Summary
Zebrafish rappresenta un modello importante per studiare i meccanismi di rigenerazione cardiaca nei vertebrati. Qui vi presentiamo un protocollo per l'induzione di un infarto cardiaco in zebrafish adulti usando cryoinjury. Questo metodo comporta la morte cellulare massiccio entro il 20% della parete ventricolare, simile a quella osservata in infarti mammiferi.
Abstract
Il cuore dei mammiferi non è in grado di rigenerazione significativa a seguito di una lesione acuta, come infarto miocardico 1. Al contrario, anfibi e pesci teleostei urodele mantenere una notevole capacità di rigenerazione cardiaca con poca o nessuna cicatrice per tutta la vita 2,3. Non si sa perché solo alcuni vertebrati non-mammiferi in grado di ricreare un organo completo dai tessuti rimanenti 4,5. Per capire le differenze molecolari e cellulari tra le risposte di rigenerazione in specie diverse, abbiamo bisogno di usare approcci simili per indurre le lesioni acute.
Nei mammiferi, il modello più frequentemente usato per studiare la riparazione è stata ischemia cardiaca acuta dopo una legatura dell'arteria coronaria o di distruzione dei tessuti dopo cryoinjury 6,7. La rigenerazione cardiaca in tritoni e zebrafish è stata prevalentemente studiata dopo una resezione parziale del 2,3 apice ventricolare. Recentemente, diversi gruppi hanno establmentata la tecnica cryoinjury in 8-10 zebrafish adulti. Questo metodo ha un grande potenziale perché consente una discussione comparativa dei risultati ottenuti dalle specie di mammiferi e non mammiferi.
Qui, vi presentiamo un metodo per indurre una riproducibile a forma di disco infarto del ventricolo zebrafish da cryoinjury. Questo modello pregiudizio si basa su un rapido congelamento-scongelamento tessuto, che provoca la morte cellulare massiccia di circa il 20% dei cardiomiociti della parete ventricolare. In primo luogo, una piccola incisione è stata effettuata mediante il torace con le forbici iridectomia per accedere al cuore. La parete ventricolare è stato congelato applicando direttamente per 23-25 secondi una criosonda acciaio inossidabile preraffreddata in azoto liquido. Per interrompere il congelamento dell'acqua cuore, pesce a temperatura ambiente è stato caduto sulla punta della sonda criogenica. La procedura è ben tollerata da animali, con un tasso di sopravvivenza del 95%.
Per caratterizzare il processo di rigenerazione, i cuori eranoraccolti e fissati in giorni diversi dopo cryoinjury. Successivamente, il campione sono stati incorporati per criosezionamento. I vetrini con sezioni sono state preparate per l'analisi istologica, ibridazione in situ e immunofluorescenza. Questo impegno accresce la nostra comprensione dei fattori che sono necessari per la plasticità rigenerativa nel zebrafish, e di fornire nuove intuizioni nella macchina di rigenerazione cardiaca. Una comprensione concettuale e molecolari della rigenerazione cardiaca in zebrafish avrà un impatto sia della biologia dello sviluppo e della medicina rigenerativa.
Protocol
1. Attrezzature Set-up
- Lo strumento principale utilizzato per eseguire cryoinjury è la criosonda, la penna strumento simile che è fatto di acciaio inossidabile (Figura 1A). La maniglia cilindrica lunghezza di 40 mm e ha un diametro di 8 mm. La punta dell'applicatore è di 6 mm e 0,8 mm di diametro. La giunzione tra la punta e il manico è conico 4 mm di lunghezza. Inoltre, il manico della sonda criogenica deve essere isolata con un tubo di plastica e nastro per evitare congelamento delle dita tenendo l'utensile durante la procedura.
- Altri materiali che sono necessari per la criochirurgia sono uno stereomicroscopio, pinze taglienti, forbici micro molla dissezione e una pipetta di plastica. Inoltre preparare un becher per anestetizzare il pesce e un cucchiaio di plastica per il trasferimento del pesce.
