Summary
Le poisson zèbre représente un précieux modèle pour étudier les mécanismes de la régénération cardiaque chez les vertébrés. Ici, nous présentons un protocole pour l'induction d'un infarctus cardiaque chez le poisson zèbre adulte en utilisant cryoinjury. Cette méthode aboutit à une mort cellulaire massive au sein de 20% de la paroi ventriculaire, similaire à celle observée dans les infarctus de mammifères.
Abstract
Le coeur de mammifère est incapable de régénération importante suite à une blessure aiguë comme un infarctus du myocarde 1. En revanche, les amphibiens urodèles et les poissons téléostéens conserver une capacité remarquable pour la régénération cardiaque avec peu ou pas de cicatrices long de la vie 2,3. On ne sait pas pourquoi seuls certains vertébrés non mammifères peuvent recréer un organe complet, à partir de tissus résiduels 4,5. Pour comprendre les différences moléculaires et cellulaires entre des réactions de régénération des espèces différentes, nous avons besoin d'utiliser des approches similaires pour induire les lésions aiguës.
Chez les mammifères, le modèle le plus fréquemment utilisé pour étudier la réparation cardiaque a été une ischémie aiguë après une ligature de l'artère coronaire ou la destruction des tissus après cryoinjury 6,7. La régénération cardiaque chez les tritons et de poisson-zèbre a été principalement étudiée après une résection partielle de l'apex du ventricule 2,3. Récemment, plusieurs groupes ont établished la technique cryoinjury à 8-10 poisson zèbre adulte. Cette méthode a un grand potentiel, car elle permet une discussion comparative des résultats obtenus à partir des espèces de mammifères et non mammifères.
Ici, nous présentons une méthode pour induire une reproductible en forme de disque infarctus du ventricule poisson zèbre par cryoinjury. Ce modèle est basé sur des blessures rapide de congélation-décongélation des tissus, ce qui entraîne une mort cellulaire massive d'environ 20% des cardiomyocytes de la paroi ventriculaire. Tout d'abord, une petite incision a été faite à travers la poitrine avec des ciseaux iridectomie pour accéder au cœur. La paroi ventriculaire a été directement congelé en appliquant des 23-25 secondes, un cryosonde acier inoxydable prérefroidi dans l'azote liquide. Pour arrêter la congélation de l'eau du poisson cœur, à la température ambiante a été larguée sur la pointe de la sonde cryogénique. La procédure est bien tolérée par les animaux, avec un taux de survie de 95%.
Afin de caractériser le processus de régénération, les cœurs étaientprélevés et fixés à des jours différents après cryoinjury. Par la suite, l'échantillon ont été embarqués pour cryosectioning. Les diapositives avec des sections ont été traitées pour l'analyse histologique, l'hybridation in situ et d'immunofluorescence. Cet engagement renforce notre compréhension des facteurs qui sont nécessaires pour la plasticité de régénération chez le poisson zèbre, et de fournir de nouveaux aperçus sur les mécanismes de la régénération cardiaque. Une compréhension conceptuelle et moléculaire de la régénération cardiaque chez le poisson zèbre aura un impact à la fois la biologie du développement et de la médecine régénérative.
Protocol
1. Equipement Set-up
- Le principal outil utilisé pour effectuer cryoinjury est la cryosonde, l'instrument en forme de stylo qui est faite d'acier inoxydable (figure 1A). La poignée cylindrique est de 40 mm de long et a un diamètre de 8 mm. La pointe de l'applicateur est de 6 mm de long et 0,8 mm de diamètre. La jonction entre la pointe et la poignée est conique 4 mm de long. En outre, la poignée de la sonde cryogénique doit être isolé avec un tube en plastique et du ruban adhésif pour éviter les engelures des doigts tout en maintenant l'outil lors de la procédure.
