संकल्प मिलीमीटर से अपने स्थानीयकरण और / और सेलुलर organeller वास्तुकला पर या प्रभाव की निगरानी करने की क्षमता देता है. प्रयोगात्मक सेटअप और प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध चित्रण चित्रा 2 में दिखाया गया है. इस तकनीक को एक लेजर etched गिलास gridded (छवि 3 ए) coverslip, जो confocal माइक्रोस्कोपी के बाद, EPON राल ब्याज के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ग्रिड पैटर्न के दोनों कक्षों को स्थानांतरित करने में सक्षम है पर विकसित कोशिकाओं के microinjection पर निर्भर करता है (छवि3B).
एक ठेठ microinjection भूखों मरना प्रक्रिया प्रतिदीप्ति छवियों और इलेक्ट्रॉन micrographs, कि जब सहसंबद्ध, दोनों subcellular स्थानीयकरण और ultrastructural विश्लेषण की अनुमति पैदावार. पर विकसित कोशिकाओं एक photoetched कांच gridded coverslip ब्याज की एक अणु है जिसके बाद उज्ज्वल क्षेत्र छवियों प्राप्त कर रहे हैं (4A छवि) के साथ microinjected हैं. एक निष्क्रिय ट्रैकिंग डाई गैर microinjected कोशिकाओं (4B छवि) से microinjected कोशिकाओं को अलग करने के लिए शामिल किया है. Confocal z-ढेर एक fluorophore या अन्य ब्याज की microinjected छोटे अणु (छवि 4C) संलग्न पहचानकर्ता का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. नमूना glutaraldehyde के साथ तय हो गई है और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए कार्रवाई की. इलेक्ट्रॉन micrographs प्राप्त कर रहे हैं और कोशिकाओं को जो वे अनुरूप (छवि 4D) पर मढ़ा. फ्लोरोसेंट संकेत को शरण देने के क्षेत्रों में अधिक से अधिक विस्तार में उच्च वृद्धि पर निरीक्षण कर रहे हैं (छवि 4E
चित्रा 1 microinjection भूखों मरना प्रक्रिया के समय रेखा. प्रयोगात्मक सेटअप के आधार पर, microinjection और प्रतिदीप्ति माप एक ही दिन में किया जा सकता है. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूना तैयार कर सबसे लंबे समय के incubations कदम के लिए समय खपत की वजह से है और 2-3 दिन तक चलेगा. मंदिर विश्लेषण और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों के साथ प्रतिदीप्ति संकेतों correlating एक दिन में किया जा सकता है.
लेजर etched गिलास gridded coverslip पर बढ़ कोशिकाओं का पता लगाने और ब्याज की अणु microinject चरण 2:. दोनों उज्ज्वल क्षेत्र छवियों और confocal microinjected कोशिकाओं फ्लोरोसेंट z-ढेर पर कब्जा चरण 3 2 microinjection भूखों मरना प्रक्रिया की सामान्य चरण 1 चित्रण चित्र: तैयार करनाEM के लिए coverslip विश्लेषण और EPON राल में एम्बेड. हस्तांतरित ग्रिड पैटर्न का उपयोग करना, ब्याज की इस तरह है कि कोशिकाओं को ब्लॉक ट्रिम शीर्ष पर हैं चरण 4: ultramicrotome साथ धारावाहिक वर्गों कट चरण 5: EM छवियों के साथ चित्र फ्लोरोसेंट सहसंबंधी.
. चित्रा 3 ग्रिड पैटर्न ब्याज की कोशिकाओं की पहचान की सुविधा पैनल एक ~ 50% confluency विकसित कोशिकाओं के microinjection दर्शाया गया है, कृपया ध्यान दें ग्रिड पहचानकर्ता एके. स्केल बार 100 सुक्ष्ममापी पैनल बी. स्थानांतरित polymerized EPON राल ब्लॉक पर coverslip कि serially sectioned होने के बाद ब्याज की ग्रिड एक विच्छेदन खुर्दबीन में पहचाना जाता है से ग्रिड पैटर्न से पता चलता है. पैनल सी सेक्शनिंग के लिए तैयार करने में हस्तांतरित ग्रिड पैटर्न से पता चलता है . नोट है कि तबादला ग्रिड बुद - बुदाना राल खंड पर रिवर्स में है, scalई बार 1200 मीटर है.