- Durante l'intervento, il pesce è messo su una spugna umida con il suo up lato ventrale (Figura 1B). Per mantenere l'animale in una procedura stabile, unoscanalatura appropriato deve essere tagliato manualmente la spugna.
- Preparare una vasca con acqua sistema per trasferire il pesce dopo l'intervento chirurgico.
- Impostare un timer prima doppietta con un conto alla rovescia di 10 secondi e poi automaticamente un conto alla rovescia di 24 secondi.
2. La procedura Cryoinjury
- Far raffreddare il criosonda immergendo la punta in 3-5 cm di azoto liquido per almeno 3 min.
- Anestetizzare uno zebrafish adulto immergendo in tricaine 0,02% fino a quando il pesce diventa sulla sua schiena e le sue branchie quasi smettono di muoversi (circa 90 secondi).
- Trasferire il pesce con un cucchiaio di plastica ad una spugna umida che è stato tagliato a tenere un pesce capovolto (figura 1B). Tenere fermo il pesce con una pinza che utilizzano mano non dominante. Individuare visivamente il margine posteriore mediale del cuore e usare le forbici iridectomia diritte per perforare la pelle. (Figura 1C).
- Fate un piccolo (circa 2 mm) incisione sopra il cuore di cutting dritto anteriormente attraverso la pelle, i muscoli (Figura 1D). Non tagliare attraverso l'apparato osseo branchiale, in modo da uccidere l'animale.
- Strappare delicatamente lo strato epiteliale argenteo del ipoderma (Figura 1E) con la punta delle forbici per avere un accesso diretto al ventricolo battere. Non inserire le forbici più in profondità nella cavità del corpo, come questo puntura volontà del cuore. Il cuore deve essere ben visibile, e nessun sanguinamento esteso dovrebbe avvenire durante la toracotomia (Figura 1F).
- Avviare il timer programmato che è stato impostato per 10 secondi seguiti da 24 secondi. In 10 secondi estrarre la criosonda dal azoto liquido. Assicurarsi che non ci sia più azoto sulla criosonda scuotendo delicatamente. Stendere l'incisione lateralmente con pinze per aprire il torace (Figura 1F).
- Una volta che il timer anelli 10 secondi, ma immediatamente toccare delicatamente il ventricolo con la punta del pre-raffreddato criosonda (Figura 1G).
- Una volta che gli anelli di timer 24 secondi, versare 2-3 ml di acqua sistema che utilizza una pipetta di plastica sul petto per liberare il criosonda dal tessuto, e trasferire i pesci nella vasca con l'acqua del sistema.
- Il pesce dovrebbe riavviare la respirazione dopo pochi secondi, e poi dovrebbe riprendere il nuoto. Se non respira, dopo circa 45 secondi, stimolare l'animale spruzzando acqua nelle branchie con una pipetta di plastica fino a quando non comincia a respirare da solo. Nella nostra esperienza, 95% del pesce sopravvivere chirurgia, e tutti i decessi si verifica il giorno dell'intervento. Non sarà necessario per suturare incisioni.
3. Cuore Raccolta e Fixation
- Preparare 1 ml di formalina al 2% in una provetta per il fissaggio del cuore, due pinze, forbici micro-dissezione e la spugna umida fessura.
- Al giorno selezionato dopo cryoinjury, euthanize il pesce in 0,1% tricaine per 5 minuti.
- Posizionare ilpesce lato ventrale in su in un umido, spugna fessura. Fare un grande (circa 4 mm) incisione al di sopra del cuore attraverso la cartilagine branchiale con le forbici micro dissezione. Aprire ampiamente l'incisione con una pinza (Figura 1 H).
- Stringere off arterioso bulbo, una struttura bianca anteriore al ventricolo (Figura 1 HI), e rimuovere il cuore dalla cavità tirandolo. A tutto il cuore sezionato 1J è mostrato nella figura e figura 2A.
