Her vil vi demonstrere den nyudviklede I • Cryo-kit til mus sæd nedfrysning. To-celle stadie embryo udvikling med frossen-optøet sæd blev forbedret konsekvent i 5 mus stammer med brugen af dette kit. Over en 1,5 årig periode, var 49 genetisk modificerede mus linjer arkiveres af sædceller nedfrysning med I • Cryo kit og senere succes inddrives ved IVF.
Tusindvis af nye genetisk modificerede (GM) stammer af mus er blevet skabt siden indførelsen af transgenese og knockout-teknologier. Mange af disse værdifulde dyr eksisterer kun som levende dyr, uden backup-plan i tilfælde af en nødsituation. Kryopræservering af embryoner kan levere denne backup, men det er dyrt, kan være en langvarig procedure, og generelt kræver et stort antal dyr for succes. Siden opdagelsen af, at musen sædceller med held kan kryopræserveres med en grundlæggende cryoprotective agent (CPA) bestående af 18% raffinose og 3% skummetmælk, er sædceller kryopræservering blevet en acceptabel og omkostningseffektiv procedure for arkivering, distribution og nyttiggørelse af disse værdifulde stammer .
Her viser vi et nyudviklet I • Cryo-kit til mus sæd nedfrysning. Sperm fra fem almindeligt anvendte stammer af indavlede mus blev indefrosset med dette kit og steg derefter. Højere beskyttelse nøgletal af sperm motilitet (>60%) og hurtig progressiv motilitet (> 45%) sammenlignet med kontrolgruppen (grundlæggende CPA) blev anset for sæd frosset med dette sæt i 5 indavlede mus stammer. To celle stadie embryo udvikling efter IVF med den gendannede sæd blev forbedret konsekvent i alle 5 mus undersøgte stammer. Over en 1,5 årig periode, var 49 GM musen linjer arkiveres af sædceller nedfrysning med I • Cryo kit og senere inddrevet ved IVF.
Siden 1990 har den grundlæggende sædceller fryse-protokollen ved hjælp af 18% raffinose og 3% skummetmælk blevet bevist pålidelig i mange stammer af mus og et stort antal mus linjer er blevet kryopræserveres 1,2,3,4,5,6,7. De hyppigste årsager til skader på sædceller i løbet af nedfrysning og optøning processen har været forbundet med isdannelse 8,9 og reaktive ilt arter 10. Tilskud af frie radikaler skraldemanden, som aminosyrer og reducerende stoffer, såsom monothioglycerol, i indefrysning medium blev undersøgt og bevist at øge IVF sats med frossen-optøet sæd i indavlede stammer herunder C57BL / 6 11,6.
I den foreliggende protokol, udviklede vi en ny I • Cryo-kit til musen sæd nedfrysning ved at optimere de grundlæggende CPA med kommercielt tilgængelige antioxidanter og is-blokkere, og ved at ændre sæd nedfrysning og IVF procedure. Beskyttelse nøgletal af sperm motilitet(> 60%) og hurtig progressiv motilitet (> 45%) sås for sæd fra fem indavlede mus stammer frosset med I • Cryo kit. Den 2-celle stadie embryo udvikling sats med frossen-optøet sæd i 5 mus indavlede stammer blev markant forbedret i forhold til, at med de grundlæggende CPA 11,6.
Ved brug af kit, skaber brugeren en koncentreret sæd suspension ved at fryse sæd fra 2 hanner for hver linje. Ved kun at fryse 15 sugerør processen er hurtigt, nemt og optager mindre lagerplads i kortere eller længere tids opbevaring. De fleste gange, kan musen linjer kan inddrives ved optøning kun 1 eller 2 sugerør.
The authors have nothing to disclose.
Forskningen præsenteres her blev støttet af Charles River. Forfatterne er mest taknemmelig for, at gensplejsede Modeller og Service gruppen og embryologi personale til pasning af dyr og hormon injektion.
Materials | Supplier | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
CPA | Charles River | Provided with kit | |
STM | Charles River | Provided with kit | |
IVF medium | Charles River | Provided with kit | |
0.25 ml plastic straw | Charles River | Provided with kit | |
Sperm freezing canister | Charles River | Provided with kit | |
Cane and goblet | Charles River | Provided with kit | |
Mineral oil | Sigma | M5310 | Should be embryo tested |
KSOM medium | Millipore | MR-106-D | |
35 mm Petri dish | Falcon | 351008 | |
Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
4-well multidish | Nunc | 73521-424 | |
Pipettor | Gilson | ||
Pipette tips | Various | ||
37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
LN2 storage system | Various | ||
37°C water bath | VWR | 89032-196 | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
hCG | Intervet | ||
PMSG | EMDChemicals | 367222 | |
1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD | BD309625 | |
Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5602 | |
30 gauge ½ needle | BD | 305106 | |
Scissors | Roboz | RS-6802 | |
Forceps | Roboz | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |