Cryoinjuryを使用した大人のゼブラフィッシュにおける心筋梗塞の誘発

Summary

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の心臓再生のメカニズムを研究する貴重なモデルを表しています。ここでは、cryoinjuryを用いた成体ゼブラフィッシュの心臓梗塞の誘導のためのプロトコルを提示します。哺乳類の脳梗塞で観察されたものと同様の心室壁の20％以内の大規模な細胞死では、このメソッドの結果、。

Abstract

哺乳類の心臓は、心筋梗塞¹などの急性損傷後の重要な再生が不可能です。対照的に、有尾類、両生類と硬骨魚の魚はほとんど、あるいはまったく生活^2,3にわたって瘢痕化した心臓の再生のための驚くべき能力を保持します。唯一のいくつかの非哺乳類の脊椎動物は^4,5残留組織からの完全な臓器を再作成することができますなぜそれが知られていません。異なる種の再生応答の間に分子や細胞の違いを理解するために、我々は急性の傷害を誘導するための同様のアプローチを使用する必要があります。

哺乳類では、心臓の修復を研究するために最も頻繁に使用されるモデルは、cryoinjury ^6,7後の冠状動脈や組織破壊の結紮後、急性虚血されています。イモリとゼブラフィッシュの心臓再生は、主に心室尖部^2,3の一部を切除した後に検討されている。最近、いくつかのグループがestablている大人のゼブラフィッシュの^8-10のcryoinjuryテクニックをished。それは、哺乳動物及び非哺乳動物種から得られた結果の比較検討することができますので、このメソッドは、大きな可能性を秘めている。

ここでは、cryoinjuryによるゼブラフィッシュの脳室の再現性の円盤状の梗塞を誘導する手法を提案する。この損傷モデルは、心室壁の心筋細胞の約20％の大規模な細胞死をもたらす急速凍結融解組織に基づいています。まず、小切開は、心臓にアクセスするには虹彩切除術をハサミで胸を介して行われました。心室壁は、直接23から25秒間液体窒素で冷却しステンレス製のクライオプローブを適用することにより、凍結した。心臓の凍結を停止するには、室温での魚の水は、クライオプローブの先端に削除されました。手順については、よく95％の生存率は、動物によって許容されています。

再生過程を特徴づけるために、心があったcryoinjury後、別の日に収集し、修正しました。その後、試料は凍結セクショニングのために埋め込まれていた。セクションを含むスライドがin situハイブリダイゼーションと免疫には 、組織学的分析のために処理した。この事業は、ゼブラフィッシュでの再生可塑性に必要であり、心臓再生の機械に新たな洞察を提供している要因の我々の理解を向上させます。ゼブラフィッシュの心臓再生の概念と分子的理解は、発生生物学と再生医学の両方に影響を与えます。

Protocol

1。機器のセットアップ

1. cryoinjuryを実行するために使用される主なツールは、クライオプローブ、ステンレス鋼（ 図1A）で作られてペン状の器具のことです。円筒形のハンドルは長さ40ミリメートルで、8ミリメートルの直径を有する。アプリケーターの先端は6長さmm、直径0.8 mmである。先端とハンドルの間の接合部は長い円錐形の4ミリメートルです。さらに、クライオプローブのハンドルは、手順の中でツールを保持しながら、指の凍傷を避けるために、プラスチックチューブ、テープで絶縁する必要があります。
2. 凍結手術に必要な他の材料は実体顕微鏡、鋭いピンセット、ミクロ解剖春のはさみやプラスチックピペットです。さらに、魚や魚を転送するためのプラスチックスプーンを麻酔用ビーカーを準備します。
3. 手術中に、魚は、その腹側のアップ（ 図1B）と湿ったスポンジに配置されています。 、安定した手順で動物を保​​持する適切な溝は、手動でスポンジにカットする必要があります。
4. 手術後に魚を転送するために、システムの水タンクを準備します。
5. 10秒カウントダウンして、自動的に24秒のカウントダウンで最初の二重タイマーを設定します。

