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Biology

Beurteilung der GFP Expression und Lebensfähigkeit Mit der Tali Image-Based Cytometer

Published: November 17, 2011 doi: 10.3791/3659

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Lebensfähigkeit der Zellen-und Fluoreszenz-Expressions-Assays mit der Tali Image-Based Cytometer durchzuführen.

Abstract

Single-Zelle und der Bevölkerung Informationen werden in der Regel entweder durch Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie erhalten. Allerdings bieten diese beiden Methoden unterschiedliche Informationen. Die Durchflusszytometrie ermöglicht quantitative multi-parametrischen Informationen über physikalische Eigenschaften und Färbung oder einen Ausdruck, nicht aber für die Visualisierung zu ermöglichen. Stand-alone-Fluoreszenzmikroskopie bietet visuelle Daten, aber nicht für einfache quantitative Messungen 1 zu ermöglichen.

Image-basierte Zytometrie schließt die Lücke zwischen diesen beiden Methoden, so dass die schnelle Visualisierung und gleichzeitige quantitative Analyse von Tausenden von Zellen in heterogenen Populationen 2. Hier stellen wir ein Verfahren zur Durchführung Lebensfähigkeit der Zellen und grün fluoreszierende Protein (GFP)-Expression Assays mit der Tali Image-Based Cytometer 3. Die Tali Instrument ist ein 3-Kanal-(Hellfeld, grüne Fluoreszenz, rote Fluoreszenz) Benchtop-Assay-Plattform, die Offers mehrere Vorteile gegenüber der Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie. Die Tali Zytometer ist weniger teuer, nimmt weniger Platz, weniger wartungsintensiv und die Arbeitsabläufe vereinfacht worden, so dass der Betrieb und die Analyse sehr viel einfacher und schneller ist. Die Tali Zytometer ist der Lage, eine Reihe von Federung zell-basierte Assays, einschließlich GFP und rot fluoreszierendes Protein (RFP) Ausdruck, Apoptose 4-6 und die Lebensfähigkeit der Zellen Analyse mit Propidiumiodid (PI) 7-11.

Hier zeigen wir die Verwendung des Tali Instrument bei der Durchführung einer Lebensfähigkeit der Zellen Assay in Zellen, die GFP. GFP-transduzierten Zellen gefärbt mit der Tali Viability Kit - Dead Cell Red. Die Zellen werden dann in eine Tali Cellular Analysis Slide pipettiert und in das Durchflusszytometer. Hellfeld, rote Fluoreszenz und grüne Fluoreszenz Bilder werden erfasst und analysiert mit Assay-spezifischen Algorithmen. Histogramme werden dann generiert, um Zellgröße, PI fluo-DisplayFluoreszenzintensität und GFP-Fluoreszenz-Intensität. Diese Parameter können dann zu Hause in einem bestimmten Zellpopulation Schwellenwert werden.

Ein Side-by Side-Vergleich der Tali Image-Based Cytometer und traditionelle Durchflusszytometrie zeigt, dass die beiden Methoden vergleichbare Daten über die Lebensfähigkeit der Zellen und Protein-Expression bieten. Allerdings sieht der Tali Instrument zusätzliche visuelle Informationen über die Zellpopulation, die nicht erhalten werden kann mit einem Durchflusszytometer werden.

Protocol

1. Färben von Zellen mit der Tali Viability Kit - Dead Cell Red Reagent

  1. Beginnen Sie diese Prozedur mit U2OS Zellen (American Type Culture Collection), die transduziert wurden mit CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2,0 *. (Hinweis: Es können auch Zellen zentrifugiert und resuspendiert in Medium oder PBS).
  2. Um Flecken abgestorbenen Zellen mit PI, Transfer 100 ul der Zellen, um eine neue Mikrozentrifugenröhrchen. Beachten Sie, dass eine Konzentration von 1 x 05 bis 1 OKTOBER x 10 7 Zellen / ml für diesen Test wird empfohlen, wenn die Konzentration nicht um genau zu sein.
  3. Weiter, um Flecken auf den toten Zellen, fügen Sie 1 ul der PI-basierte Tali Dead Cell Red-Reagenz. Vortex kurz zu mischen. Inkubieren Sie die Tali Dead Cell Red Reagenz und Zelle bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1-5 Minuten.
  4. Nach der Inkubation sofort zur Analyse der Probe fahren auf dem Tali Image-Based Cytometer.