- D'autres matériaux qui sont nécessaires pour la cryochirurgie sont un stéréomicroscope, pince tranchants, ciseaux à ressort micro dissection et d'une pipette de transfert en plastique. En outre préparer un bécher d'anesthésier le poisson et une cuillère en plastique pour le transfert des poissons.
- Pendant la chirurgie, les poissons sont placés sur une éponge humide avec sa place face ventrale (figure 1B). Pour tenir l'animal dans une procédure stable, unerainure appropriée devrait être coupées manuellement dans l'éponge.
- Préparer un réservoir avec de l'eau du système de transférer le poisson après la chirurgie.
- Mettre en place un timer premier double avec un compte à rebours 10 secondes et ensuite automatiquement un compte à rebours 24 secondes.
2. La procédure Cryoinjury
- Refroidir la cryosonde par immersion de la pointe dans 3-5 cm de l'azote liquide pendant au moins 3 min.
- Anesthésier une poisson-zèbre adulte par elle immerger dans 0,02% tricaïne jusqu'à ce que le poisson tourne sur son dos et ses branchies presque arrêter de bouger (environ 90 secondes).
- Transférer le poisson avec une cuillère en plastique pour une éponge humide qui a été coupé de tenir un poisson à l'envers (figure 1B). Tenez le poisson régulière avec une pince à l'aide la main non dominante. Localiser visuellement la marge postérieure médiane du cœur et d'utiliser des ciseaux iridectomie droits pour perforer la peau. (Figure 1C).
- Faire un petit (env. 2 mm) incision au-dessus du coeur par cutting droite vers l'avant à travers la peau, les muscles (figure 1D). Ne pas couper à travers l'appareil osseux branchiale, car cela va tuer l'animal.
- Doucement déchirer la couche argentée épithéliale de l'hypoderme (figure 1E) avec la pointe des ciseaux pour avoir un accès direct au ventricule battant. Ne pas insérer les ciseaux plus profondément dans la cavité du corps, que cette ponction la volonté du cœur. Le cœur battant doit être bien visible, et aucun saignement de grande envergure devrait se produire au cours de la thoracotomie (figure 1F).
- Démarrer la minuterie programmée qui a été fixé à 10 secondes, suivi par 24 secondes. Pendant 10 secondes retirer la sonde cryogénique de l'azote liquide. Assurez-vous qu'il n'y a pas plus d'azote sur la cryosonde en le secouant doucement. Fais l'incision latéralement en utilisant une pince pour ouvrir le coffre (figure 1F).
- Une fois que le minuteur sonne 10 secondes, toucher immédiatement, mais doucement le ventricule avec la pointe de la pre-refroidi cryosonde (Figure 1G).
- Une fois que le minuteur sonne 24 secondes, versez 2-3 ml d'eau du système à l'aide d'une pipette en plastique sur la poitrine pour libérer le cryosonde à partir de tissus, et de transférer le poisson dans le réservoir avec de l'eau du système.
- Le poisson doit relancer la respiration après quelques secondes, puis il devrait reprendre la natation. Si elle ne respire pas, après environ 45 secondes, à stimuler l'animal en injectant de l'eau dans les branchies avec une pipette en plastique jusqu'à ce qu'il commence à respirer par lui-même. Dans notre expérience, 95% des poissons survivent la chirurgie, et tous les décès se produisent le jour de la chirurgie. Il ne sera pas nécessaire de suturer les incisions.
3. Collection Coeur et la fixation des
- Préparer 1 ml de formol à 2% dans un microtube pour la fixation du cœur, deux pinces, micro-dissection des ciseaux et l 'éponge humide fendue.
- À la date choisie après cryoinjury, euthanasier les poissons dans 0,1% tricaïne pendant 5 minutes.
- Placez lepoissons face ventrale vers le haut dans un sol humide, une éponge fendue. Faire une grande (environ 4 mm) incision au-dessus du cœur à travers le cartilage branchial avec les ciseaux micro dissection. Ouvrez largement l'incision avec une pince (Figure 1H).