. चित्रा 4 microinjection correlative प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से प्रतिनिधि परिणाम पैनल NRK एक लेजर etched गिलास gridded coverslip पर बढ़ कोशिकाओं के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोग्राफ से पता चलता है, तीर दो कक्षों कि पैनल में भूखों मरना सीडी के द्वारा visualized हैं संकेत मिलता है पैनल बी प्रतिदीप्ति से पता चलता है. निष्क्रिय ट्रैकिंग डाई की, इस मामले में Cascade ब्लू, लिए कोशिकाओं है कि microinjected गया की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया पैनल सी उज्ज्वल क्षेत्र के उपरिशायी और एक rhodamine लेबल छोटे अणु प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर से पता चलता है. दो यहाँ दिखाया कोशिकाओं पैनलों एक और बी पैनल डी उज्ज्वल क्षेत्र, फ्लोरोसेंट और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के भूखों मरना का प्रतिनिधित्व करता है में तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं, तीर सिर इंगित करता है फ्लोरोसेंट puncta पैनल ई में उच्च वृद्धि पर imaged स्केल सलाखों fol के रूप में कर रहे हैं.lows: A & पैनलों बी, 100 सुक्ष्ममापी, सी और डी, 50 सुक्ष्ममापी, ई, 100 एनएम.
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Discussion
यहाँ प्रस्तुत पद्धति यूकेरियोटिक cytoplasm शुट्ठ प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, या छोटे अणुओं के प्रत्यक्ष वितरण सक्षम बनाता है है और फ्लोरोसेंट और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के संबंध के माध्यम से अल्ट्रा उच्च संकल्प विश्लेषण देता है. इस विधि का उपयोग सरल अभी तक मजबूत है और घर में कई मौजूदा कोर सुविधाओं और / या उचित रूप से सुसज्जित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी प्रयोगशालाओं के साथ किया जा सकता है. तकनीक भी जीना सेल करने के लिए उत्तरदायी है, उपयोगकर्ता वास्तविक समय में fluorescently टैग अणुओं की गतिशीलता पर नजर रखने के लिए और इस प्रकार समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है और tomographic इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए सहसंबद्ध अनुमति.
प्रारंभिक अनुभवजन्य परीक्षण प्रयोग के सभी चरणों में आयोजित किया जाना चाहिए इष्टतम confluency, microinjection दक्षता और fluorophores के injectant अनुकूलन, और इंजेक्शन / ट्रैकिंग डाई (ओं) की उचित मात्रा का वितरण, और उपलब्धता और / इलेक्ट्रॉन माइकर के लिए या विशेषज्ञता निर्धारितoscopy विश्लेषण. भूखों मरना प्रक्रिया के सभी चरणों में सेल इंजेक्शन लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है, और इसलिए यह सिफारिश की है कि coverslip के केन्द्र के निकट एक अक्षरांकीय ग्रिड में बढ़ कोशिकाओं दोनों confocal में संभावना है कि नमूना प्रलेखित किया जाएगा बढ़ाने के लिए चुना जा और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी. ब्याज की कोशिकाओं का पता लगाने में सहायता करने, आसपास की कोशिकाओं के सापेक्ष पदों के रूप में इस्तेमाल किया जा स्थलों EM विश्लेषण के दौरान उचित नमूना का पता लगाने में सहायता करने के लिए किया जाना चाहिए. अंत में, अनुभाग मोटाई वांछित माप के अनुरूप होना चाहिए. ~ 70 एनएम मोटाई का एक धारावाहिक अनुभाग मंदिर के लिए सिफारिश की है, जबकि एक मोटा खंड (~ 250-300 एनएम) EM टोमोग्राफी के लिए सिफारिश की है.
microinjection भूखों मरना तकनीक मुख्य रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है प्रकार III secreted बैक्टीरियल effector प्रोटीन की डिलीवरी अनुकरण और यूकेरियोटिक सेल के subcellular फैटी पर उनके प्रभाव का विश्लेषण. हालांकि, plasticity और ईएएसभूखों मरना द्वारा पीछा microinjection के उपयोग की ई जांच के कई अन्य रास्ते देता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा कर रहे हैं.
Acknowledgments
हम उपयोगी विचार - विमर्श के लिए ऑल्टो प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. हम भी UT दक्षिण मेडिकल सेंटर, विशेष रूप से डॉ. क्रिस Gilpin, टॉम Januszewski, और लॉरी म्यूएलर में तकनीकी विशेषज्ञता और सलाह के लिए सेलुलर और आण्विक इमेजिंग सुविधा धन्यवाद. पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. Xionan दांग धन्यवाद. इस काम NIH अनुदान AI083359 द्वारा NMA समर्थित है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phot–tched Coverslip and Live-cell Plate | MatTek Corp. | P35G-2-14-CGRD | |
| Texas Red | Invitrogen | D3329 | |
| Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | |
| Rhodamine Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53002 | |
| 0.22 μm centrifugal filtration unit | EMD Millipore | UFC30GV00 | |
| Borosilicate Glass Pipettes | Sutter Instrument Co. | BF100-50-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Use program #4 after performing ramp test |
| FemtoJet Microinjection System | Eppendorf | Injectman NI2 | |
| Coverslip Removal Fluid | MatTek Corp. | PDCF OS 30 | |
| Technai Transmission Electron Microscope | FEI | Technai G2 BioTWIN | |
| Ultramicrotombe | Leica Microsystems | EM UC6 |
References
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