2. Performing a Cell Viability Assay unter Verwendung einesTali Image-Based Cytometer

  1. Die Tali Durchflusszytometer verwendet die Einweg-Kunststoff-Tali Cellular Analysis Folien, die speziell in die Zytometer fit und kann zwei 25 &mgr; l Proben in separaten geschlossenen Kammern (A und B) zu halten. Beim Umgang mit der Folie, achten Sie darauf, halten Sie es an den Seiten.
  2. Um die Folie, Pipette 25 ul der Probe langsam in die halbmondförmige Probe Ladefläche zu laden, wobei darauf zu achten Bildung von Blasen oder zurück Splatter zu vermeiden. Nicht über oder unter zu füllen.
  3. Hier sind Kontroll-Zellen (ungefärbt, nicht-transduzierten) in Kammer geladen A und die Kirchenfenster GFP-exprimierenden Zellen sind in Kammer B geladen Die Kontrollprobe wird dazu beitragen, bestimmen den Grad der Autofluoreszenz bei der Analyse der Daten.
  4. So führen Sie eine Lebensfähigkeit Assay, berühren GFP / RFP auf dem Startbildschirm des Zytometer. Der Test-Optionen werden dann auf der rechten Seite angezeigt. Wählen Sie GFP + Lebensfähigkeit.
  5. Weiter, um den Namen der Probe Serie, drücken Sie Name Now Sie auf Speichern. (Hinweis: Wählen Sie Namen später automatisch einen Namen zuweisen für jede Probe Serie von Datum und Uhrzeit.)
  6. Nach der Benennung der Probe wird die Tali Zytometer automatisch an die Messen Bildschirm zu wechseln. Drücken Sie auf die Registerkarte Hintergrund in der rechten unteren Hälfte des Bildschirms messen.
  7. Als nächstes mit der Kontrollprobe (A) abgewandten Zytometer, legen Sie die Folie in den Verladehafen bis zum Anschlag. Bitte keine Gewalt anwenden.
  8. Vor dem Hintergrund angezeigt wird, drücken Touch New Ungefärbte Cell Control einfügen. Die Folie wird automatisch in die Zytometer gezogen werden und ein Live-Bild der Zellen wird auf dem Bildschirm angezeigt werden.
  9. Mit dem Fokus-Knopf, bringen die Zellen in die richtige Ebene zu sehen. Die Zellen sollten gleichmäßig dunkel mit einem hellen Schein um jede Zelle (Abb. 1, links).
  10. Zelles kann niedrig beziffert, wenn der Übergang zwischen dem Hintergrund und die Ränder der Zellen ist unscharf, so dass Zellgrenzen sind nicht genau definiert (Abbildung 1, Mitte). Zellen können overcounted, wenn sie helle und dunkle Zentren Perimeter (Abb. 1, rechts) haben werden.
  11. Um bessere Sicht der Zellpopulation bei gleichzeitiger Konzentration, schieben Sie die rote Taste, um Zoom-Anzeige 4X oder 16X.
  12. Sobald die Zellen in den Fokus gebracht worden sein, berühren Sie drücken, um Ungefärbte Cell Control Run auf die Hintergrund-Fluoreszenz zu messen.
  13. Der Durchflusszytometer wird automatisch erfassen und analysieren die Bilder von der Probe. Es dauert ca. 1 Minute zu erfassen und zu analysieren, die Bilder in der Standard-(9 Bilder) Modus.
  14. Thumbnails der einzelnen Felder der Ansicht angezeigt werden, wie sie erfasst werden und die Fortschrittsanzeige gibt einen ständigen Aktualisierung. Nach der Aufnahme von Bildern abgeschlossen ist, die Zytometer automatisch ausgeworfen die Folie und stellt die Daten aus der Analyse der aufgenommenen Bilder.
  15. Die gespeicherten Daten werden in dem Dropdown-Menü der Registerkarte Hintergrund am Zytometer angezeigt werden. Der Hintergrund Kontrollprobe den gleichen Namen zugewiesen, das sich auf das Experiment gegeben und wird in dem Dropdown-Menü importiert werden. Hinweis: Wenn ein Hintergrund-Steuerelement nicht ausgeführt wird, das Zytometer automatisch eine Fluoreszenz-Schwelle. Dies kann manuell nach Durchführung des Tests geändert werden.
  16. Zum Ausführen des PI-gefärbten transduzierten Probe, entfernen Sie die Folie aus der Zytometer, drehen Sie sie um und setzen Sie ihn mit den transduzierten Probe abgewandten das Instrument.
  17. Drücken Sie die Probe Reiter und anschließend drücken, um New Musters der Beilage. Wenn das Bild auf dem Bildschirm erscheint, verwenden Sie das Bild Einstellknopf, um die Zellen in den Fokus zu bringen wie zuvor. Berühren Sie dann Drücken Sie, um Beispiel auszuführen.
  18. Nach der Aufnahme von Bildern abgeschlossen ist, werden die Daten aus der Analyse unter der Registerkarte Muster und die Zytometer automatischeVerbündeter wirft die Folie.
  19. Entsprechend der Tali Cellular Analysis Slide als biologisch gefährlichen Abfall entsorgen. Tali Cellular Analysis Dias können nicht wiederverwendet werden.

