Summary
Zebra balığı omurgalılarda kalp rejenerasyon mekanizmaları incelemek için değerli bir modeli temsil eder. Burada, cryoinjury kullanarak yetişkin zebrabalıkları yılında bir kalp infarkt indüksiyonu için bir protokol mevcut. Memeli enfarkt gözlenen benzer ventriküler duvarın 20% içinde büyük hücre ölümü, bu yöntem sonuçlar,.
Abstract
Memeli kalp gibi miyokard enfarktüsü 1 gibi akut bir yaralanma sonrası önemli bir yenilenme yeteneğinde değildir. Buna karşılık, urodele amfibiler ve teleost balık çok az veya hiç ömrü boyunca 2,3 skarlasma ile kardiyak rejenerasyon için muazzam bir kapasite korumak. Sadece olmayan bazı memeli omurgalılar 4,5 kalıntı dokulardan tam bir organı yeniden neden bilinmemektedir. Farklı türlerde rejeneratif yanıtları arasındaki moleküler ve hücresel farklılıkları anlamak için, akut yaralanmalar uyandırmaya benzer yaklaşımlar kullanmak gerekir.
Memelilerde, kardiyak onarım incelemek için en sık kullanılan model cryoinjury 6,7 sonrası koroner arter veya doku yıkımının bir ligasyonu sonrası akut iskemi olmuştur. Newts ve zebrabalıkları içinde kardiyak rejenerasyon ağırlıklı ventriküler apeks 2,3 kısmi rezeksiyon sonrası incelenmiştir. Son zamanlarda, çeşitli gruplar establ varyetişkin zebrabalıkları 8-10 cryoinjury tekniğin son bulur. Bu memeli ve non-memeli türlerinden elde edilen sonuçların karşılaştırmalı bir tartışma sağlar, çünkü bu yöntem büyük bir potansiyele sahiptir.
Burada, cryoinjury tarafından zebrafish ventrikül tekrarlanabilir bir disk-şekilli enfarkt indüklemek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaralanma modeli ventrikül duvarının kardiyomiyositlerin yaklaşık% 20 masif hücre ölümü ile sonuçlanan hızlı donma-çözülme doku dayanmaktadır. Öncelikle, küçük bir kesi kalp erişmek için iridektomi makasla göğüs ile yapılmıştır. Ventrikül duvar doğrudan 23-25 saniye sıvı azot içerisinde ön soğutma, paslanmaz çelik kriyoprob için başvuran tarafından donduruldu. Oda sıcaklığında, kalp, balık suyun dondurulması durdurmak için kriyoprob ucu üzerine bırakıldı. Prosedür iyi% 95 hayatta kalma oranı ile, hayvanlar tarafından tolere edilmektedir.
Rejeneratif süreci karakterize etmek için kalpleri vardıcryoinjury sonra farklı günde toplandı ve sabitlenir. Daha sonra, numune cryosectioning için gömülü edildi. Bölümleri ile slaytlar situ hibridizasyon ve immünfloresan, histolojik analiz için işlendi. Bu taahhütname zebrabalıkları içinde rejeneratif plastisite için gerekli, ve kardiyak rejenerasyon makine yeni bir anlayış sağlamak olan faktörler anlayışımızı geliştirir. Zebra balığı kalp rejenerasyon kavramsal bir anlayış ve moleküler gelişim biyolojisi ve rejeneratif tıp hem de etkileyecektir.
Protocol
1. Ekipman Set-up
- Cryoinjury gerçekleştirmek için kullanılan temel araç kriyoprob, paslanmaz çelik (Şekil 1A) yapılmış kalem gibi bir araçtır. Silindirik bir kol 40 mm uzunluğunda ve 8 mm arasında bir çapa sahiptir. Aplikatör ucu 6 mm uzunluğunda ve çapı 0,8 mm'dir. Ucu ve kol arasında bileşke uzun 4 mm koni şeklindedir. Buna ek olarak, kriyoprob bir tutamak prosedürü sırasında aracı tutarken bir parmak donmaya önlemek için, bir plastik tüp ve bant ile izole edilmesi gerekir.
- Kriyoterapi için gerekli diğer malzemeler stereomikroskopta, keskin forseps, mikro kesme yay makas ve bir plastik transferi pipet bulunmaktadır. Ayrıca balık transferi için balık ve bir plastik kaşık anestezi için bir ölçek hazırlar.
