Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Parasite Induceret Genetisk Drevet Autoimmun Chagas hjertesygdom i Kylling Model

doi: 10.3791/3716 Published: July 29, 2012

Summary

Podning af

Abstract

De Trypanosoma cruzi akutte infektioner erhvervet i barndom og barndom synes asymptomatisk, men omkring en tredjedel af de kronisk inficerede tilfælde vise Chagas sygdom op til tre årtier eller senere. Autoimmunitet og parasit vedholdenhed er konkurrerende teorier til at forklare patogenesen af Chagas sygdom 1, 2. At adskille roller parasit persistens og autoimmunitet i Chagas sygdom vi pode T. cruzi i luftkammeret af befrugtede æg. Den modne kylling immunsystemet er en stram biologisk barriere mod T. cruzi og infektionen er udryddet ved udviklingen af immunsystemet ved udgangen af den første uge af væksten 3. Kyllingerne er parasit-fri ved skravering, men de bevarer integreret parasit mitokondrie kinetoplast DNA (kDNA) minicircle i deres genom, der er overført til deres afkom. Dokumentation af kDNA minicircle integration i kyllingen genomet blev opnået ved en Targeted prime Hale-PCR, Southern hybridiseringer, kloning og sekventering 3, 4. Den kDNA minicircle integrationer brud åbne læserammer for transkription og immunsystemet faktorer phosphatase (GTPase), adenylatcyclase og phosphorylaser (PKC, NF-kappa B aktivator, PI-3K) associeret med cellefysiologi, vækst og differentiering 3, 5 - 7, og andre genfunktioner. Svær myocarditis grund afstødning af brugerdata fibre ved effektorer cytotoksiske lymfocytter ses i kDNA muterede kyllinger, der viser en inflammatorisk kardiomyopati svarende til den, der ses hos mennesker Chagas sygdom. Især hjertesvigt og muskelsvaghed er til stede i voksne kyllinger med kDNA sprængning af dystrofin-genet i kromosomet en 8. Lignende genotipic ændringer er forbundet med vævsdestruktion udføres ved effektorer CD45 + og CD8γδ + og CD8a-lymfocytter. Således er denne protozo-infektion kan inducere genetisk drevne autoimmun sygdom.

Protocol

1. Vækst af parasitter

  1. Vokser trypomastigote former T. cruzi Berenice og β-galactosidase-udtrykkende Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 murin muskelcelle (L6) dyrket i Dulbecco minimalt essentielt medium med 10% FSB, 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 250 nM L-glutamin (pH 7,2), 5% CO2 ved 37 ° C. De fritsvømmende trypomastigotes i supernatanten medium blev anvendt til at inokulere hønseæg.
  2. Vokser Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 lager dyrket i DMEM med 20% FBS. LB promastigote form, i den eksponentielle vækstfase blev anvendt til at inokulere æg 9.

2. Parasite Podning i befrugtede hønseæg

  1. Inokulere en suspension af 100 T. cruzi trypomastigotes i 10 pi kulturmedium gennem en 2 mm diameter hul i æggeskallen oven af luftkammeret i trinX fertile æg. Invasionen og replikation af virulente parasitter i embryo-celler er vist i video S1. Kontrolgrupperne er som følger: a) kontrol kyllinger b) mock kontrol-æggene modtagende 10 pi kulturmedium c) Trin X fertile æg inokuleret med en suspension af 100 lb promastigoter i 10 pi kulturmedium T.. cruzi og Lb tilhører kinetoplastid familien. Henholdsvis disse protozoer vokse frit i cytoplasmaet eller i parasitophorous vakuolen af værtsceller 10.
  2. Forsegl hullerne med tape.
  3. Inkubér T. cruzi-inficerede æg og mock og uinficerede kontrolprøver ved 37,5 ° C og 65% fugtighed i 21 dage.
  4. Hold kyllinger, ruge i inkubatoren i 24 timer og derefter ved 32 ° C i tre uger.