2。 Cryoinjury手順

1. 少なくとも3分間液体窒素の3-5 cmの先端部を浸漬することにより、クライオプローブの冷却。
2. 魚はその背中をオンにし、その鰓がほとんど（約90秒）の移動が停止するまで0.02パーセントtricaineでそれをimmergingで大人のゼブラフィッシュを麻酔。
3. （ 図1B）逆さまに魚を保持するためにカットされている湿ったスポンジにプラスチックのスプーンで魚を転送します。非利き手を用いた鉗子でしっかりと魚を保持します。視覚的に心臓の後内側縁を見つけて、穿刺肌をまっすぐに虹彩切除術のはさみを使用しています。 （ 図1C）。
4. cuで心臓の上に小さな（約2 mm）の切開を行う皮膚、筋肉（ 図1D）ストレート前方にtting。これは動物を殺すように、骨の鰓装置を介して切断しないでください。
5. 優しく叩い心室への直接アクセスを持っているハサミの先端で皮下の銀色の上皮層（ 図1E）を引き裂く。この意志穿刺中心として、体腔内に深くはさみを入れないでください。心臓の鼓動はよく見えるべきであり、広範な出血は開胸術（ 図1F）中に発生するべきではありません。
6. 24秒、続いて10秒に設定されているプログラムタイマーを起動します。 10秒間液体窒素からクライオを取り出します。軽く振ってクライオにはより多くの窒素が存在しないことを確認してください。胸（ 図1F）を開くために鉗子を用いて横方向に切開を広げた。
7. PRの先端を心室タイマーが鳴る10秒に1回、すぐに触れなく優しく電子冷却クライオ（ 図1G）。
8. 24秒タイマーが鳴るしたら、組織からクライオを解放し、システムの水をタンクに魚を転送するために胸の上にプラスチック製のピペットを使用して、システムの水の2-3 mLを注ぎます。
9. 魚は数秒後に呼吸を再起動する必要がありますし、それは、水泳を再開する必要があります。それは約45秒後に息をしない場合は、それ自体が呼吸を開始するまで、プラスチック製のピペットを用いて鰓に水を噴出することによって動物を刺激する。我々の経験では、魚の95％が手術を生き残る、すべての死亡は手術の日に発生します。それは切開を縫合する必要はありません。

3。ハートコレクションおよび固定

1. 心臓、二つの鉗子、マイクロ解剖はさみと湿った溝スポンジを固定するためのマイクロ遠心チューブにホルマリン2％の1 mLを準備します。
2. cryoinjury後、選択された日で、5分間、0.1％tricaineの魚を安楽死させる。
3. 配置まで湿った、溝スポンジに魚腹側。ミクロ解剖ハサミで鰓軟骨を介して心臓、上記大（約4 mm）の切開を行います。鉗子（ 図1H）で広く切開を開きます。
4. 動脈球、心室の前方に白い構造（ 図1 HI）をピンチオフし、それを引いて空洞から心臓を削除します。全体の解剖心臓は図1J、図2Aに示されています。
5. ホルマリン2％1mlのマイクロ遠心チューブに3心まで置きます。穏やかにチューブを数回回して4℃で一晩おく℃、

4。マウントハート

1. 5分間、PBS中の心を洗い流してください。 4℃で予冷されるべき30％ショ糖の10 mLに心を移し、軽く混ぜ合わせます。試料は最初にショ糖溶液の表面に浮く必要があります。 4℃で1時間20分間インキュベーションを続ける後のこの時間は、心がチューブの底に沈んでしまう。
2. ドライアイスボックスを準備します。埋め込み型を取り、金型の下部10月封入剤の5mmの層を注ぐ。
3. 鉗子でOC Tは金型内でメディアをマウントするに心を置きます。実体顕微鏡下で、モールドの底部に心室尖部を達成するために、試料の向きを調整し、動脈球上に向かって。
4. ドライアイス上で検体と金型を配置します。封入剤は、凍結を開始したときに、OCT培地で金型の残りの部分を埋める、それが完全に凍結しましょう​​。セクショニングの前に-80℃で少なくとも1時間金型を保持します。凍結検体は-80℃で何ヶ月も保存することができます

5。セクショニングハーツ

1. 16μmのカットサイズ、-24°Cの槽内温度と-22℃で試料の温度とクライオスタットを設定します。
2. で凍結ブロックを置きクライオスタットの試料ブロックの底面に平行に切断を開始し、その方向を修正します。
3. 1ブロック当たり6 Superfrostプラススラ​​イドを準備し、1から6にそれらを列挙する。組織に到達するまで、切断を開始し、黒人と検体の周りにブロックをトリミングします。
4. 6を入手するには1心の複製され、スライド1の最初のセクションでは、スライド2番目のセクションは、スライド3の3分の1を取るなどしたら、スライド6の第六セクションを配置し、スライド1で再起動するまで継続する臓器全体がカットされます。スライドの周りに8つのセクション（ 図3）の2つの行を収集します。
5. 室温で1時間スライドを乾燥させます。 -20℃で密閉ボックスに1年間までできるように保管しておきます

6。代表的な結果

このプロトコルは、以下の代表的な心臓の損傷は、4 dpci（; 図2D-F日後cryoinjury）で解剖し、全体の心の中に示されています。 vにin vivoでの心筋組織をisualize、我々は、心臓特異的cmlc-2プロモーター^11,12の制御下でEGFPと核DsRed2を発現するトランスジェニック魚を使用していました。 EGFPおよびDsRed2の蛍光シグナルの不在は、頂端 - 側脳室壁に沿って円盤状の梗塞ゾーンを画定。

組織の細胞および分子解析を実行するために、心は、固定およびクライオスタットで切片。横断心臓部の連続したシリーズの代表的なスライドは、 図3に示します。

セクションは、さまざまな方法（ 図4）で分析することができます。瘢痕に対する心の再生の程度を決定するために、我々は、差動、心臓および線維組織⁹ラベル酸性フクシンオレンジ-G（AFOG）染色を使用して、組織学的分析を行った。遺伝子発現解析は、in situハイブリダイゼーションの手順でに従って達成されました9と蛍光抗体法を適用した。多様な染色手順の組み合わせは、心臓の再生は、次のcryoinjuryに関与する分子·細胞メカニズムの特定につながる。

図1成体ゼブラフィッシュにおける心室のcryoinjuryを誘導する。クライオプローブの（A）の写真。 （B）大人のゼブラフィッシュは、その腹側を上にしてスポンジのスリットに配置されます。心臓にアクセスするには、（CF）胸部切開。 （C）皮膚と筋肉を通して小さなカットが2鰭（赤線）の間で行われます。 （D）はさみは、赤い矢印は、次の皮膚を切るために切開に挿入されます。 （E）皮膚の下に、銀色の皮下組織の薄い層（青破線で囲まれた）静かに心にアクセスするために開かれます。 （F）切開で広がっている鉗子や泡立て心室（緑の矢印）がcryoinjuryのアクセスが可能です。 （G）コールドクライオは、優しく心に触れることを胸に挿入されます。 （HJ）ハートコレクション。 （H）長く深い切開を心膜腔にアクセスするために胸部の鰓弓を介して行われます。二つの心臓の構造が表示されている：動脈球（白矢印）と心室（緑の矢印）。 （I）動脈球は、鉗子で保持し、体腔から引き出されています。 （J）心臓全体は、体のから切除されています。

図2代表的な制御とEGFPと心筋細胞の核DsRed2を発現大人のトランスジェニックゼブラフィッシュから解剖cryoinjured心。 （AC）の心を無傷。 （A）暗視野照明では、心室（V）、心房は心室にリンクされていた動脈球の（Ba、白）とバルブ（Va）を示​​しています。 tの（BおよびC）蛍光イメージ彼そのまま心室表示EGFPと心筋細胞のDsRed2の発現。 （DF）ハートは4日後cryoinjuryで（4 dpci）（D）暗視野照明は、円盤状の梗塞（黄色の破線）を明らかにする。 （EF）心筋マーカーEGFPおよびDsRed2は、損傷を受けた心筋の（破線で囲まれた）を示す、梗塞領域で検出されません。

図3心臓のセクショニング。心臓の上部に向かって心（1および2、赤）（緑の3と4）の下部から横断切片の描画の（A）心臓全体。 （B）AFOG（酸性フクシンオレンジ-G）で染色した連続した横方向のセクションで一連のスライドの写真。最初のセクションでは、（1および2、赤四角）心室尖部が含まれており、心臓（3と4、緑色の四角）の最後のセクションでは、動脈球構成されています。