3. Festlegen von Schwellenwerten und Tore

  1. Sobald die Probe laufen, können Schwellenwerte nun auf die Probe zu Hause in einem bestimmten Zellpopulation angewandt werden. Hier werden wir Schwellenwerte anpassen, um den Prozentsatz von lebenden und toten Zellen in Zellen GFP-transduzierten bestimmen.
  2. Unter der Registerkarte Muster, sind die Anzahl und der Prozentsatz von Zellen, die GFP, lebenden und toten Zellen, die GFP insgesamt Lebensfähigkeit, durchschnittliche Zellgröße, Anzahl der Zellen gezählt und Zellkonzentration angezeigt.
  3. Darüber hinaus sind Histogramm Anzeige Zellgröße, grüne Fluoreszenz, und rote Fluoreszenz (PI) am unteren Rand des Bildschirms angezeigt.
  4. So legen Sie die Größe der Zellen Tor, berühren Sie die Zellengröße Vorschaubild, um die Größe der Zellen Histogramm geöffnet. Während kultivierten Zellen haben nur selten debris, können andere Proben enthalten Trümmer, die größer oder kleiner als die Zellen ist.
  5. So schließen Sie diese Trümmer, schieben Sie die blauen Tasten auf den Schieberegler, um große und kleine Veranstaltungen auszuschließen. Berühren Sie dann auf Übernehmen, um wieder die Daten analysieren und aktualisieren Sie die Ergebnisse.
  6. Weiter, um die GFP-Fluoreszenz zur Analyse hinzuzufügen, berühren Sie die GFP-Histogramm Vorschaubild, um es zu öffnen. Schieben Sie den blauen Balken auf der Schwelle, nur um das Recht der dunkelste Spitze gesetzt, mit der Kontrollprobe als Leitfaden.
  7. Dies ermöglicht die Analyse der GFP-positiven Zellen umfassen, sind jedoch ausgeschlossen autofluoreszierenden Zellen. Autofluoreszenz ist häufig zu beobachten, wenn die biologische Moleküle innerhalb der Zellen angeregt werden.
  8. Berühren Übernehmen, um zu bestätigen und zum vorherigen Bildschirm zurück. Die Daten unter den Sample Registerkarte angezeigt werden soll, zeigt nun den Toren und Schwellenwerte für Fluoreszenz-Kanäle eingestellt.
  9. Als nächstes zur Trennung der PI gefärbten Zellen aus Autofluoreszenz, drücken Sie tEr PI Histogramm Miniaturansicht zu öffnen PI Histogramm.
  10. Auch hier wird die Kontrollprobe Gipfel als graue Gipfel im Histogramm angezeigt werden. Die rote Spitze ist die Probe Fluoreszenz. Die Hintergrund-Fluoreszenz ist als Peak am nächsten an die 0 RFU Wert auf dieser Zytometer angezeigt.
  11. Zur Beseitigung der Hintergrundfluoreszenz in der PI-Kanal, bewegen Sie den blauen Knopf auf den Schieberegler, um die Schwelle anzupassen, um den Gipfel vertreten Hintergrundfluoreszenz auszuschließen, mit dem grauen Spitzen aus der Kontrollprobe als Referenz. Berühren Übernehmen, um zu bestätigen und zum vorherigen Bildschirm zurück.