- Ameliyat sırasında, balık onun ventral yüzü yukarı (Şekil 1B) ile nemli bir sünger yerleştirilir. Bir, istikrarlı bir prosedür içinde hayvan tutunUygun oluk elle sünger yardımıyla kesilmelidir.
- Ameliyat sonrası balık transfer sistemi su ile bir tank hazırlayın.
- 10 saniyelik geri sayım ve sonra otomatik olarak 24 saniyelik geri sayım ile ilk çift zamanlayıcı kurun.
2. Cryoinjury Prosedürü
- En az 3 dakika boyunca sıvı azot, 3-5 cm ucu daldırarak kriyoprob soğumaya.
- Balık sırtını açar ve solungaçları neredeyse (yaklaşık 90 saniye) hareket durdurana kadar% 0,02 tricaine içinde immerging bir yetişkin zebrabalıkları uyutmak.
- (Şekil 1B) baş aşağı bir balık tutmak için kesilmiştir nemli bir sünger bir plastik kaşık ile balık aktarın. Baskın olmayan elle forseps ile sürekli balık tutun. Görme kalbin posterior medial marjı bulmak ve delinme cilde düz iridektomi makas kullanın. (Şekil 1C).
- Cu tarafından kalp üzerinde küçük (yaklaşık 2 mm) kesi yapmakcilt, kaslar (Şekil 1D) ile düz öne tting. Bu hayvan öldürecek gibi, kemikli brankiyal aparatı sayesinde kesmeyin.
- Yavaşça yenerek ventriküle doğrudan erişim için makas ucuyla hipodermis gümüş epitel tabakası (Şekil 1E) gözyaşı. Bu irade ponksiyon kalp gibi vücut boşluğunda derin makas takmayın. Atan kalpte iyi görünür olmalı ve hiçbir aşırı kanamalı torakotomi (Şekil 1F) sırasında meydana gelmelidir.
- 24 saniye ardından 10 saniye için belirlenen programlı zamanlayıcı başlayın. 10 saniye boyunca sıvı nitrojen gelen kriyoprob çıkarın. Hafifçe sallayarak kriyoprob üzerinde daha fazla azot olduğundan emin olun. Yanal göğüs (Şekil 1F) açmak için forseps kullanarak kesi yayıldı.
- Zamanlayıcı halkalar 10 saniye sonra, pr ucu ile hemen fakat nazikçe ventrikül dokunmayıne-soğutmalı kriyoprob (Şekil 1G).
- Zamanlayıcı halkalar 24 saniye sonra, doku kriyoprob serbest bırakmak için göğüs üzerine plastik bir pipet kullanarak sistem su 2-3 ml dökün ve sistem su tankına balık transferi.
- Balık birkaç saniye sonra solunum yeniden başlatmanız gerekir ve daha sonra yüzme devam etmesi gerekir. Bu yaklaşık 45 saniye sonra nefes değilse, kendi başına nefes başlayana kadar plastik bir pipetle solungaçları içine su squirting tarafından hayvan uyarırlar. Deneyimlerimize göre, balık% 95 cerrahi hayatta ve tüm ölümlerin ameliyat günü ortaya çıkar. Bu kesiler kapatılması için gerekli olmayacaktır.
3. Kalp Toplama ve Fiksasyon
- Kalp, iki forseps, mikro kesme makasları ve nemli oluklu sünger sabitlemek için bir mikrosantrifüj tüp formalin 2% 1 mL hazırlayın.
- Cryoinjury sonra, seçilen gün, 5 dakika boyunca% 0.1 'in tricaine balık euthanize.
- Yerleştirinkadar nemli, oluklu sünger içine balık ventral tarafta. Mikro diseksiyon makas ile brankiyal kıkırdak ile kalp üzerinde büyük bir (yaklaşık 4 mm) kesi olun. Forseps (Şekil 1H) ile yaygın kesi açın.
- Bulbus arteriosus, ventrikül (Şekil 1 HI) anterior beyaz bir yapı çimdiklemek ve çekerek boşluğundan kalp çıkarın. Bir bütün parçalanmış kalp Şekil 1J ve Şekil 2A 'de gösterilmiştir.