- Pincez le bulbe artériel, une structure blanche antérieure au ventricule (figure 1 HI), et retirer le coeur de la cavité en le tirant. Un cœur tout entier disséqué est montré dans la figure 1J et la figure 2A.
- Placez un maximum de 3 coeurs dans un microtube avec 1 ml de formol à 2%. Tournez doucement le tube à plusieurs reprises et le garder une nuit à 4 ° C.
4. Coeur de montage
- Rincer les cœurs dans du PBS pendant 5 minutes. Transfert des coeurs dans 10 ml de saccharose à 30% qui devrait être pré-refroidi à 4 ° C, et mélanger doucement. L'échantillon doit d'abord flotter à la surface de la solution de saccharose. Continuer d'incubation de 1 heure 20 minutes à 4 ° C. Aprèscette fois, les cœurs vont tomber au fond du tube.
- Préparer une boîte avec de la glace sèche. Prendre un moule enrobage, et verser une couche de 5 mm de milieu de montage octobre au fond du moule.
- Avec des pinces placer le coeur dans le T OC milieu de montage dans le moule. Au microscope stéréoscopique, ajuster l'orientation de l'échantillon pour atteindre le sommet ventriculaire sur le fond du moule, et le bulbe artériel vers le haut.
- Placez les moules avec le spécimen sur glace sèche. Lorsque le milieu de montage commence à geler, remplir le reste du moule avec le milieu PTOM et le laisser geler complètement. Maintenir le moule pendant au moins 1 h à 80 ° C avant la coupe. Le spécimen congelé peut être conservé pendant plusieurs mois à -80 ° C.
5. Coeurs de sectionnement
- Mettre en place un cryostat avec une taille de coupe de 16 um, une température de la chambre de -24 ° C et la température de l'échantillon à -22 ° C.
- Placez le bloc congelé à laspécimen dans le cryostat et fixer l'orientation de commencer la coupe parallèle au fond du bloc.
- Préparer six Superfrost-plus lames par un bloc et les numerate 1 à 6. Commencer à couper le tissu jusqu'à ce soit atteinte, et couper le bloc autour de l'échantillon avec une lame de rasoir.
- Pour obtenir 6 répétitions d'un seul cœur, prendre la première section de la diapositive 1, la deuxième section sur la diapositive 2, le troisième sur la diapositive 3, etc Une fois que vous avez placé la sixième section de la diapositive 6, redémarrer avec la diapositive 1 et continuer jusqu'à ce que le organe entier est coupé. Recueillir des deux rangées de près 8 articles sur le coulisseau (figure 3).
- Laissez-les diapositives sec pendant 1 heure à température ambiante. Conservez-les pour un maximum de 1 an dans des boîtes hermétiquement fermées à -20 ° C.
6. Les résultats représentatifs
Représentant un accident cardiaque à la suite de ce protocole est indiqué dans disséqués coeurs entiers à 4 dpci (cryoinjury jours après; figure 2D-F). Pour visualize le tissu du myocarde in vivo, on utilise du poisson transgénique exprimant la EGFP et DsRed2 nucléaire sous le contrôle d'spécifiquement cardiaque CAGC-2 promoteur 11,12. L'absence de EGFP et DsRed2 signaux fluorescents délimité une zone de l'infarctus en forme de disque le long de la paroi ventriculaire apicale-latérale.
Pour effectuer des analyses cellulaires et moléculaires du tissu, les cœurs étaient fixes et sectionné avec un cryostat. Une diapositive représentant avec une série consécutive de sections transversales de coeur est illustré à la figure 3.