  12. Weiter, um visuell zu bestätigen, dass jede Zelle korrekt zugewiesen ist, wählen Sie einen gefangenen Sichtfeld für die Überprüfung durch Drücken der Miniaturansicht des Bildes in der Registerkarte Zoom, drücken Sie dann die Registerkarte Layer.
  13. Anschließend drücken Sie die GFP-oder PI-Taste, um das Bild durch die jeweiligen Kanal erfasst Display. Drücken Sie die Taste erneut, um die Schicht aus der Anzeige zu entfernen, oder die Schichten überlagern, berühren Sie die Multiple-Layer-Taste.
  14. Um herauszufinden, wie die Zellen durch einen bestimmten Kanal, berühren Circles gezählt. Die Zellen, die nur durch die Hellfeld-Kanal, der nicht exprimieren Fluoreszenz in blau eingekreist werden gezählt wurden. Dies deutet darauf hin, dass bestimmte Zelle zu leben (dh PI negativ) ist.
  15. Zellen, die GFP wird in den GFP-Kanal zu sehen ist, und wird in grün eingekreist. Tote Zellen mit Dead Cell Red angefärbt wird in der PI-Kanal zu sehen ist, und wird in rot eingekreist.
  16. Cells sowohl in der roten und grünen Kanal gezählt in gelb eingekreist werden, bedeutet dies, dass die Zelle GFP exprimiert, sondern ist auch mit PI gefärbt und somit tot ist.
  17. Gelegentlich schwarze Kreise auf dem Bildschirm erscheinen, werden diese Objekte, die identifiziert wurden, haben aber von der Analyse über die Zellgröße Basis ausgeschlossen.
  18. Weiter zu fine Melodie die Schwelle auf die Fluoreszenz-Histogramm mit der soeben beschriebenen, bis jede Zelle, die Expression Fluoreszenz wird mit der entsprechenden Farbe eingekreist ist.
  19. Alle Analysen werden automatisch unter der Registerkarte gespeichert. Die Tali Zytometer Dateien von rund 500 Probe läuft zu speichern.
  20. Jede Datei in der Registerkarte Daten gespeichert ist für Reanalyse. Durch die Auswahl der Datei aus der Registerkarte Daten wird geöffnet und alle Histogramme und Schichten aktiv zu werden.
  21. So archivieren Sie Daten und Berichte zu generieren, können die Daten im Durchflusszytometer gespeichert werden, um einen Computer mit einem USB-Laufwerk übertragen werden.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Die Tali Image-Based Cytometer wurde verwendet, um das fluoreszierende Protein Expression in Zellen, die mit einem nuklear gezielte GFP BacMam 2.0 Ausdruck konstruieren transduziert wurden zu messen. Vier Vertreter Zelltypen wurden transduziert (U2OS, 293MSR, HEKn und CHO-S).Für diesen Zelllinien wurde die Anzahl der Zellen, die GFP wurden von den Tali Zytometer berichtet und im Vergleich mit Daten aus der gleichen Proben auf einem Durchflusszytometer analysiert. Zusätzlich wurden die Zellen mit Dead Cell Red-Reagenz mit der Tali Viability Kit, um die Toten Zellpopulation sowohl auf der Tali Durchflusszytometer und am Durchflusszytometer identifizieren gefärbt.