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図4の7日後cryoinjuryで心臓のセクションで実行解析の例。オレンジ色の（A）AFOG（酸性フクシンオレンジ-G）染色ラベルの健康な筋肉細胞、赤、青とフィブリン、コラーゲンを含む瘢痕組織。 （B） 心室ミオシン重鎖（vmhc）mRNAのin situハイブリダイゼーションでは、無傷の心筋（青染色）を可視化。負傷した組織は、心臓の遺伝子転写物（赤点線）を欠いている。 （C）トロポミオシンの免疫測定（緑）は無傷の心筋細胞ではなく、損傷した組織を（破線で囲まれた）ラベル。 DAPI（青）汚れすべての細胞の核。 （D）は核内遺伝子標識した心筋細胞急行DsRed2の（赤）。 DAPI（青）は、すべての核をラベル付けします。梗塞ゾーンは、DsRed2の陽性細胞（白点線）が含まれていません。

Discussion

Cryoinjuryは、極端な寒さ¹⁴の正確なアプリケーションによって、組織の制御された損傷と定義されています。直接熱衝撃は、タンパク質の破壊により、プラズマ膜を破裂細胞内液の氷結晶形成により細胞を破壊する。その結果、負傷した細胞はアポトーシスとネクローシス¹⁴の過程で死亡しています。これらの細胞死のメカニズムの両方が心筋梗塞^15日以降の組織の損失に貢献することが示されている。したがって、cryoinjuryは心臓梗塞を誘発するのに適したモデルを表します。いくつかの研究は、マウス、ラット、ウサギおよびブタ^6,7を含む様々な哺乳類でこの井戸を証明する方法を報告した。ゼブラフィッシュにおけるcryoinjuryプロトコルの適応は、異なる種間の​​梗塞応答について比較検討することができます。

他の2つのグループが独立して大人のゼブラフィッシュの心臓のためにcryoinjury手順を開発しました。大きな違いはシュールです。gery方法、ツールの種類と適用された凍結時間。ゴンサレス·ローザらによる研究では、心膜は、組織を引き裂くの代わりに切断してオープンしました。彼らは、解凍は¹⁰観察することができるようになるまで数秒間心臓を凍結し、液体窒素で予冷ポリアミドチューブにリンクされた0.3ミリメートルの銅フィラメントを使用していました。シュナーベルらによる研究では、その直径2 mmの尖った先端を持つ20mmの長さのドライアイスの円錐形のピースが10秒⁸の心に触れるために使用された。二つのグループは、心筋の死を通して心室の損傷を取得しました。私たちの方法の利点は、優れた哺乳動物系で観察された初期の梗塞治癒応答を模倣したコラーゲンが豊富な傷跡、より再現性の堆積です。

ゼブラフィッシュにおけるcryoinjury手順の間に重要なステップは、基礎となる心臓を穿刺することなく、皮膚と心嚢を通して切開を行っています。正しくperformeD手術は少し出血を引き起こします。多量出血はハサミで心室の意図しない穿刺を示しています。このような場合には、動物実験から退避する必要があります。心臓を穿刺を回避するためには、はさみのポイントは、皮膚に浅い角度を目指すべきである。

再現性の傷害を作成するためのもう一つの重要な側面は、最適な正確な期間の心室に冷たいクライオの正確な位置です。短すぎると凍結時間はほとんど細胞死と炎症になります。長期凍結は、他の一方で、動物の強化された死亡につながる可能性があります心臓の広範な損傷を引き起こす可能性があります。私たちは2センチの大人のゼブラフィッシュのために23から26秒の間凍結状態の範囲内で心室を保持するために最適な時期と判断し、それが動物のサイズに依存して異なる場合があります。

私たちのプロトコルは非常に簡単かつ迅速であるため、実験的な制限はありません適切な生物学的な複製を得るために動物の十分な数を施すことでゴム手袋。凍結手術治療は非常によく動物によって許容されています。 cryoinjury後の異なる時点での心のコレクションは、再生処理中に後続のフェーズの詳細な特性評価を可能にします。 cryoinjured心の実験的解析では、in situハイブリダイゼーションによる遺伝子転写の可視化、2）免疫蛍光染色は、3によるタンパク質分布の検出）は、異なる構造の組織学的イメージング1）を含めることができます。ゼブラフィッシュにおける心筋梗塞後の重要な治癒過程を理解することは、再生生物学の分野に影響を与えます。また、再生医療に新たな治療アプローチを設計するための有益かもしれません。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5602
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Formaldehyde ~36%	Sigma-Aldrich	47630
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds - Truncated Molds T8	Polysciences, Inc.	18985