Les sections peuvent être analysées par des méthodes différentes (figure 4). Pour déterminer l'étendue de la régénération cardiaque par rapport à la cicatrisation, nous avons effectué une analyse histologique en utilisant fuchsine acide Orange-G (AFOG) coloration, qui marque de manière différentielle les tissus cardiaques et de fibrose 9. Les analyses d'expression génique ont été réalisés conformément à la procédure en hybridation in situ
Figure 1. Induire cryoinjury du ventricule chez le poisson zèbre adulte. (A) Une photographie de la cryosonde. (B) Un poisson-zèbre adulte est placé dans la fente de l'éponge avec son côté ventral vers le haut. Incision thoracique (FC) pour accéder au cœur. (C) Une petite incision à travers la peau et les muscles est faite entre les deux nageoires pectorales (ligne rouge). (D) Les ciseaux sont insérés dans l'incision pour couper la peau suivant la flèche rouge. (E) sous la peau, la fine couche de l'hypoderme argentée (encerclée par la ligne pointillée bleue) est légèrement ouvert pour accéder au cœur. (F) L'incision est répartie avec lepince et le ventricule battant (flèche verte) est accessible pour cryoinjury. (G) La cryosonde froid est délicatement inséré dans la poitrine pour toucher le cœur. Collecte de coeur (HJ). (H) Une incision profonde et longue est faite à travers les arcs branchiaux de la poitrine pour accéder à la cavité péricardique. Deux structures cardiaques sont visibles: bulbe artériel (flèche blanche) et le ventricule (flèche verte). (I) Le bulbe artériel est de tenir avec une pince et tiré hors de la cavité du corps. (J) La coeur entier est excisé à partir du corps.
Figure 2. De contrôle représentant et les cœurs cryoinjured disséqués à partir poisson-zèbre transgénique exprimant la EGFP et adultes DsRed2 nucléaire dans les cardiomyocytes. (AC) indemne coeur. (A) L'éclairage en champ sombre montre le ventricule (V), bulbe artériel (Ba, blanc) et les soupapes (Va), où l'atrium a été liée au ventricule. (B et C) des images fluorescentes de t il intacte EGFP affichage ventricule et DsRed2 expression dans les cardiomyocytes. (DF) Coeur à 4 jours après cryoinjury (4 dpci) (D) L'éclairage en champ sombre révèle un infarctus en forme de disque (ligne jaune discontinue). (EF) des cardiomyocytes marqueurs EGFP et DsRed2 ne sont pas détectées dans la zone du myocarde, indiquant l'endommagé myocarde (entouré par la ligne en pointillés).
Figure 3. Sectionnement du cœur. (A) de tout cœur avec le dessin de sections transversales à partir du bas du coeur (1 et 2, en rouge) vers le haut du cœur (3 et 4 en vert). (B) Photographie d'une lame avec la série de sections transversales consécutives colorées avec AFOG (fuchsine acide Orange-G). Les premières sections (1 et 2, carrés rouges) contiennent de l'apex du ventricule, et les dernières sections du cœur (3 et 4, des carrés verts) comprennent bulbe artériel.
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Exemples Figure 4. De l'analyse effectuée sur des sections de coeur à 7 jours après cryoinjury. (A) AFOG (fuchsine acide Orange-G) des étiquettes de coloration des cellules musculaires saines en orange, le tissu cicatriciel contenant du collagène en bleu et en rouge la fibrine. (B) L'hybridation in situ de la chaîne lourde de myosine ventriculaire (vmhc) ARNm visualise l'état intact du myocarde (coloration au bleu). Le tissu lésé est dépourvue de la transcription génique cardiaque (rouge pointillé). (C) Immunoassaying de la tropomyosine (vert) qualifie cardiomyocytes intacts et non des tissus endommagés (encerclée avec la ligne pointillée). DAPI (bleu) taches les noyaux de toutes les cellules. (D) cardiomyocytes génétiquement marqués expresse DsRed2 (rouge) dans leurs noyaux. DAPI (bleu) qualifie tous les noyaux. La zone d'infarctus ne contient pas de cellules positives DsRed2 (ligne blanche pointillée).