- % 2 formalin 1 ml ile mikrosantrifüj tüpüne 3 kupa kadar yerleştirin. Yavaşça tüp birkaç kez çevirin ve 4 bir gecede tutmak ° C
4. Kalp Montaj
- 5 dakika süreyle PBS içinde kalp çalkalayın. 4 ° C'de ön soğutulması gerekir% 30 sukroz 10 ml içine kalpler aktarın ve hafifçe karıştırın. Numune, başlangıçta sukroz çözeltinin yüzeyinde yüzen gerekir. 4 ° C'de 1 saat 20 dakika süreyle inkübe Devam SonraBu süre, kalpleri tüpün dibine batar.
- Kuru buz ile bir kutu hazırlayın. Bir gömme kalıp alın ve kalıbın altındaki Ekim montaj orta bir 5 mm tabaka dökülür.
- Forseps kalıp orta montaj OC T içine yerleştirin kalp ile. Stereomikroskop altında, üste doğru kalıp altındaki ventriküler apeks ve bulbus arteriosus ulaşmak için numunenin yönünü ayarlamak.
- Kuru buz ile numune kalıpları yerleştirin. Montaj orta dondurmak başladığında, Ekim orta ile kalıp geri kalanı doldurmak ve tamamen donmasına izin. Kesit daha önce -80 ° C sıcaklıkta, en az 1 saat boyunca kalıp tutmak. Donmuş örnek -80 birçok ay boyunca saklanabilir ° C
5.. Kesit Kalpler
- 16 um arasında bir kesme boyutu, -24 ° C arasında bir sıcaklıkta haznesi ve -22 ° C'de numunelerin sıcaklığı ile bir kriyostat ayarlama
- Ile dondurulmuş blok yerleştirinkriyostat olarak örnek ve blok alt paralel kesme başlamak için yönünü düzeltmek.
- Bir blok başına altı SuperFrost-artı slaytlar hazırlamak ve 1 ila 6 bunları numaralamak. Doku ulaşılana kadar kesme başlatın ve bir traş bıçağı ile numune etrafında blok kırpın.
- 6 elde etmek için bir kalp çoğaltır, slayt 1 ilk bölümünde, slayt 2 ikinci bölümünde, slayt 3 üçüncü sürebilir, vb sonra slayt 6 Altıncı bölümde yer, slayt 1 ile yeniden başlatın ve kadar devam Tüm organ kesilir. Slayt üzerinde yaklaşık 8 bölümden iki satır (Şekil 3) toplayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca izin slaytlar kuru. -20 ° C'de ağzı sıkıca kapalı kutularda 1 yıl kadar için saklayın
6. Temsilcisi Sonuçlar
Bu protokolü takip Temsilcisi kardiyak yaralanma 4 dpci az disseke bütün kalpleri gösterilir (gün sonrası cryoinjury; Şekil 2D-F). V içinin vivo miyokardiyal doku isualize, kardiyak spesifik cmlc-2 promotör 11,12 kontrolü altında EGFP ve nükleer DsRed2 ifade transjenik balık kullanılır. EGFP ve DsRed2 floresan sinyallerin yokluğu apikal-lateral ventrikül duvar boyunca bir disk şeklinde infarkt bölgesi sınırları belirgin.
Dokusunun hücresel ve moleküler analizleri gerçekleştirmek için, kalpleri sabit ve bir kriyostat ile kesitler alındı. Transversal kalp bölümleri ardışık ile temsili bir kayar Şekil 3 'de gösterilmiştir.
Bölümleri çeşitli yöntemler (Şekil 4) ile analiz edilebilir. Skar kalbe karşı rejenerasyon kapsamını belirlemek için, farklı şekilde kardiyak ve fibrotik dokuların 9 etiketler Asit Fuchsin Turuncu-G (AFOG) boyama kullanarak histolojik analizi yapıldı. Gen ekspresyon analizleri situ hibridizasyon prosedürü göre elde edildi
Şekil 1. Yetişkin zebrabalıkları içinde ventrikül cryoinjury indüklenmesi. Kriyoprob (A) bir fotoğraf. (B) yetişkin zebrabalıkları kadar olan ventral yüzü sünger yarık yerleştirilir. Kalp erişmek için (CF) Göğüs kesi. (C) deri ve kas yoluyla küçük bir kesik iki göğüs yüzgeçlerinin (kırmızı çizgi) arasında yapılır. (D) makas kırmızı ok takip deri kesmek için kesi eklenir. (E) deri altında, gümüş hipodermis ince bir tabaka (mavi kesikli çizgi ile çevrili) yavaşça kalp erişmek için açılır. (F) kesi ile yayılırforseps ve dayak ventrikül (yeşil ok) cryoinjury için erişilebilir. (G) soğuk kriyoprob yavaşça kalp dokunmak için göğüs içine yerleştirilir. (HJ) Kalp koleksiyonu. (H) Bir derin ve uzun kesi perikard boşluğu erişmek için göğüs brankiyal kemerleri ile yapılır. İki kalp yapıları görülebilir: bulbus arteriosus (beyaz ok) ve ventrikül (yeşil ok). (I) bulbus arteriosus forseps ile tutun ve vücut boşluğundan dışarı çekilir. (J) tamamı kalp gövdesinin den kesilip çıkarılan edilir.
