माउस शुक्राणु cryopreservation और रिकवरी मैं · क्रायो किट का उपयोग
Summary
यहाँ हम नव विकसित माउस शुक्राणु cryopreservation के लिए मैं • क्रायो किट प्रदर्शित करता है. दो सेल जमी-thawed शुक्राणु के साथ मंच भ्रूण विकास लगातार इस किट के उपयोग के साथ 5 माउस उपभेदों में सुधार किया गया था. एक 1.5 वर्ष की अवधि के दौरान, 49 आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस लाइनों शुक्राणु cryopreservation के द्वारा मैं • क्रायो किट के साथ संग्रहीत थे और बाद में सफलतापूर्वक आईवीएफ द्वारा बरामद.
Abstract
नया चूहों आनुवंशिक रूप से संशोधित (जीएम) उपभेदों के हजारों transgenesis और पीटा प्रौद्योगिकियों के आगमन के बाद से बनाया गया है. जीवित पशुओं के रूप में इन मूल्यवान पशुओं के कई केवल आपात स्थिति के मामले में कोई बैकअप योजना के साथ मौजूद हैं. भ्रूण की cryopreservation इस बैकअप प्रदान कर सकते हैं, लेकिन महंगा है, एक लंबी प्रक्रिया हो, कर सकते हैं और आम तौर पर सफलता के लिए पशुओं की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है. खोज की है कि माउस शुक्राणु सफलतापूर्वक एक बुनियादी cryoprotective एजेंट raffinose 18% और 3% मलाई निकाला दूध के मिलकर (सीपीए) के साथ cryopreserved किया जा सकता है के बाद से, शुक्राणु cryopreservation एक स्वीकार्य और लागत प्रभावी प्रक्रिया के संग्रहण, वितरण और इन मूल्यवान उपभेदों की वसूली के लिए बन गया है .
यहाँ हम एक नव विकसित माउस शुक्राणु cryopreservation के लिए मैं • क्रायो किट प्रदर्शित करता है. जन्मजात चूहों के पांच आमतौर पर इस्तेमाल किया उपभेदों से शुक्राणु इस किट का उपयोग कर जमे हुए थे और तब बरामद. शुक्राणु गतिशीलता के उच्च सुरक्षा अनुपात (>60%) और नियंत्रण (सीपीए बुनियादी) की तुलना में तेजी से प्रगतिशील गतिशीलता (> 45%) 5 जन्मजात माउस उपभेदों में इस किट के साथ जमे हुए शुक्राणु के लिए देखा गया था. बरामद शुक्राणु के साथ दो सेल चरण आईवीएफ के बाद भ्रूण विकास लगातार सभी 5 माउस उपभेदों की जांच में सुधार किया गया था. एक 1.5 वर्ष की अवधि के दौरान, 49 जीएम माउस लाइनों शुक्राणु cryopreservation के द्वारा मैं • क्रायो किट के साथ संग्रहीत थे और बाद में आईवीएफ द्वारा बरामद किया गया.
Protocol
Discussion
1990 के बाद से, बुनियादी शुक्राणु ठंड raffinose 18% और 3% मलाई निकाला दूध का उपयोग प्रोटोकॉल चूहों के कई उपभेदों में किया गया है विश्वसनीय सिद्ध और माउस लाइनों की एक बड़ी संख्या है 1,2,3,4,5,6,7 cryopreserved किया गया है. ठंड और विगलन प्रक्रिया के दौरान शुक्राणु कोशिकाओं को नुकसान का प्रमुख कारण बर्फ 8,9 गठन और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों 10 के साथ संबद्ध किया गया है. ऐसे एमिनो एसिड के रूप में मुक्त कट्टरपंथी मैला ढोने वालों, और कम करने के एजेंट, monothioglycerol जैसे ठंड माध्यम से, के साथ पूरकता की जांच की और काफी जमी जन्मजात उपभेदों में thawed C57BL / 11,6 6 सहित शुक्राणु के साथ आईवीएफ की दर में वृद्धि सिद्ध किया गया था.
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम माउस शुक्राणु cryopreservation के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध antioxidants और बर्फ ब्लॉकर्स के साथ बुनियादी सीपीए अनुकूलन और शुक्राणु ठंड और आईवीएफ प्रक्रिया को संशोधित करके एक नया मैं • क्रायो किट विकसित की. शुक्राणु गतिशीलता के संरक्षण अनुपात(> 60%) और तेजी से प्रगतिशील गतिशीलता (> 45%) मैं • क्रायो किट के साथ जमे हुए पांच जन्मजात माउस उपभेदों से शुक्राणु के लिए देखा गया था. 2 सेल 5 माउस जन्मजात उपभेदों में जमी thawed शुक्राणु के साथ मंच भ्रूण विकास दर स्पष्ट रूप से बुनियादी सीपीए 11,6 के साथ की तुलना में सुधार हुआ है.
किट का उपयोग कर, उपयोगकर्ता प्रत्येक पंक्ति के लिए 2 पुरुषों से ठंड शुक्राणु द्वारा एक केंद्रित शुक्राणु निलंबन बनाता है. केवल ठंड 15 तिनके तक की प्रक्रिया तेजी से आसान है, और कम या लंबी अवधि के भंडारण के लिए कम भंडारण अंतरिक्ष occupies. सबसे अधिक बार, माउस लाइनों केवल 1 या 2 तिनके विगलन द्वारा बरामद किया जा सकता है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहाँ प्रस्तुत शोध चार्ल्स नदी द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों के सबसे अनुवांशिक इंजीनियर मॉडल और सेवा समूह जानवरों की देखभाल और हार्मोन इंजेक्शन के लिए और भ्रूणविज्ञान स्टाफ के लिए आभारी हैं.
Materials
| Materials | Supplier | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| CPA | Charles River | Provided with kit | |
| STM | Charles River | Provided with kit | |
| IVF medium | Charles River | Provided with kit | |
| 0.25 ml plastic straw | Charles River | Provided with kit | |
| Sperm freezing canister | Charles River | Provided with kit | |
| Cane and goblet | Charles River | Provided with kit | |
| Mineral oil | Sigma | M5310 | Should be embryo tested |
| KSOM medium | Millipore | MR-106-D | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | 351008 | |
| Heat sealer | ABTEC | TISH-200 | |
| 4-well multidish | Nunc | 73521-424 | |
| Pipettor | Gilson | ||
| Pipette tips | Various | ||
| 37°C + 5% CO2 incubator | Various | ||
| LN2 storage system | Various | ||
| 37°C water bath | VWR | 89032-196 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| hCG | Intervet | ||
| PMSG | EMDChemicals | 367222 | |
| 1cc syringe w/ 26G 3/8 needle | BD | BD309625 | |
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5602 | |
| 30 gauge ½ needle | BD | 305106 | |
| Scissors | Roboz | RS-6802 | |
| Forceps | Roboz | RS-5135, RS-5110, RS-5005 |
References
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