- Posizionare fino a 3 cuori in una provetta con 1 ml di 2% formalina. Delicatamente ruotare la provetta diverse volte e tenerlo notte a 4 ° C.
4. Cuore di montaggio
- Sciacquare i cuori in PBS per 5 minuti. Trasferire i cuori in 10 mL del 30% di saccarosio che dovrebbe essere pre-raffreddato a 4 ° C, e mescolare delicatamente. Il campione deve inizialmente galleggiare sulla superficie della soluzione di saccarosio. Continuare incubazione per 1 ora e 20 minuti a 4 ° C. Dopoquesto tempo, i cuori si depositano sul fondo della provetta.
- Preparare una scatola con ghiaccio secco. Prendere uno stampo incorporamento, e versare un strato 5 mm di mezzo ottobre montaggio sul fondo dello stampo.
- Con pinze posizionare il cuore nel T OC mezzo di montaggio nello stampo. Sotto lo stereomicroscopio, regolare l'orientamento del campione per raggiungere l'apice ventricolare sul fondo dello stampo, e il bulbo arterioso verso l'alto.
- Mettere gli stampi con il campione in ghiaccio secco. Quando il mezzo di montaggio inizia a congelare, riempire il resto dello stampo con il mezzo ottobre e lasciar congelare completamente. Mantenere il stampo per almeno 1 ora a -80 ° C prima sezionamento. Il campione congelato può essere conservato per molti mesi a -80 ° C.
5. Hearts sezionamento
- Impostare un criostato con una dimensione di taglio di 16 um, una temperatura del vano di -24 ° C e la temperatura del campione a -22 ° C.
- Posizionare il blocco congelato con lacampione nel criostato e fissare l'orientamento di iniziare il taglio parallelo al fondo del blocco.
- Preparare sei Superfrost-più diapositive per un blocco e far di conto loro di 1 a 6. Iniziare a tagliare fino a quando il tessuto viene raggiunto, e tagliare il blocco di tutto il campione con una lametta.
- Per ottenere 6 repliche di un cuore, prendere la prima sezione sulla slitta 1, la seconda sezione sulla slitta 2, il terzo sulla slitta 3, ecc Dopo aver posizionato la sezione sesta slitta 6, riavviare con scivolo 1 e proseguire fino alla intero organo viene tagliato. Raccogliere due file di circa 8 sezioni sul vetrino (Figura 3).
- Lasciare le diapositive asciugare per 1 ora a temperatura ambiente. Conservarli per un massimo di 1 anno in contenitori ben chiusi a -20 ° C.
6. Risultati rappresentativi
Rappresentante lesione cardiaca a seguito di questo protocollo è mostrato in tutto il cuore sezionati a 4 DPCI (post cryoinjury giorni; figura 2D-F). Per visualize il tessuto miocardico in vivo, abbiamo utilizzato pesce transgenico che esprime EGFP e DsRed2 nucleare sotto il controllo di cardio-specifica cmlc-2 promotore 11,12. L'assenza di EGFP e DsRed2 segnali fluorescenti delimitata un disco a forma zona infartuata lungo la parete laterale apicale-ventricolare.
Per eseguire le analisi cellulari e molecolari del tessuto, i cuori sono stati fissati e sezionati con un criostato. Un vetrino rappresentante con una serie consecutiva di sezioni trasversali del cuore è mostrato in Figura 3.