Şekil 2. Temsilcisi kontrolü ve EGFP ve kardiyomiyositlerde nükleer DsRed2 ifade yetişkin transgenik zebrabalıkları diseke cryoinjured kalpler. (AC) kalp yaralanmamış. (A) karanlık alan aydınlatma ventrikül gösterir atriyuma ventriküle bağlantılı olduğu (V), bulbus arteriosus (Ba, beyaz) ve vanalar (Va). T (B ve C) Floresan görüntüleri O sağlam ventrikül ekran EGFP ve kardiyomiyositlerde DsRed2 ifade. 4 gün sonrası cryoinjury at (DF) Kalp (4 dpci) (D) karanlık alan aydınlatma bir disk şeklinde infarkt (sarı kesikli çizgi) açığa çıkarır. (EF) kardiyomiyosit işaretleri EGFP ve DsRed2 hasarlı miyokard (kesikli çizgi ile çevrili) gösteren, infarkt alanında algılanmaz.
Şekil 3. Kalp Kesit. Kalp üst kısmına doğru kalp (1 ve 2, kırmızı) (yeşil 3 ve 4) alt başlayarak enine bölüm çizime ile (A) Tam kalp. (B) AFOG (Asit Fuchsin Turuncu-G) ile boyanarak ardışık kesitler serisi ile bir slayt fotoğrafçılığı. Birinci bölüm (1 ve 2, beyaz kareler) ventriküler Apex içerir, ve kalp (3 ve 4, yeşil kareler) ile son bölümler bulbusu arteriozus içermektedir.
iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg "/>
Analizi Şekil 4. Örnekler 7 gün sonrası cryoinjury az kalp bölümlerde gerçekleştirilir. Turuncu (A) AFOG (Asit Fuchsin Turuncu-G) boyama etiketler sağlıklı kas hücreleri, kırmızı, mavi ve fibrin içinde kollajen içeren skar dokusu. (B) ventriküler miyozin ağır zincir (vmhc) in situ hibridizasyon olarak mRNA sağlam miyokard (mavi boyama) görüntüler. Yaralı dokuya kardiyak gen transkript (kırmızı kesikli çizgi) yoksundur. (C) tropomiyozin ve Immunoassaying (yeşil) sağlam kardiyomiyositler değil, hasarlı doku (kesikli çizgi ile çevrili) etiketler. DAPI (mavi) lekeler tüm hücrelerin çekirdekleri. (D) çekirdeklerinde Genetik etiketli kardiyomiyositler ekspres DsRed2 (kırmızı). DAPI (mavi) tüm çekirdeklerin etiketler. Enfarkt bölgesi DsRed2-pozitif hücrelerin (beyaz kesikli çizgi) içermez.
Discussion
Cryoinjury soğuk 14 arasında hassas bir uygulama tarafından kontrol edilen doku hasarı olarak tanımlanır. Direkt termal şok proteini tahrip edilmesi ve plazma zarı yırtması hücre içi sıvı kristal buz oluşumu hücreleri yok eder. Sonuç olarak, hücreler yaralı apoptoz ve nekroz 14 ait işlemlerde ölmektedir. Bu hücre ölümü mekanizmalarının her ikisi de miyokardiyal enfarktüs sonrası 15 doku kaybına neden olduğu gösterilmiştir. Böylece, cryoinjury kalp enfarktüsü indüklenmesi uygun bir modeli gösterir. Çeşitli çalışmalar fare, sıçan, tavşan ve domuz 6,7 dahil olmak üzere çeşitli memeliler, bu iyi oldu yöntemi bildirdi. Zebra balığı yılında cryoinjury protokol adaptasyonu farklı türler arasında infarkt cevabı üzerine daha karşılaştırmalı bir tartışma sağlar.