3. Udtagning til DNA-ekstraktion

  1. Perifere blod-mononukleære celler blev opnået fra kyllinger: a)udklækket fra T. cruzi podede æg b) besidder c) spotter fik 10 pi kulturmedium d) udklækket fra LB podede æg, hvide blodlegemer fra kyllinger behandles for DNA ekstraktion ifølge med en standard protokol 11.
  2. Uddrag DNA også fra sæd opsamlet fra haner, og fra unfertile oocyter (<5 mm), der er indsamlet fra høns udklækket af æg podet med T. cruzi, og fra høns klækket af kontrol æg 3, 4.
  3. Uddrag kDNA fra T. cruzi epimastigote danner og også fra LB promastigoter, som beskrevet andetsteds 9.

4. Primere og prober Anvendte

De anvendte primere til PCR-amplifikationer og de ​​termiske forhold, er vist i tabel 1.

Proberne anvendt i Southern blot-hybridiseringer var:

  1. Vildtype-minicircle (~ 1,4 kb) sekvenser Puriceret fra T. cruzi epimastigote former;
  2. Minicircle fragmenter (362 bp) opnået ved NsiI fordøjelser af vildtype kDNA;
  3. Kerne-DNA (nDNA) repetitive sekvens (188 bp) opnået ved amplifikation af parasitten DNA med Tcz1 / 2 primere. Proberne blev oprenset fra 1% agarosegeler 3.
  4. Vildtype minicircle (~ 0,820 kb) sekvenser fra LB promastigoter.

5. PCR-analyser

  1. Kør standard PCR-procedure med genomiske DNA fra inficerede kyllinger og uinficerede kontroller og spotte med T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 og kDNA s35/s36 13 primere. Også drives PCR med genomiske DNA'er fra kyllinger udklækket fra LB inficerede-æg ved hjælp af protozoer specifikke Lb3 og Lb5 primere (tabel 1).
  2. Gøre reaktionsblandingen med 100 ng template DNA, 0,4 uM af hvert par af primere, 2 U Taq DNA-polymerase, 0,2 mM dNTP og 1,5 mM MgClz
  3. Sat thermocycler for 95 ° C i 5 minutter, 30 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C/30 sekunder ved 68 ° C / 1 minut ved 72 ° C med 5 min endelige forlængelse før køling.
  4. Analysere amplificeringsprodukterne i 1,3% agarosegel, som overføres til en positivt ladet nylonmembran (GE Life Sciences) ved den alkaliske metode til hybridisering med specifikke prober mærket med [α-32P] dATP under anvendelse Random Primer Labeling Kit (Invitrogen , Carlsbad, CA).

6. Genomiske Southern blots

  1. Anvendelse Mbo I og / eller med Eco RI (Invitrogen) enzymer, der gør det indre snit i minicircles integreret DNA prøver af kropsvæv.
  2. Digest DNA fra inficerede kontrol kyllinger og fra kyllinger udklækket af æg, podet med virulent T. cruzi dannes.
  3. Underkaster fordøjelser af DNA fra T. cruzi ogfra kylling testprøver for elektroforese i 0,8% agarose-gel ved 50 V natten over ved 4 ° C.
  4. Overføre adskilte DNA bånd med positivt ladet nylonmembran.
  5. Hybridiserer de DNA-bånd med radioaktivt mærket kDNA probe.
  6. Vaskes membranen to gange i 15 minutter ved 65 ° C med 2X SSC og 0,1% SDS, to gange i 15 minutter ved 65 ° C hver med 0,2 x SSC og 0,1% SDS, og autoradiografi for variable perioder.