Le sezioni possono essere analizzati con metodi diversi (Figura 4). Per determinare l'entità della rigenerazione cardiaca rispetto cicatrici, abbiamo eseguito l'analisi istologica con fucsina acida Orange-G (AFOG) colorazione, che etichetta modo differenziato i tessuti cardiaci e fibrotica 9. Le analisi di espressione genica sono stati raggiunti secondo la procedura di ibridazione in situ
Figura 1. Induzione cryoinjury del ventricolo nel zebrafish adulto. (A) Una fotografia del criosonda. (B) Un zebrafish adulto è posizionato nella fessura della spugna con il lato ventrale alto. (CF) incisione del torace per accedere al cuore. (C) Un piccolo taglio attraverso la pelle ed i muscoli viene fatta tra i due pinne pettorali (linea rossa). (D) Le forbici sono inseriti l'incisione per tagliare la pelle a seguito freccia rossa. (E) Sotto la pelle, l'ipoderma sottile strato di argento (circondata da linea blu tratteggiata) è gentilmente aperto per accedere al cuore. (F) L'incisione si sviluppa con lapinza e il ventricolo battendo (freccia verde) è accessibile ai cryoinjury. (G) Il criosonda freddo viene delicatamente inserito nel petto per toccare il cuore. (HJ) Cuore di raccolta. (H) A incisione profonda e di lunga avviene attraverso gli archi branchiali del torace per accedere alla cavità pericardica. Due strutture cardiache sono visibili: bulbo arterioso (freccia bianca) e il ventricolo (freccia verde). (I) Il bulbo arterioso è tenere con una pinza e tirò fuori dalla cavità del corpo. (J) Il cuore è escisse dalla del corpo.
Figura 2. Controllo Rappresentante e cuori cryoinjured sezionati da adulto zebrafish transgenici che esprimono EGFP e DsRed2 nucleare in cardiomiociti. (AC) illeso cuore. (A) L'illuminazione a campo scuro mostra il ventricolo (V), bulbo arterioso (Ba, bianco) e le valvole (Va), dove è stato legato l'atrio al ventricolo. (B e C) immagini fluorescenti di t egli intatta EGFP visualizzazione ventricolo e DsRed2 espressione in cardiomiociti. (DF) Cuore a 4 giorni dopo cryoinjury (4 DPCI) (D) L'illuminazione a campo scuro rivela un disco a forma di infarto (linea gialla tratteggiata). (EF) Cardiomyocyte marcatori EGFP e DsRed2 non vengono rilevati nella zona dell'infarto, indicando il miocardio danneggiato (circondata dalla linea tratteggiata).
Figura 3. Sezionamento del cuore. (A) cuore intero con il disegno di sezioni trasversali a partire dal fondo del cuore (1 e 2, in rosso) verso l'alto del cuore (3 e 4 in verde). (B) Fotografia di una diapositiva con una serie di sezioni trasversali consecutive colorate con AFOG (Fuchsin Acid Orange-G). Le prime sezioni (1 e 2, quadrati rossi) contengono l'apice ventricolare, e le ultime sezioni del cuore (3 e 4, piazze verdi) comprendono bulbo arterioso.
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Esempi Figura 4. Di analisi eseguita su sezioni cuore a 7 giorni dopo cryoinjury. (A) AFOG (fucsina acida Orange-G) etichette di colorazione delle cellule muscolari sane in arancione, il tessuto cicatriziale che contiene collagene in blu e in rosso di fibrina. (B) In ibridazione in situ della catena pesante della miosina ventricolare (vmhc) visualizza mRNA intatto miocardio (colorazione blu). Il tessuto danneggiato è privo della trascrizione del gene cardiaco (linea rossa tratteggiata). (C) Immunoassaying di tropomiosina (verde) le etichette cardiomiociti integro e non tessuti danneggiati (circondata con la linea tratteggiata). DAPI (blu) macchie i nuclei di tutte le cellule. (D) cardiomiociti geneticamente etichettati espressa DsRed2 (rosso) nella loro nuclei. DAPI (blu) etichetta tutti i nuclei. La zona infartuata non contiene DsRed2 cellule positive (bianche linea tratteggiata).