Diğer iki grup bağımsız yetişkin zebrabalıkları kalp için cryoinjury prosedür geliştirmiştir. Büyük farklar sur vardırgery yöntemleri, araçları türü ve uygulanan donma süresi. González-Rosa ve ark. Tarafından yapılan çalışmada, perikard dokusu yırtılması yerine kesilerek açıldı. Onlar çözülme 10 görülebiliyor kadar birkaç saniye için kalp dondurmak için sıvı azot içinde ön-soğutulur bir naylon tüp ile bağlantılı 0.3 mm bakır filament kullanılır. Tarafından çalışmada Schnabel ve ark., Onun çapı 2 mm'lik bir sivri ucu ile 20 mm uzunlukta, kuru buz, konik bir parçası 10 saniye için kalp 8 temas etmesine kullanıldı. İki grup miyokardın ölümü ile ventriküler hasar aldı. Bizim yöntemin avantajı daha iyi bir memeli sistemlerde görülen erken enfarkt iyileştirici yanıtları taklit kolajen-zengin yara, bir daha yeniden üretilebilir çökelme olup.
Zebra balığı yılında cryoinjury işlem sırasında kritik adım altta yatan bir kalp delinmesiyle olmadan cilt ve perikardiyal kese ile bir kesi yapıyor. Bir doğru performed cerrahisi küçük kanamalara sebep olur. Bol kanama makasla ventrikül istemeden ponksiyon gösterir. Bu gibi durumlarda, hayvanlar deneyden geri çekilmelidir. Kalp delinmesiyle önlemek amacıyla, makas noktası deriye sığ bir açıyla amaçlamalıdır.
Tekrarlanabilir bir yaralanma oluşturmak için bir diğer önemli yönü optimal kesin bir süre için ventrikül üzerindeki soğuk kriyoprob tam konumlandırma. Çok kısa donma süresi biraz hücre ölümü ile inflamasyona neden olur. Uzun süreli donma, diğer yandan, hayvanların geliştirilmiş ölüm yol açabilir kalp büyük zarar görmesine neden olurlar. Bu uygun bir kez 2 cm uzunluğunda yetişkin zebrabalıkları için 23-26 saniye arasında donmuş halde aralığında tutmak için ventrikül tespit ve hayvanların boyutuna bağımlı olarak değişebilir.
Bizim protokolü çok basit ve hızlı olduğu için, herhangi bir sınırlama yoktur, deneysel olarakYeterli biyolojik tekrarlamalı elde etmek için hayvanların yeterli sayıda tabi olarak haklı çıkarmaktadır. Kriyocerrahi tedavisi çok iyi hayvanlar tarafından tolere edilmektedir. Cryoinjury sonra farklı zaman noktalarında kalplerin Koleksiyon rejeneratif sürecinde MEB'in detaylı karakterizasyonu sağlar. Cryoinjured kalplerin deneysel analizi in situ hibridizasyon ile gen transkripsiyon görselleştirme, 2) immünofloresan boyama, 3 protein dağılımının tespiti) farklı yapıların histolojik görüntüleme) 1 içerebilir. Zebra balığı miyokard infarktüsü sonrası önemli iyileşme süreçleri anlamak rejeneratif biyoloji alanında etkileyecektir. Ayrıca, rejeneratif tıpta yeni tedavi yaklaşımları tasarımı için faydalı olabilir.
Disclosures
Hayvanlar üzerinde yapılan deneysel araştırma Fribourg kanton veteriner dairesi tarafından onaylandı.
Acknowledgments
Biz mükemmel teknik yardım ve balık bakımı için V. Zimmermann teşekkür ederim. 310000_120611: Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, hibe numarası ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds - Truncated Molds T8 | Polysciences, Inc. | 18985 |
References
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Singh, B. N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J. P., Weaver, C. V. Heart of newt: a recipe for regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).
- Ausoni, S., Sartore, S. From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration. J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).
- Borchardt, T., Braun, T. Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man. Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).
- Bos, E. J. vanden, Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-H1300 (2005).
- van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. Cryoinjury: a model of myocardial regeneration. Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS ONE. 6, (2011).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
- González-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Rottbauer, W. Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos. Cell. 111, 661-672 (2002).
- Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
- Chablais, F., Jazwinska, A. IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration. Development. 137, 871-879 (2010).
- Baust, J. G., Gage, A. A.
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).