7. Målrettet Prime Hale-PCR

  1. Opnå amplifikation af kDNA minicircle integreret i kylling genomet ved en modificeret Hale-PCR-teknik, der kombinerer kDNA primere med specifikke primersæt 2 i tre walk-i cyklusser nestet PCR, som vist i figur 1.
  2. Primær cyklus: Hver reaktion indbefatter 200 ng template DNA, 2,5 mM MgCI2 og 0,4 uM kDNA primere (S34 eller S67), 0,2 mM dNTP'er, 2,5 U Taq platin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Anvende kDNA primere i kombination med 0,04 uM Gg primere (GG1 til Gg6, tabel 1) separat. Indstilles temperaturer fra 57,9 til 60,1 ° C for kDNA primere og 59,9-65,6 ° C for CR-1 primer. Bemærk, at disse temperaturer er højere end (~ 45 ° C), der kræves for vilkårlige degenererede primere anvendt i Tail-PCR 10. Anvendelse temperatur og cyklerne MyCycle Thermocycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) som beskrevet i et tidligere dokument 3.
  3. Sekundære trin: Fortynd PCR-produkterne fra den primære kredsløb 1:40 (v / v) i vand. kDNA primere S35 og S35 antisense erstattet de tidligere, sammen med de samme Gg primere.
  4. Tertiær cyklus: Fortynd PCR-produkter fra sekundære kredsløb 1:10 (v / v) i vand og kombineres Gg primere med S67 antisense-eller S36, separat.
  5. Klone PCR tertiære cyklus produkter: Klon direkte i pGEM T nem vektor (Promega, Madison, WI)produkter i sidste forstærkning der hybridisere med kDNA sonde.
  6. Vælges kloner ved hybridisering med kDNA probe og sekvens.
  7. Validere tpTAIL-PCR i en blanding af 300 pg af kDNA fra T. cruzi med 200 ng DNA fra kontrol fugle aldrig udsættes for kDNA. De temperatur-og amplifikationscykluser er de samme anvendt til testen fuglenes DNA.

8. Chagas sygdom Clinic Manifestation

  1. Overvåg vækst og udvikling af kyllinger udklækket fra T. cruzi inficerede æg og raske kontrolpersoner udklækket fra ikke-inficerede æg dagligt for dødelighed og ugentlige for sygdomsmanifestationer.
  2. Find kliniske abnormiteter i disse kyllinger (figur 2) og gøre elektrografiske (EKG) optagelser til at evaluere de elektriske akser, hjerte priser og arytmi 3.
  3. Emne kDNA-muteret og styrer kyllinger hver måned til EKG-optagelser af augmented ventrikulær unipolar fører aVF (venstre ben), AVL (venstre arm), og AVR (højre arm), og at vurdere afvigelse af den gennemsnitlige elektriske akse til venstre, der er tyder på hjertet udvidelsen 3.

9. Patologi og Immunokemisk Analyser

  1. Optag hjerte og kropsvægt indekserer efter naturlige død kDNA muterede kyllinger (Figur 3). Få indekser også for kontrol kyllinger på samme alder og køn.
  2. Tage sektioner fra hjertet, spiserøret, tarme, skeletmuskel, lunger, lever og nyrer.
  3. Rette væv i bufret 10% formalin (pH 7,4), integrere i paraffin og skæres til 4 um tykke snit for hæmatoxylin-eosin (HE)-farvning og histologiske analyser (fig. 3).
  4. Høst og gennemskære væv fra embryoner udklækket af æg, podet med parasitter, der udtrykker β-galactosidase, og med forbehold for at X-Gal-pletten. 9
  5. Fastgør den anden halvdel af embryoet væv i 10% formalin, pH 7,4 og fortsæt som i trin 9,3.
  6. Skåret 4μm tynd paraffinindlejret vævssnittet og montere på objektglas til mikroskopisk undersøgelse.
  7. Inkuber sektioner viser X-Gal-farves blå celler med human chagasic antiserum (1:1024 fortynding) mod anti-T cruzi-antigen.
  8. Vask sektioner trice med PBS, pH 7,4, 5 minutter hver.
  9. Farvning blå celler i embryoet væv ved anden inkubation med et fluorescein-konjugeret kanin-anti-humant IgG.
  10. Vask sektioner med PBS (trin 8), mount med dækglasset og observere de blå celler lys-up grønne efter en undersøgelse under UV-lys ved 502 nm bølgelængde, 200x forstørrelse, for colocalizing T. cruzi i fosterceller.

10. Fænotype immunsystemets celler i hjertelidelser

  1. Fænotype immuneffektorer celler i vævssnit af hjertet fra kDNA-positive og fra kontrol kDNA-negative kyllinger.
  2. Anbring objektglassene medvævssnittet indlejret i paraffin ved 65 ° C i 30 minutter for at smelte voksen forud for indgivelse i fire vaske i 100% til 70% xylen og derefter med absolut ethanol PBS i 5 minutter hver.
  3. Glassene skylles med destilleret vand, lufttørres og behandles med specifikke monoklonale antistoffer (fluorescein-eller R-phycoerythrin-konjugerede monoklonale antistoffer) opnået fra SouthernBiotech, Birmingham, AL.
    1. Anvende muse-anti-kylling Bu-1 (Bu-1 a og Bu-1 B-alleler, Mr 70-75 kDa) Mab AV20 at genkende monomorf determinant på B-celle-antigener af indavlede kyllinger.
    2. Anvende muse-anti-kylling CD45, Ig-isotype IgM1 κ specifikke kylling thymus afstamningsceller (Mr 190-215 kDa variant).
    3. Anvende muse-anti-kylling TCRγδ + (Mr 90 kDa heterodimer) Mab specifikt thymus afhængige CD8a + T-celler.
    4. Brug musen til anti-kylling Mab CD-8 specifikt til kylling α-kæden (Mr 34 kDa) anerkender the CD8 celler i thymocytter, milt, hjerte, og andre væv.
    5. Anvende muse-anti-kylling KuL01 til udelukkende genkende monocytter / makrofager i fagocytten systemet.
  4. Vaskes objektglasset tre gange med 0,1 M PBS, pH 7,4, 5 minutter hver efter inkubering med specifikt anti-fænotype antistof i 90 minutter i et fugtigt kammer.
  5. Samle objektglasset med pufret glycerin til prøven under fluorescerende lys-mikroskop med emissionsfilter med bølgelængde 567 og 502 nm, for at detektere røde og grønne fluorescens-mærkede celler (figur 4).

11. Data Analyser

  1. Anvende kylling genomet database ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) for BLASTN sekvensanalyser.
  2. Anvende ClustalW alignments til at bestemme e-værdi scorer.
  3. Anvender den GIRI repeat maskering algoritme Censurede ( http://girinst.org/censor/index.php ) til lokalisering af de forskellige klasser af gentagelser i kimære sekvenser.
  4. Ansæt den Kinetoplastid Indsættelse og sletning Sequence Search Tool (KISS) til at identificere potentielle gRNAs i kDNA sekvenser, ved hjælp af WU-blastn-modificeret matrix 3.
  5. Brug T. cruzi sekvenser http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-~~HEAD=NNS 2164-8-133-s1.fas at søge ind gRNAs i kDNA-værts DNA-kimærer. 11,6) Brug Students t og Kolmorov-Smirnov test, henholdsvis, for at opdage signifikante forskelle mellem afvigelser af elektriske akser og mellem hjerte / kropsvægt indekserer opnået i de eksperimentelle og kontrol grupper, og at opdage dødelighed forholdet signifikante forskelle mellem grupper af udklækkede kyllinger fra T. cruzi inoculated æg og fra kontrol.

12. Repræsentative resultater

Podning af 100 virulent T. cruzi trypomastigotes i luften kammer i frugtbare hønseæg er ikke væsentligt nedsætte forhold for kyllinger udklækket i live. Ca. 60% udklække sunde kyllinger og 40% kan undergå embryo fortætning eller embryo død udklækning. De overlevende kyllinger bevarer kDNA minicircle sekvens integreres i genomet. Dog forventes det, at nogle kyllinger vil dø med kardiomegali og fiasko i ugerne efter klækning. De resterende kyllinger vil vokse til udad raske voksne. På alle stadier af livet i DNA ekstraheret fra deres blod mononukleære celler vil give PCR-amplifikation af kDNA, men ikke nDNA. Den målrettede-prime Hale-PCR 3, 4 produkter, klones og sekvensen viser det kDNA minicircles fortrinsvis indarbejdes i kodende regioner af macrochromosomes 1 til 5. Kyllingerne viser flere kDNA integrations til gener kodende for cellevækst og-differentiering, immunsystemet regulering faktorer, og DNA-reparation er kandidater til undergår afstødning af selvstændige målvæv (figur 3). For eksempel er kyllingen viser kDNA mutation med sprængning af dystrofin-genet (fig. 5), der koder for et protein, som binder cytoskelettet til cellemembranen, en kandidat til at udvikle autoimmun inflammatorisk kardiomyopati og svigt.

