الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت
Summary
نحن هنا لشرح أنني وضعت حديثا مجموعة كرو • لحفظ بالبرودة الحيوانات المنوية الماوس. وتحسن اثنين من الخلية في مرحلة تطور الجنين مع مجمدة إذابة الحيوانات المنوية باستمرار في سلالات الفأر 5 مع استخدام هذا الطقم. على مدى فترة 1.5 سنة ، وأرشفة 49 خطوط الماوس المعدلة وراثيا عن طريق الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية مع عدة كرو • أنا في وقت لاحق واستعاد بنجاح من خلال التلقيح الاصطناعي.
Abstract
وقد أنشئت الآلاف من السلالات الجديدة وراثيا (GM) من الفئران المعدلة منذ ظهور تكنولوجيات transgenesis وخروج المغلوب. العديد من هذه الحيوانات موجودة فقط في قيمة الحيوانات الحية ، مع عدم وجود خطة احتياطية في حال الطوارئ. الحفظ بالتبريد الأجنة يمكن أن توفر هذه النسخة الاحتياطية ، ولكن مكلفة ، يمكن أن تكون الإجراءات المطولة ، ويتطلب عادة عددا كبيرا من الحيوانات من أجل النجاح. منذ اكتشاف الحيوانات المنوية التي يمكن الماوس cryopreserved بنجاح مع وكيل واق من البرد الأساسية (CPA) ، ويتألف من 18 رافينوز ٪ و 3 ٪ الحليب الخالي من الدسم ، وأصبح الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية إجراء مقبولا وفعالا من حيث التكلفة لحفظها وتوزيعها واسترداد قيمة هذه السلالات .
هنا علينا أن نظهر أنا وضعت حديثا مجموعة كرو • لحفظ بالبرودة الحيوانات المنوية الماوس. وتم تجميد الحيوانات المنوية من خمس سلالات شائعة الاستخدام من الفئران الفطرية باستخدام هذه المجموعة ، ثم تعافى. نسب أعلى للحماية من الحيوانات المنوية على الحركة (>واعتبرت 60 ٪) والحركة التقدمية السريع (> 45 ٪) بالمقارنة مع التحكم (الأساسية CPA) عن الحيوانات المنوية المجمدة مع هذه المجموعة في 5 السلالات الفطرية الماوس. وتحسنت اثنين الجنين مرحلة التطوير الخلية بعد التلقيح الاصطناعي مع الحيوانات المنوية المستردة باستمرار في جميع سلالات الفأر 5 فحصها. على مدى فترة 1.5 سنة ، وأرشفة 49 خطوط الماوس المعدلة وراثيا من قبل الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية مع عدة أنا • كرو واستردادها في وقت لاحق من خلال التلقيح الاصطناعي.
Protocol
Discussion
منذ عام 1990 ، وقد ثبت تجميد الحيوانات المنوية باستخدام بروتوكول الأساسية رافينوز 18 ٪ و 3 ٪ الحليب الخالي من الدسم يمكن الاعتماد عليها في كثير من سلالات الفئران وجرى cryopreserved عدد كبير من خطوط الماوس 1،2،3،4،5،6،7. وقد ارتبطت الأسباب الرئيسية لتلف خلايا الحيوانات المنوية خلال عملية التجميد والذوبان مع تشكيل الجليد 8،9 و 10 أنواع الاكسجين التفاعلية. وقد تم التحقيق مع مكملات الزبالين الجذور الحرة ، مثل الأحماض الأمينية ، والحد من العوامل ، مثل monothioglycerol ، في المتوسط ، وتجميد ثبت أن زيادة كبيرة في معدل التلقيح الاصطناعي مع مجمدة إذابة الحيوانات المنوية في السلالات الفطرية بما في ذلك 6 / C57BL 11،6.
في هذا البروتوكول ، وضعنا انا جديد • كرو عدة لحفظ بالبرودة الحيوانات المنوية الماوس عن طريق الاستفادة المثلى من اتفاقية السلام الشامل الأساسية مع المواد المضادة للاكسدة المتاحة تجاريا وحاصرات الجليد وعن طريق تعديل تجميد الحيوانات المنوية وإجراء عمليات التلقيح الصناعي. نسب الحماية من الحيوانات المنوية على الحركةشوهد (> 60 ٪) والحركة التقدمية السريع (> 45 ٪) لسلالات الحيوانات المنوية من خمس الماوس الفطرية المجمدة مع عدة أنا كرو •. وتحسنت بشكل ملحوظ في مرحلة الجنين 2 – الخلية معدل التنمية مع الحيوانات المنوية المجمدة ، المذوبة في سلالات الفأر 5 الفطرية مقارنة ذلك مع اتفاق السلام الشامل الأساسية 11،6.
في استخدام عدة ، المستخدم بإنشاء تعليق الحيوانات المنوية التي تتركز في الفترة من 2 تجميد الحيوانات المنوية للذكور كل سطر. إلا بنسبة لا تتجاوز 15 قش تجميد عملية سريعة وسهلة وتشغل أقل مساحة التخزين لتخزين قصيرة أو طويلة الأجل. في معظم الأحيان ، يمكن استرداد الماوس عن طريق خطوط ذوبان فقط 1 أو 2 القش.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت البحوث المقدمة هنا من قبل نهر تشارلز. الكتاب في غاية الامتنان للنماذج المهندسة وراثيا ومجموعة خدمات وموظفي الأجنة لرعاية الحيوان وحقن الهرمون.
Materials
| Materials | Supplier | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| CPA | Charles River | Provided with kit | |
| STM | Charles River | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nunc | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| hCG | Intervet | ||
| PMSG | EMDChemicals | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD | 305106 | |
| Scissors | Roboz | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
