Summary
Inokulering av
Abstract
De Trypanosoma cruzi akuta infektioner som uppkommer i barndomen och barndomen verkar asymtomatisk, men ungefär en tredjedel av kroniskt infekterade fall visar Chagas sjukdom upp till tre decennier eller senare. Autoimmunitet och parasit uthållighet tävlar teorier för att förklara patogenesen av Chagas sjukdom 1, 2. Att separera roller parasiter uthållighet och autoimmunitet i Chagas sjukdom har vi ympa T. cruzi i luften kammare befruktade ägg. Det mogna kyckling immunsystemet är en tät biologisk barriär mot T. cruzi och infektionen är utrotad på utvecklingen av sitt immunförsvar i slutet av den första veckan i tillväxt 3. Kycklingarna är parasit-gratis på kläckning, men de behåller integreras parasiten mitokondrie kinetoplast DNA (kDNA) minicircle inom det egna genomet som överförs till deras avkomma. Dokumentation av kDNA minicircle integrationen i kyckling genomet erhölls genom ett Targeted primära Svans-PCR, Southern-hybridiseringar, kloning och sekvensering 3, 4. Den kDNA minicircle integrationer bristning öppna läsramar för transkription och immunfaktorer systemet, (GTPas) fosfatas, adenylatcyklas och fosforylaser (PKC, NF-kappa B-aktivator, PI-3K) som är associerad med cellfysiologi, tillväxt och differentiering 3, 5 - 7, och andra genfunktioner. Allvarlig myokardit grund avvisande av fibrer mål hjärta av effektenheter cytotoxiska lymfocyter ses i de muterade kDNA kycklingarna, som visar en inflammatorisk kardiomyopati som liknar den som ses hos människa Chagas sjukdom. Synnerhet, hjärtsvikt och muskelsvaghet är närvarande i vuxna kycklingar med kDNA bristning av dystrofingenen i kromosom 1 8. Liknande genotipic förändringar förknippas med vävnadsdestruktion utföras av effectors CD45 +, CD8γδ +, CD8a lymfocyter. Således denna protozo-infektion kan inducera genetiskt driven autoimmun sjukdom.
Protocol
1. Tillväxt av parasiter
- Växa trypomastigote former av T. cruzi Berenike och β-galaktosidas-expression Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 i murin muskel-cell (L6) odlas i Dulbeccos minimalt essentiellt medium med 10% FSB, 100 lU / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin och 250 nM L-glutamin (pH 7,2), 5% CO2 vid 37 ° C. Frisimmandet trypomastigotes i supernatanten mediet användes för att inokulera hönsägg.
- Växa Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 lager odlades i DMEM med 20% FBS. Lb promastigote form i den exponentiella tillväxtfasen för att inokulera ägg 9.
2. Parasit Inokulering i befruktade hönsägg
- Inokulera en suspension av 100 T. cruzi trypomastigotes i 10 | il av odlingsmediet genom en 2 mm diameter hål i äggskalet på toppen av luftkammaren från stegX fertila ägg. Invasionen och replikation av de virulenta parasiter i embryot celler visas i bild S1. Kontrollgrupperna är som följer: a) kontroll kycklingar, b) mock kontroll ägg får 10 pl odlingsmedium, c) Stage X befruktade ägg inokulerade med en suspension av 100 lb promastigoter i 10 pl odlingsmedium T.. cruzi och Lb tillhör kinetoplastidsjukdomar familjen. Respektive dessa protozoer växer fritt i cytoplasman eller i parasitophorous vacuole av värdceller 10.
- Täta hål med tejp.
- Inkubera T. cruzi-infekterade ägg och mock och oinfekterade kontrollprover vid 37,5 ° C och 65% fuktighet under 21 dagar.
- Håll kycklingar som kläcks i inkubatorn i 24 h och därefter vid 32 ° C i tre veckor.
3. Att få ett prov för DNA-extraktion
- Perifera mononukleära celler erhölls från kycklingar: en)kläckts från T. cruzi inokulerade äggen, b) kontroller, c) hånar får 10 pl odlingsmedium, d) kläckt ur Lb inokulerade ägg, vita blodkroppar från kycklingar behandlas för DNA-extraktion enligt med ett standardprotokoll 11.
- Extrahera DNA också från sperma som samlats från tuppar och från ofruktbar oocyter (<5 mm) som insamlats från höns kläckta ur ägg inokulerade med T. cruzi, och från hönor kläckts från kontroll ägg 3, 4.
- Extrahera kDNA från T. cruzi epimastigote bildar och, dessutom, från Lb promastigoter, såsom beskrivits på annat håll 9.
4. Primers och prober
Primrarna som användes för PCR-amplifieringar och de termiska förhållanden visas i tabell 1.
De prober som används i Southern blot-hybridiseringar var:
- Vildtyp minicircle (~ 1,4 kb) sekvenser purierad från T. cruzi epimastigote former;
- Minicircle fragment (362 bp) erhölls genom Nsi I-kluvna fragment av vildtyp kDNA;
- Nukleärt DNA (nDNA) upprepad sekvens (188 bp) erhölls genom amplifiering av parasit-DNA med Tcz1 / 2-primrar. Sonderna renades från 1% agarosgeler 3.
- Vildtyp minicircle (~ 0,820 kb) sekvenser från LB promastigoter.
5. PCR Analyser
- Kör standard PCR förfarande med genomiska DNA från infekterade kycklingar och oinfekterade kontroller och hånar med T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 och kDNA s35/s36 13 primrar. Dessutom kör PCR med genomiska DNA från kycklingar som kläckts ur Lb infekterade-ägg med protozoiska specifika LB3 och Lb5 primers (tabell 1).
- Göra reaktionsblandningen med 100 ng mall-DNA, 0,4 ^ M av varje par av primrar, 2 E Taq DNA-polymeras, 0,2 mM dNTP, och 1,5 mM MgCb
- Inställd termocykler för 95 ° C under 5 min, 30 cykler av 30 sek vid 95 ° C/30 sek vid 68 ° C / 1 min vid 72 ° C med 5 min slutlig extension vid kylning.
- Analysera amplifieringsprodukter i 1,3% agarosgel, vilken överförs till en positivt laddat nylonmembran (GE Life Sciences) med den alkaliska metoden för hybridisering med specifika prober märkta med [α-32 P] dATP med användning av Random Kit Primer Labeling (Invitrogen , Carlsbad, CA).
6. Genomiska Southern Blöts
- Använda Mbol och / eller med Eco RI (Invitrogen) enzymer som gör enkel-snitt i minicircles integrerade i DNA-prover av kroppens vävnader.
- Digest DNA från infekterade kontroll kycklingar och från kycklingar kläckts från ägg som ympats med virulent T. cruzi bildas.
- Utsätta digereringar av DNA från T. cruzi ochfrån kyckling testprover för elektrofores i 0,8% agarosgel vid 50 V över natten vid 4 ° C.
- Överföra separerade DNA-band till positivt laddade nylonmembran.
- Hybridisera DNA-banden med radioaktivt märkt kDNA sond.
- Tvätta membranet två gånger i 15 min vid 65 ° C med 2X SSC och 0,1% SDS, två gånger under 15 min vid 65 ° C var och en med 0,2 X SSC och 0,1% SDS och autoradiograf för variabla tidsperioder.
7. Riktad Prime TAIL-PCR
- Erhålla amplifiering av kDNA minicircle integreras i kyckling-genomet genom en modifierad Svans-PCR-teknik, som kombinerar kDNA primrar med specifik primer innehåller 2 i tre walk-in cykler innesluten PCR, såsom visas i figur 1.
- Primära cykeln: Varje reaktion innefattar 200 ng mall-DNA, 2,5 mM MgCl2 och 0,4 | iM av primrama kDNA (S34 eller S67), 0,2 mM dNTP, 2,5 U Taq-Platinum Invitrogen (, Carlsbad, CA). Använda kDNA primers i kombination med 0,04 | iM av Gg primrar (GG1 till Gg6, tabell 1), var för sig. Inställd temperatur från 57,9 till 60,1 ° C under kDNA primrar och från 59,9 till 65,6 ° C under CR-1-primer. Observera att dessa temperaturer är högre än de som (~ 45 ° C) som krävs för de degenererade godtyckliga primers som användes i svansen-PCR 10. Använd temperatur och cykler (MyCycle Thermocycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) som beskrivs i ett tidigare papper 3.
- Sekundärskolan: Späd PCR-produkter från primär cykel 1:40 (v / v) i vatten. kDNA primers S35 och S35 antisense ersatte tidigare, tillsammans med samma Gg primers.
- Tertiär cykel: Späd PCR produkter från sekundärskolan 1:10 (v / v) i vatten och kombinera Gg primers med S67 antisense-eller S36, separat.
- Klona PCR tertiära cykelprodukter: Klon direkt i pGEM T lätt-vektorn (Promega, Madison, WI)produkter i sista förstärkning som hybridisera med kDNA sond.
- Välja kloner genom hybridisering med kDNA sond och sekvens.
- Validera tpTAIL-PCR i en blandning av 300 pg av kDNA från T. cruzi med 200 ng DNA från kontrollprover fåglar utsätts aldrig kDNA. De temperatur-och amplifiering cykler är samma som används för test fåglarnas DNA.
8. Chagas sjukdom Clinic Manifestation
- Övervaka tillväxt och utveckling av kycklingar kläcktes från T. cruzi smittade ägg och friska kontroller kläcktes från icke-infekterade ägg dagligen för dödlighet och vecka för sjukdomar manifestationer.
- Upptäcka kliniska avvikelser i dessa kycklingar (figur 2) och gör Elektrokardiograf (EKG) inspelningar för att utvärdera de elektriska axlar, priser hjärta och arytmier 3.
- Ämne kDNA-muterat och kontrollerar kycklingar varje månad för att EKG-inspelningar av augmented ventrikulär unipolar leder aVF (vänster ben), AVL (vänster arm) och AVR (höger arm), och att bedöma avvikelse genomsnittliga elektriska axel till vänster, vilket tyder på hjärtförstoring 3.
9. Patologi och Immunokemisk Analyser
- Spela hjärta och kropp index vikt efter naturliga död kDNA muterade kycklingar (Figur 3). Skaffa index även för kontroll kycklingar i samma ålder och kön.
- Ta sektioner från hjärtat, matstrupen, tarmar, skelettmuskulatur, lungor, lever och njurar.
- Fix vävnad i buffrad 10% formalin (pH 7,4), bädda i paraffin och skärs till 4 m tjocka sektioner för Hematoxylin-Eosin (HE) färgning och histologiska analyser (Figur 3).
- Harvest och delningsspår vävnader från embryon kläckts från ägg inokulerade med parasiter som uttrycker β-galaktosidas, och om inte X-Gal-fläck. 9
- Fixera den andra hälften av embryoceller vävnader i 10% formalin, pH 7,4 och fortsätt som i steg 9,3.
- Klipp 4 nm tunna paraffininbäddad vävnadssnittet och montera på glasskiva för mikroskopisk undersökning.
- Inkubera sektioner som visar X-Gal-färgade blåa celler med humant chagasic antiserum (1:1024 utspädning) mot anti-T cruzi-antigen.
- Tvätta sektioner trice med PBS, pH 7,4, 5 min vardera.
- Fläck blå celler i embryot vävnader genom andra inkubering med en fluorescein-konjugerad kanin-anti-humant IgG.
- Tvätta avsnitt med PBS (steg 8), montera med täckglas och observera de blå cellerna ljus-up gröna efter granskning under UV ljus vid 502 nm våglängd, 200x förstoring, för colocalizing T. cruzi i embryoceller.
10. Fenotyp immunsystemceller i hjärtat lesioner
- Fenotyp immuneffektorer celler i vävnadssnitt av hjärtat från kDNA-positiva och från kontroll kDNA-negativa kycklingar.
- Placera glasen ivävnadssektion inbäddades i paraffin vid 65 ° C under 30 min för att smälta vaxet föregående att lämnas i fyra tvättar i 100% till 70% xylen och sedan i absolut etanol PBS under 5 min vardera.
- Skölj glasen i destillerat vatten, lufttorka och behandla med specifika monoklonala antikroppar (fluorescein-eller R-fykoerytrin-konjugerade monoklonala antikroppar) som erhållits från SouthernBiotech, Birmingham, AL.
- Använd mus-anti-kyckling Bu-1 (Bu-1 a och BU-1-alleler b, Mr 70-75 kDa) Mab AV20 att erkänna monomorf avgörande på B-celler antigenerna av inavlade kycklingar.
- Använd mus-anti-kyckling CD45, Ig isotyp IgM1 κ specifika kyckling bräss härstamning celler (Herr 190 till 215-kDa variant).
- Använd mus-anti-kyckling TCRγδ + (Mr 90-kDa heterodimer) Mab som är specifik för bräss beroende CD8a + T-celler.
- Använd mus-anti-kyckling Mab CD-8 som är specifik för kyckling α-kedja (Mr 34 kDa) erkänner: ee CD8-celler i tymocyter, mjälte, hjärta och andra vävnader.
- Använd mus-anti-kyckling KuL01 att enbart känna igen monocyter / makrofager i fagocytsystemet.
- Tvätta sliden tre gånger med 0,1 M PBS, pH 7,4, 5 min vardera efter inkubation med specifika anti-fenotypen antikropp under 90 min i en fuktig kammare.
- Montera bilden med buffrad glycerol för tentamen under ett lysrör mikroskop med utsläpp filter av våglängd 567 och 502 nm, respektive att upptäcka röda och grön fluorescens-märkta celler (Figur 4).
11. Dataanalyser
- Använd databasen kycklingen genomet ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) för BLASTN sekvensanalyser.
- Använd clustalw inriktningar för att bestämma e-värde poäng.
- Anställa GIRI upprepa maskering algoritmen CENSOR ( http://girinst.org/censor/index.php ) för lokalisering av olika klasser av upprepningar i chimära sekvenser.
- Anställa kinetoplastidsjukdomar Insättning och borttagning sekvens Sök Tool (KISS) för att identifiera potentiella gRNAs i kDNA sekvenser, med hjälp av WU-blastn-modifierad matris 3.
- Använda T. cruzi sekvenser http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-~~HEAD=NNS 2164-8-133-s1.fas att söka in gRNAs i kDNA-värd DNA-chimärer. 11,6) Använd Students t och Kolmorov-Smirnov test, respektive, för att upptäcka signifikanta skillnader mellan avvikelser av elektriska axlar och mellan hjärt / kroppsvikt index som erhållits i experiment-och kontrollgrupper, och för att upptäcka dödlighet förhållandet signifikanta skillnader mellan grupper av kläckta kycklingar från T. cruzi inoculated ägg och från kontroller.
12. Representativa resultat
Inokulering av 100 virulenta T. cruzi trypomastigotes i luften kammare fertila kycklingägg minskar inte signifikant förhållandet mellan kycklingar, som kläckts vid liv. Cirka 60% kläcks friska kycklingar och 40% kan genomgå embryo kondensering eller embryo död på kläckning. De överlevande kycklingar behålla kDNA minicircle sekvensen integreras i genomet. Det förväntas att en del kycklingar kommer att dö med hjärtförstoring och fel i veckorna efter kläckning. De återstående kycklingarna kommer att växa till utåt friska vuxna. I alla skeden av livet DNA extraherat från sina mononukleära blodceller kommer att ge PCR-amplifiering av kDNA, men inte nDNA. Den riktade-prime TAIL-PCR 3, 4 produkter som klonas och sekvens visar kDNA minicircles främst att integreras i kodande regioner i macrochromosomes 1 till 5. Hönsen visar flera kDNA integrations i gener som kodar för celltillväxt och differentiering, immunsystem faktorer reglering och DNA-reparation är kandidater att genomgå avstötning av själv målvävnader (Figur 3). Till exempel är det kyckling visar kDNA mutation med bristning av dystrofingenen (figur 5), som kodar ett protein som binder till cytoskelettet till cellmembranet, en kandidat för att utveckla autoimmun inflammatorisk kardiomyopati och misslyckande.
Dessa genomiska modifieringar inte sett på kycklingar som kläckts från Lb infekterade ägg. Det finns skillnader mellan T. cruzi och Lb kDNA minicircles; Den T. cruzi k DNA minicircle genomsnittet 1,4 kb struktur med fyra variabla region (VR) med mellanliggande bevarade regioner (CR) varje presentera CSB1 och CSB2 och CSB3 regioner, där CA-rika böjda DNA anses specifika platser för initiering av replikering, transkription, rekombination, och för lateral DNA-överföring
| Primer | Mål-DNA | Sekvens | Tm * |
| S 34 | T. cruzi kDNA | 5 'ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3' | 57,9 |
| S 67 | T.cruzi kDNA | 5 'GGT TTT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3' | 60,1 |
| S 35 | T. cruzi kDNA | 5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3' | 59,4 |
| S 36 | T. cruzi kDNA | 5 'GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3' | 57,9 |
| LB3 | Ib kDNA | 5 'GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3' | 55,9 |
| Lb5 | Ib kDNA | 5 'CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3' | 61,4 |
| Gg 1 | Gallus gallus | 5 'AGC TGA TCC TAA AGG CAG AGC 3' | 60,1 |
| GG2 | G. gallus | 5 'CTG AGC CTC TGCTTT GAA En 3 ' | 56,8 |
| Gg3 | G. gallus | 5 'TTT Luftfartsverket AGC AGA GGC TCG G 3' | 60,1 |
| Gg4 | G. gallus | 3 'GCT CTG CCT TTA GGA TCA GCT 5' | 64,2 |
| Gg5 | G. gallus | 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' | 62,3 |
| Gg6 | G. gallus | 3 'CTG TTA GCA TGA GGC TTC ACA A 5' | 60,4 |
Tabell 1. Primes användes i PCR-amplifieringar. * Tm = genomsnittlig glödgningstemperatur ° C.
Figur 1. TP Svans-PCR-strategi användes för att detektera Trypanosoma cruzi kDNA integrering i Gallus gallus-genomet. A) En chimär sekvens med ett fragment av kDNA minicircle bevarade (mörkblå) och variabla (ljusblå) regioner integreras i locus NW_001471687.1 vid kromosom 4 (AY237306) av kyckling 10 genomet (grön) användes för att erhålla värden specifika primeruppsättningar (GG1 till Gg6). B) De tp Svans-PCR-amplifieringar initieras (primär körning) genom annealing av de minicircle-specifika S34 eller S67-primrar i kombination med de kyckling-specifika GG1 till Gg6 primrar. Utspädda produkter som mall för den sekundära cykeln med S35 (sense / antisense) primers och kombinationer av Gg primers. I den tertiära cykel en utspädning av de sekundära produkterna underkastades amplifiering med kDNA S36 eller S67 antisense-primrar i kombination med Gg primerns. C) Dessa amplifieringsprodukter separerades i 1% agarosgeler och överfördes till nylonmembran, hybridiserades med den specifika sonden kDNA. Prover med positiv signal användes för kloning för att bestämma punkten för integrering. Kombinationerna av kDNA och riktade GG1 att Gg6 visas på toppen av gelén. De sekventiella PCR-reaktioner amplifierade mål-kDNA-värd-DNA-sekvenser med kDNA minicircles (blå) och fågel-sekvensen (grönt). (Utdrag ur PLoS Neglected Tropical Diseases 3).
Figur 2. Kliniska manifestationer av nedsatt hjärtfunktion i en 9-månader gammal kyckling genetiskt modifierad genom integrationen av den mitokondriella kDNA minicircle från T. cruzi. Den dåliga blodets syresättning av mitokondriella muterade kDNA kycklingen visar en lila kam kontrasterar med den ljusa röda kammen av kontroll 9-månader gammal chicken fri från skador på hjärtat. (Modifierad från PLoS Neglected Tropical Diseases 3).
Figur 3. Gross och mikroskopisk patologi i Gallus gallus med kDNA mutationer. A) Hjärtförstoring i en 9-månader gammal hönan som dog av hjärtsvikt. B) Kontroll hjärtat från en icke-infekterade 9-månader gammal höna. C) Avslag på målceller hjärta av cytotoxiska lymfocyter: En minimal avslag enhet med lyserar i målceller genom immuna lymfocyter avbildas (cirkel). D) Kontroll hjärtat histologi (modifierat från PLoS Neglected Tropical Diseases 3).
Figur 4. Immunocytokemiska analyser av immunsystemceller infiltrerande centrala kDNA-muterat kyckling som visas i figur 3. A) CD45 + lymfocyter identifierats (pilar) i hjärtat ledioxid med en fykoerytrin-märkt specifik monoklonal antikropp. B) CD8 ^ γδ immuna lymfocyter (pilar) är involverade i allvarlig destruktion av hjärtat. C) Rikliga CD8a + T-celler som finns i allvarliga skador med lyserar hjärta cell. Skären visar frånvaron av immunsystemceller med kontroll ej infekterade kycklingen hjärtat (modifierad från PLoS försummade tropiska sjukdomar 3).
Figur 5. Chagas-liknande dilaterad kardiomyopati inflammatoriska i en F2 avkomma med kDNA integration i dystrofingenen. A) Dilated hjärta i ett 10-månader gammal kyckling som upptar det mesta av brösthålan (hjärta vikt = 16 g). B) Mörka runda mononukleära celler infiltrerar och förstör hjärtmuskulaturen av kDNA-muterade höns. C) Normal hjärtats storlek (vikt 7 g) av en 10-månader gammal styrning kyckling. D) Normal histologi av en kontroll kyckling hjärta. (Modified från PLoS försummade Tropical Sjukdomar 3).
Figur 6. Jämförande patologi i kDNA muterade-kyckling och i human Chagas sjukdom. A) Svår myokardit och Target Heart lyserar celler i kDNA-muterade kyckling. B) Svår myokardit och rikta lyserar cellen genom immuna lymfocyter i ett fall av Chagas hjärtsjukdom. C) Avslag på hjärtceller som immuna lymfocyter i kDNA-muterade kyckling. D) Avslag på hjärtceller som immuna lymfocyter i humant Chagas sjukdom. Färgades genom hematoxilin och eosin. (Modifierad från Memórias gör Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 14).
Discussion
I motsats till däggdjur är mottagliga för livslångt T. cruzi infektioner, kycklingar är terapiresistenta T. cruzi-infektion. Den stora fördelen med kyckling modellsystem är elimineringen av infektionen tidigt i utvecklingen av den embryonala immunsystemet. Således är det enda parasiten DNA som kvarblir i kycklingen kroppen integreras på flera loci.
Användning av den optimala mängden av virulent T. cruzi trypomastigotes att inokulera fertila ägg är det kritiska steget för att erhålla integrering av kDNA minicircles i kycklingembryo-genomet. Hastigheten för levande kycklingar kläckning av ägg inokulerade med 100 trypomastigotes är fyra gånger högre än den som erhålles med 500 parasiter. Försiktighet bör iakttas för att inokulera parasiter suspension i 10 | il av odlingsmediet in i ägget luftkammaren. Det bör inte läckage av äggvita. Under optimala förhållanden tar det intracellulära parasitinfektion plats witunna några timmar efter inkubering och parasit förökning inuti värdceller intäkterna under en vecka, därefter infektionen elimineras genom den medfödda immuniteten. Den kDNA integration kräver en levande infektion och ympning av nakna minicircles i tidiga ägg embryo kyckling inte resulterar i integrationen. De kDNA-positiva embryon och kontroller ska hållas under kontrollerade förhållanden vid 37,5 ° C och 65% luftfuktighet. Kycklingarna hålls i bur under två veckor vid 33 ° C rumstemperatur. Därefter kycklingar hålls i burar på suspenderade ställningar separerade med 1,5 gångar meter bredd i ett rum vid 22 ° C med filtrerad luft och övertryck under konstant utmattning för att säkra djurskyddsbestämmelserna. De vuxna matas kyckling-chow och dricka drickbart rinnande vatten för att uppnå full tillväxt och mognad, om ägg på fem månaders ålder. Underhåll av hygieniska rutiner är viktiga för reproducerbarhet av resultat när man arbetar med T. cruzi inokuleradestill fertila hönsägg.
I kyckling modellsystem för T. cruzi infektioner utrotas Efter utveckling av immunsystemet i den tidiga perioden av embryon tillväxt. Dessutom att vara sjukdomsfri de kycklingar som kläcks från T. cruzi ympade ägg, i brist på specifika antikroppar, är toleranta mot parasiten antigener. Avvisandet av cellerna mål hjärta genom cytotoxiska lymfocyter (minimal avslag enhet, figur 3) ses i kDNA-muterade höns som visar genotyp modifieringar och nedbrytningsprodukter av immunologisk övervakning 3. De genotypiskt modifierade T-celler närvarande accelererad avstötning av automatisk vävnader i kroppen. Den huvudsakliga lesionsstället är hjärtat, vilket är ett kännetecken för Chagas sjukdom. Övergången från en fysiologisk (övervakning) till ett physiopathologic tillstånd ses i kDNA-muterade kyckling visar klonalt spridning av cytotoxiska lymfocyter 3.
Thans transkingdom modellsystem visar en parasit-inducerad, genetiskt-driven autoimmun sjukdom (Figur 6), som härrör från genomet ändringar av T. cruzi kDNA minicircle integrationer. Dessa ändringar är inte ses kycklingar som kläckts från Lb-inokulerade ägg.
Detta fenomen antyder att experimentell behandling av inflammatorisk autoimmun kardiomyopati hos kDNA muterade kycklingar kan kräva läkemedlet undertryckande av benmärg stamfader specifik T-cells fenotyp infiltrerande myokardiet, och transplantation av histokompatibla friska benmärgen för att förhindra avstötning av själv-vävnad.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi står i skuld till Nancy R. Sturm, Institutionen för immunologi, mikrobiologi och molekylärbiologi, David Geffen School of Medicine, University of California i Los Angeles, för kritisk läsning av manuskriptet. Det nationella rådet för forskning-CNPq, och Stiftelsen för forskning, utveckling-FAPDF, Brasilien, stödde studien. Vi tackar den tekniska hjälp av Alessandro O. Souza, Maria C. Guimaro, Ciro Cordeiro, Ana de Cassia Rosa, Roseneide Alves, och Rafael Andrade, från University of Brasilia, Brasilien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase Recombinant | Invitrogen | 11615-010 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-030 | |
| Random Primers DNA Labeling System | Invitrogen | 18187-013 | |
| EcoRI | Invitrogen | 15202-021 | |
| MboI | Invitrogen | 15248-016 | |
| dNTP Set, 100mM Solutions | GE Healthcare | 28-4065-51 | |
| Amersham Hybond - N+ -- Cat n. | GE Healthcare | RPN303B | |
| PlasmidPrep Mini Spin kit | GE Healthcare | 28-9042-70 | |
| NsiI | Sigma-Aldrich | R5884 1KU | |
| DNA, Sodium Salt Fish Sperm | AMRESCO | 0644-10G | |
| Mouse anti-chicken Bu-1b | SouthernBiotech | 8370-02 | |
| Mouse anti-chicken CD45 | SouthernBiotech | 8270-08 | |
| Mouse anti-chicken TCRγδ | SouthernBiotech | 8230-08 | |
| Mouse anti-chicken CD8α | SouthernBiotech | 9220-02 | |
| Mouse anti-chicken monocyte/macrophage | SouthernBiotech | 8420-02 | |
| MyCycle Termocycler | Bio-Rad | 580BR 5501 |
References
- Teixeira, A. R. Pathogenesis of chagas' disease: parasite persistence and autoimmunity. CMR. 24, 592-630 (2011).
- Teixeira, A. R. Chagas disease. Postg. Med. J. 82, 788-798 (2006).
- Teixeira, A. R. Trypanosoma cruzi in the chicken model: Chagas-like heart disease in the absence of parasitism. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1000 (2011).
- Hecht, M. M. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 5, e9181 (2010).
- Xing, Z. Roles of the ERK MAPK in the regulation of proinflammatory and apoptotic responses in chicken macrophages infected with H9N2 avian influenza virus. J. Gen. Virol. 91, 343-351 (2010).
- Kim, H. B. NIK and IKKbeta interdependence in NF-kappaB signalling--flux analysis of regulation through metabolites. Biosystems. 99, 140-149 (2010).
- Karakhanova, S. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets. Eur. J. Immunol. 40, 254-266 (2010).
- Finsterer, J. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
- Nitz, N. Heritable integration of kDNA minicircle sequences from Trypanosoma cruzi into the avian genome: insights into human Chagas disease. Cell. 118, 175-186 (2004).
- Simpson, L. Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates. Int. Rev. Cytol. 99, 1-19 (1986).
- Bonney, K. M. Heat-killed Trypanosoma cruzi induces acute cardiac damage and polyantigenic autoimmunity. PLoS One. 6, e14571 (2011).
- Moser, D. R. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27, 1477-1482 (1989).
- Sturm, N. R. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Mol. Biochem. Parasitol. 33, 205-214 (1989).
- Teixeira, A. R. Evolution and pathology in chagas disease--a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101, 463-491 (2006).
- Yurchenko, V. Y. Structure of Leishmania minicircle kinetoplast DNA classes. J. Clin. Microbiol. 37, 1656-1657 (1999).
- Simpson, L. The genomic organization of guide RNA genes in kinetoplastid protozoa: several conundrums and their solutions. Mol. Biochem. Parasitol. 86, 133-141 (1997).
- Thomas, S. A non-universal transcription factor? The Leishmania tarentolae TATA box-binding protein LtTBP associates with a subset of promoters. Int J. Parasitol. 36, 1217-1226 (2006).