Disse genomiske ændringer er ikke set i kyllinger udklækket af Lb inficerede æg. Der er forskelle mellem T. cruzi og Lb kDNA minicircles; T. cruzi k DNA minicircle gennemsnit 1,4 kb struktur med fire variable region (VR) afbrudt af konserverede regioner (CR), der hver udgør CSB1 og CSB2 og CSB3 regioner, hvor CA-rige bøjet DNA anses specifikke sites for initiering af replikation, transkription, rekombination, og lateral DNA-overførsel LB kDNA minicircle (gennemsnitlig størrelse 820 bp) indeholder en enkelt CR efterfulgt af VR. CR har bevaret CSB1 (GGGCGT) og CSB2 (CCCCGTTC) blokke, som er forskellige fra dem i T. cruzi minicircles 15, 16 og 17. Fandt, at Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) viser 12 nts homologi med T. cruzi det er tænkeligt, at enten Lb kDNA minicircle integrerer i en meget lav frekvens, som ikke kan være synlige ved de anvendte teknikker, eller den kan eventuelt ikke integrere i kyllingen genomet overhovedet.

Primer Mål-DNA Sequence Tm *
S 34 T. cruzi kDNA 5 'ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3' 57,9
S 67 T.cruzi kDNA 5'GGT TTT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3 ' 60,1
S 35 T. cruzi kDNA 5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3' 59,4
S 36 T. cruzi kDNA 5 'GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3' 57,9
Lb3 Lb kDNA 5 'GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3' 55,9
Lb5 Lb kDNA 5 'CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3' 61,4
Gg 1 Gallus gallus 5 'AGC TGA TCC TAA AGG CAG AGC 3' 60,1
Gg2 G. gallus 5 'CTG AGC CTC TGCTTT GAA En 3 ' 56,8
Gg3 G. gallus 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3' 60,1
Gg4 G. gallus 3 'GCT CTG FTT TTA GGA TCA GCT 5' 64,2
Gg5 G. gallus 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' 62,3
Gg6 G. gallus 3 'CTG TTA GCA TGA GGC TTC ACA A 5' 60,4

Tabel 1. Primes anvendt i PCR-amplificeringer. * Tm = gennemsnitlig annealingstemperatur ° C.

Figur 1
Figur 1. TP Hale-PCR-strategi, der anvendes til at detektere Trypanosoma cruzi kDNA integration i Gallus gallus-genomet. A) En kimær sekvens med et fragment af kDNA minicircle konserverede (mørkeblå) og variable (lyseblå) regioner integreret i locuset NW_001471687.1 ved kromosom 4 (AY237306) af kylling 10 genomet (grøn) blev anvendt til opnåelse af værten specifikke primersæt (GG1 til Gg6). B) TP Hale-PCR-amplifikationer blev indledt (primær cyklus) ved annealing af minicircle-specifikke S34 eller S67 primere i kombination med kylling-specifikke GG1 til Gg6 primere. Udvandet produkter, forudsat skabelon for den sekundære cyklus med S35 (sense / antisense) primere, og kombinationerne af Gg primere. I den tertiære cyklus en fortynding af sekundære produkter blev underkastet amplifikation med kDNA S36 eller S67 antisense-primere i kombination med Gg primersek. C) Disse amplifikationsprodukterne blev separeret i 1% agarosegeler og overført til nylonmembran, hybridiseret med specifikke kDNA probe. Prøverne viste positivt signal, blev anvendt til kloning til at bestemme det punkt integration. De kombinationer af kDNA og målrettede GG1 til Gg6 er vist på toppen af gelen. De sekventielle PCR-reaktionerne amplificerede mål kDNA-værts DNA-sekvenser med kDNA minicircles (blå) og aviær sekvensen (grøn). (Gengivet fra PLoS Neglected Tropical Diseases 3).

Figur 2
Figur 2. Kliniske manifestationer af nedsat hjertefunktion i en 9 måneder gammel kylling genetisk modificeret ved integration af det mitochondriske kDNA minicircle fra T. cruzi. Den dårlige blodets iltning af mitokondrie kDNA muterede kylling viser en lilla kam i kontrast til den lyse røde kam af kontrol 9-måneder gamle chicken fri for skader på hjertet. (Modificeret fra PLoS Neglected Tropical Diseases 3).

Figur 3
Figur 3. Gross og mikroskopisk patologi i Gallus gallus med kDNA mutationer. A) kardiomegali i en 9-måneder gammel høne, der døde af hjertesvigt. B) Kontrol hjerte fra en ikke-inficeret 9-måneder-gammel høne. C) Afvisning af target hjerteceller af cytotoksiske lymfocytter: En minimal afstødning enhed med lyserer af målcellerne ved immunlymfocytter er afbildet (cirkel). D) kontrol hjertet histologi (Modificeret fra PLoS Neglected Tropical Diseases 3).