Die grafischen Darstellungen in Abbildung 2 zeigen die Prozent der Gesamtbevölkerung für jeden Zelltyp, dass die GFP wurden. Diese Daten zeigen, dass die Tali Zytometer Daten vergleichbar mit Daten, die von einem Durchflusszytometer generiert produziert.

Abbildung 1
Abbildung 1. Cells richtig konzentrieren sollten vor der Analyse. Tali Cellular Analysis Dias mit Zellkonzentrationen geeignet für Analyse (1 x 05 bis 1 Oktober x 10 7 Zellen werden empfohlen). (Links) im-Fokus-Zellen gleichmäßig dArche in der Zelle, mit einem hellen Schein um jede Zelle. (CENTER) Zellen können niedrig beziffert, wenn der Übergang zwischen dem Hintergrund und die Ränder der Zellen fuzzy sind und die Zellen haben undefined Grenzen (RIGHT) Cells vielleicht overcounted, wenn sie hell haben Zentren und dunklen Perimeter.

Abbildung 2
Abbildung 2. Fluorescent Protein-Expression Daten aus dem Tali Image-Based Cytometer ist vergleichbar mit der unter Verwendung der Durchflusszytometrie. A side-by-Side-Vergleich der berechneten GFP-Expression zu 4 verschiedenen Zelllinien in lebenden Zellen.

Discussion

Wir haben gerade ein Verfahren zur Durchführung Lebensfähigkeit zählt und Beurteilung GFP-Expression mit der Tali Image-Based Cytometer detailliert. Nach dem gleichen Verfahren, ist dies Zytometer der Lage, eine Reihe weiterer Tests, einschließlich: Apoptose, RFP und die Lebensfähigkeit der Zellen Analyse unter Verwendung von nicht-transduzierten Zellen.

Fluorometric Assays der Lebensfähigkeit der Zellen, Genexpression und Apoptose sind zu den wichtigsten Methoden in der biomedizinischen Forschung 7-12. In der Vergangenheit getrennte Instrumentierung wurde verwendet, um quantitative und visuelle Informationen über Zellen zu erhalten. Während quantitative Informationen über die Zellen innerhalb einer heterogenen Bevölkerung hat durch den Einsatz der Durchflusszytometrie wurden sammelte, hat Seh-oder qualitative Informationen durch den Einsatz von Fluoreszenz-Mikroskopie 1-4 zusammengetragen. Hier präsentieren wir eine Technologie, die die Lücke zwischen Bevölkerung und einzelne Zelle Studien Brücken. Mit der Tali Image-Based Cytometer, quantitative data und visuelle Zelle Daten über einzelne Zellen oder Zellpopulationen können gleichzeitig erfasst werden. Die Tali Gerät kann für eine Vielzahl von Anwendungen einschließlich der Beurteilung von Genexpression, Apoptose-Assays, Studium der Wirksamkeit von Medikamenten und Beurteilung des Fortschreitens der Erkrankung verwendet werden.

Die Tali Image-Based Cytometer erfasst und analysiert Hellfeld, rote Fluoreszenz und grünen Fluoreszenz-Bildern, so dass Informationen über Subpopulationen von Zellen zu erhalten. Zum Beispiel in diesem Test konnten wir tote Zellen von lebenden Zellen innerhalb der GFP-exprimierende Zellpopulation mit Dead Cell Red Farbstoff zu unterscheiden. Dies ermöglicht eine Genauigkeit bei der Messung an lebenden Zellen, die GFP, und identifiziert die Population von Zellen, einsetzbar für Downstream-Processing. Es ist wichtig zu beachten, dass die toten Zellen in der Bevölkerung könnten aus verschiedenen Quellen, einschließlich der normalen Zelltod in der Kultur oder der Zelltod durch Umgebungsbedingungen (zB Trypsinierung oder de verursacht wurde,ath hervorgerufen durch die Transfektion / Transduktion gewählten Methode).