Discussion
Cryoinjury est défini comme le dommage contrôlée de tissu par l'application précise de 14 froid. Direct choc thermique détruit les cellules par la destruction des protéines et par la formation de glace intracellulaire de cristal liquide qui rompt la membrane plasmique. Par conséquent, les cellules lésées meurent dans les processus de l'apoptose et la nécrose 14. Ces deux mécanismes de mort cellulaire a été démontré que de contribuer à la perte de tissu après un infarctus du myocarde 15. Ainsi, cryoinjury représente un modèle approprié d'induire un infarctus cardiaque. Plusieurs études ont rapporté cette méthode bien prouvé dans divers mammifères, y compris les souris, rats, lapins et porcs 6,7. L'adaptation du protocole cryoinjury chez le poisson zèbre permet une discussion plus comparative sur la réponse du myocarde entre les différentes espèces.
Deux autres groupes développés de façon indépendante la procédure cryoinjury pour le cœur du poisson zèbre adulte. Les principales différences sont la surméthodes chirurgie, le type d'outils et appliquée temps de congélation. Dans l'étude de González-Rosa et al., Le péricarde a été ouverte par la déchirure du tissu au lieu de couper. Ils ont utilisé 0,3 mm filament de cuivre relié à un tube de polyamide pré-refroidi dans l'azote liquide pour geler le cœur pendant quelques secondes jusqu'à ce que le dégel a pu être observée 10. Dans l'étude de Schnabel et al., Une pièce conique de la glace sèche de 20 mm de longueur avec une pointe de 2 mm dans son diamètre a été utilisé pour toucher le cœur pendant 10 secondes 8. Les deux groupes obtenu dommages ventriculaire par la mort du myocarde. L'avantage de notre méthode est un dépôt plus reproductible de riche en collagène cicatriciel, qui imite mieux les premières réponses de guérison infarctus observés dans les systèmes mammaliens.
L'étape critique lors de la procédure cryoinjury chez le poisson zèbre est une incision à travers la peau et le péricarde sans perforer le coeur sous-jacente. Un correctement performela chirurgie d provoque des saignements peu. Saignement abondant indique une ponction accidentelle du ventricule avec des ciseaux. Dans de tels cas, les animaux doivent être rentrés de l'expérience. Pour éviter de percer le cœur, le point de ciseaux doit être destiné à un angle faible de la peau.
Un autre aspect important pour la création d'une blessure reproductible est le positionnement exact de la cryosonde froid sur le ventricule pendant la durée optimale précise. Trop court temps de congélation se traduira par une inflammation à la mort cellulaire peu. Congélation prolongée, d'autre part, peut causer des dommages importants du cœur, ce qui peut conduire à une mortalité accrue des animaux. Nous avons déterminé que le meilleur moment pour tenir le ventricule dans les gammes de l'état congelé entre 23-26 secondes pour un 2 cm de long poisson zébré adulte, et peuvent donc différer dépendamment de la taille des animaux.
Parce que notre protocole est très simple et rapide, il n'ya pas de limite expérimentaletions à soumettre un nombre suffisant d'animaux pour obtenir des réplications biologiques adéquats. Le traitement de cryochirurgie est très bien tolérée par les animaux. Collection des cœurs à différents moments après cryoinjury permet la caractérisation détaillée des phases ultérieures au cours du processus de régénération. L'analyse expérimentale des coeurs cryoinjured peut comprendre 1) visualisation de la transcription des gènes par hybridation in situ, 2) la détection de la distribution des protéines par immunofluorescence, 3) l'imagerie histologique des structures différentes. Comprendre les processus de guérison clés après un infarctus du myocarde chez le poisson zèbre aura un impact sur le domaine de la biologie régénérative. En outre, il pourrait être bénéfique pour la conception de nouvelles approches thérapeutiques en médecine régénérative.
Disclosures
La recherche expérimentale sur les animaux a été approuvé par le bureau de vétérinaire cantonal de Fribourg.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier V. Zimmermann pour l'assistance technique excellente et pour les soins de poissons. Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse de la science, numéro d'obtention: 310000_120611.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds - Truncated Molds T8 | Polysciences, Inc. | 18985 |
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