Discussion
Cryoinjury è definito come il danno del tessuto controllata mediante l'applicazione di estrema precisione freddo 14. Diretta shock termico distrugge le cellule dalla distruzione proteina intracellulare e da formazione di cristalli di ghiaccio liquido che rompe la membrana plasmatica. Di conseguenza, le cellule danneggiate muoiono nei processi di apoptosi e necrosi 14. Entrambi questi meccanismi di morte cellulare hanno dimostrato di contribuire alla perdita di tessuto dopo infarto miocardico 15. Così, cryoinjury rappresenta un modello adeguato di indurre un infarto cardiaco. Diversi studi hanno segnalato questo metodo ben dimostrato nei mammiferi, tra cui topi, ratti, conigli e maiali 6,7. L'adattamento del protocollo cryoinjury in zebrafish permette una discussione più comparativo sulla risposta infarto tra specie diverse.
Due altri gruppi sviluppato in modo indipendente la procedura cryoinjury per il cuore zebrafish adulto. Le differenze principali sono la surmetodi di Gery, il tipo di strumenti ed applicata tempo di congelamento. Nello studio di González-Rosa et al., Il pericardio è stato aperto per strappo del tessuto invece di taglio. Hanno usato 0,3 mm in rame filamento collegato ad un tubo poliammide pre-raffreddato in azoto liquido per congelare il cuore per alcuni secondi fino scongelamento potrebbe essere osservato 10. Nello studio di Schnabel et al., Un pezzo conico di ghiaccio secco di 20 mm di lunghezza con una punta di 2 mm nel suo diametro è stato utilizzato per toccare il cuore per 10 secondi 8. I due gruppi ottenuti danno ventricolare attraverso la morte del miocardio. Il vantaggio del nostro metodo è più riproducibile una deposizione di collagene ricco di cicatrice, che imita meglio le prime risposte guarigione infarto osservate nei sistemi di mammiferi.
La fase critica durante la procedura di cryoinjury in zebrafish sta facendo una incisione attraverso la pelle e il sacco pericardico senza pungere il cuore sottostante. A Effettuare correttamentechirurgia d provoca piccolo sanguinamento. Sanguinamenti indica una puntura accidentale del ventricolo con le forbici. In tali casi, gli animali deve essere retratto dall'esperimento. Al fine di evitare la puntura del cuore, il punto di forbici dovrebbe mirare a un angolo basso alla pelle.
Un altro aspetto importante per creare una lesione riproducibile è l'esatto posizionamento della sonda criogenica freddo sul ventricolo per la durata ottimale preciso. Troppo breve tempo di congelamento si tradurrà in infiammazione con la morte delle cellule poco. Congelamento prolungata, invece, può causare danni del cuore, che può portare ad una maggiore mortalità degli animali. Abbiamo determinato che il tempo ottimale per tenere il ventricolo negli intervalli stato congelato tra 23-26 secondi per un zebrafish lunga di 2 cm adulti, e può variare dipendentemente dalla dimensione degli animali.
Poiché il protocollo è molto semplice e rapido, non ci sono limiti sperimentalini nel sottoporre numero sufficiente di animali per ottenere adeguate repliche biologiche. Il trattamento criochirurgico è molto ben tollerato dagli animali. Raccolta dei cuori a tempi diversi dopo cryoinjury consente caratterizzazione dettagliata delle fasi successive durante il processo di rigenerazione. L'analisi sperimentale dei cuori cryoinjured possono includere 1) visualizzazione di trascrizione genica mediante ibridazione in situ, 2) il rilevamento della distribuzione proteina mediante colorazione immunofluorescente, 3) l'imaging istologica di strutture diverse. Comprendere i processi di guarigione chiave dopo infarto miocardico in zebrafish avrà un impatto sul campo della biologia rigenerativa. Inoltre, potrebbe essere di beneficio per la progettazione di nuovi approcci terapeutici nella medicina rigenerativa.
Disclosures
La ricerca sperimentale sugli animali è stato approvato dall'ufficio veterinario cantonale di Friburgo.
Acknowledgments
Ringraziamo V. Zimmermann per un'eccellente assistenza tecnica e per la cura dei pesci. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo nazionale svizzero, numero di concessione: 310000_120611.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds - Truncated Molds T8 | Polysciences, Inc. | 18985 |
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