Hier zeigen wir die Verwendung des Tali Zytometer mit U2OS Zellen. Ähnliche Verfahren können durchgeführt unter Verwendung der meisten Säuger-und Insektenzellen werden. Für jede Zelllinie produziert die Tali Zytometer quantitative GFP-Expression Daten, die nicht mit einer visuellen Inspektion der Zellen mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop möglich. Obwohl diese Ergebnisse vergleichbar mit der Durchflusszytometrie sind, werden sie in einem Bruchteil der Zeit gesammelt. Das Durchflusszytometer ist in der Lage genau zu zählen Zellen zwischen 5 um bis 60 um im Durchmesser, idealerweise in einer Konzentration von 1 x 5 bis 1 Oktober x 10 7 Zellen / ml.

Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, dass die meisten Standard-Färbeprotokollen, einschließlich der Dead Cell Red Färbeprotokoll hier beschriebenen Nutzung Propidiumiodid zu lebenden und toten Zellen zu unterscheiden. Dies stellt eine Herausforderung bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit in Zellen, die für st wurden permeabilisiertaining intrazellulärer Marker, da PI wird jede Zelle mit einem kompromittierten Membran Fleck. Da jeder Fluoreszenzfarbstoff oder Protein, das mit dem grünen oder roten Fluoreszenz-Kanäle nachgewiesen werden kann auf der Tali Image-Based Durchflusszytometer analysiert werden kann, zukünftige Studien untersuchen den Einsatz von alternativen Farbstoffen, wie Amin reaktiven Lebensfähigkeit Farbstoffe vier. Eine 2006 durchgeführte Studie von Perfetto et al. 12 fand diese Farbstoffe einfach zu bedienen sein und reproduzierbare in anspruchsvollen lebenden und toten Zell-Populationen.

Beachten Sie, dass die Tali Grenzen hat in Bezug auf die Arten von Tests es leisten kann. Zum Beispiel, weil das Ziel durch das Instrument verwendet wird 4X, sind Zähloperationen größere Zelltypen beschränkt: sub-zellulären Strukturen wie Mitochondrien oder Vesikel und Bakterienzellen nicht quantifiziert werden können. Beachten Sie auch, dass der Nachweis Kanäle in Tali, um Fluorophore, die begeistern und emittieren innerhalb der Kanäle begrenzt sind. Während YFP und helles mCherry Signale cein erkannt werden, können Dimmer mCherry Signale nicht. Schließlich ist die Tali nur Analysen Zellen in Suspension. Es wird nicht genau zählen haftenden Zellen auf einen Objektträger. Darüber hinaus, während es nur eine begrenzte Fähigkeit zum Zählen Zellen, die unregelmäßig geformt sind, darunter auch einige Hefe und Primärzellen bewirkt.

Darüber hinaus werden zukünftige Studien wahrscheinlich auf die Verwendung dieses Systems bei der Beurteilung der Expression von intrazellulären Markern. Individuelle Farben können für spektrale Überlappung mit benachbarten Kanälen, mit Invitrogen Online SpectraViewer Werkzeug (überprüft werden www.invitrogen.com / spectraviewer ). Angesichts der Neuheit dieser Technologie hat die gesamte Palette der Anwendungen noch zu entdecken gilt.

Zusammenfassend zeigten die Tali Image-Based Cytometer hier präsentiert eine neue Technologie, die für die gleichzeitige Visualisierung und Analyse von Zell-Populationen ermöglicht, wodurch Beurteilung einzelner Zellen sowie cell Populationen in einem kompakten Format mit einem einfachen Workflow.

Disclosures

Krissy Remple und Laurel Stein sind die Mitarbeiter von Life Technologies, der das Instrument in diesem Artikel verwendeten produziert. Life Technologies hat die Produktion dieses Video-Artikel gesponsert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tali Image-Based Cytometer Invitrogen T10796
Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides Invitrogen T10794
Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides Invitrogen T10795
Tali Viability Kit - Dead Cell Red Invitrogen A10786
Tali Viability Kit - Dead Cell Green Invitrogen A10787
Tali Apoptosis Kit Invitrogen A10788
U2OS cells

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References

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Cite this Article

Remple, K., Stone, L. Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer. J. Vis. Exp. (57), e3659, doi:10.3791/3659 (2011).More

Remple, K., Stone, L. Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer. J. Vis. Exp. (57), e3659, doi:10.3791/3659 (2011).

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