Figur 4
Figur 4. Immunocytokemiske undersøgelser af immunsystemceller infiltrerer hjertet af kDNA-muterede kylling vist i figur 3. A) CD45 + lymfocytter identificeret (pile) i hjertet leninger ved en phycoerythrin-mærket specifikt monoklonalt antistof. B) CD8 + γδ immunlymfocytter (pile), der er involveret i alvorlig ødelæggelse af hjertet. C) Rigelige CD8a + T-celler til stede i alvorlige læsioner med hjerte celle lyserer. Indsatsene viser fravær af immunsystemceller til kontrol uinficerede kylling hjertet (modificeret fra PLoS Neglected tropesygdomme 3).

Figur 5
Figur 5. Chagas-lignende dilateret kardiomyopati inflammatorisk i F2 afkom med kDNA integration i dystrophin-genet. A) dilateret hjerte i en 10 måneder gammel kylling optager det meste af brysthulen (hjertevægten = 16 g). B) Mørke runde mononukleære celler infiltrerer og ødelægger myokardiet af kDNA-muterede høne. C) Normal hjertet størrelse (vægt 7 g) af en 10-måneder gamle kontrol kylling. D) Normal histologi af en kontrol kylling hjerte. (Modificeret fra PLoS forsømte Tropical Sygdomme 3).

Figur 6
Figur 6. Sammenligningseksempel patologi kDNA-muteret kylling og i human Chagas sygdom. A) Alvorlig myocarditis og brugerdata celle lyserer i kDNA-muterede kylling. B) Svær myocarditis og målcelleværdier lyserer ved immunlymfocytter i et tilfælde af Chagas hjertesygdomme. C) Afvisning af hjerteceller af immune lymfocytter i kDNA-muterede kylling. D) Afvisning af hjerteceller af immune lymfocytter i humant Chagas sygdom. Farvet med hematoxilin og eosin. (Modificeret fra Memórias gøre Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 14).

Discussion

I modsætning til pattedyr er modtagelige for livslang T. cruzi infektioner, kyllinger er refraktære over for T. cruzi infektion. Den største fordel ved kylling modelsystem er elimineringen af ​​infektionen tidligt i udviklingen af ​​den embryoniske immunsystemet. Således er den eneste parasitten DNA forbliver i kyllingen legemet integreret i flere loci.

Anvendelse af den optimale mængde af virulent T. cruzi trypomastigotes at pode fertile æg er det kritiske trin til opnåelse integration af kDNA minicircles i kyllingefoster-genomet. Hastigheden af ​​levende kyllinger udrugning af æg inokuleret med 100 trypomastigotes er fire gange højere end den, der opnås med 500 parasitter. Skal sørges at inokulere parasitter suspensionen i 10 pi kulturmedium i ægget luftkammeret. Der bør ikke være nogen lækage af æggehvide. Under optimale betingelser tager det intracellulære parasitiske infektion sted witynd et par timer efter inkubation og parasit multiplikation inde i værtsceller provenuet i en uge, derefter infektionen er elimineret ved den medfødte immunitet. Den kDNA integration kræver et levende infektion, og podning af nøgne minicircles i tidlige embryoner hønseæg ikke resulterer i integration. De kDNA-positive embryoner og kontroller bør anbringes under kontrollerede betingelser ved 37,5 ° C og 65% fugtighed. Kyllingerne bliver holdt i bure i to uger ved 33 ° C stuetemperatur. Derefter kyllingerne holdes i bure på ophængte stativer adskilt af 1,5 meter bredde gangene i et rum ved 22 ° C med filtreret luft og positivt tryk under konstant udmattelse til at sikre dyrevelfærd. De voksne fodres kylling-Chow og drikke drikkevand rindende vand for at opnå fuld vækst og modenhed, om æg på fem måneders alderen. Vedligeholdelse af hygiejniske procedurer er afgørende for reproducerbarhed af resultaterne, når der arbejdes med T. cruzi podedei frugtbare hønseæg.

I kyllingen modelsystem for T. cruzi infektioner er udryddet efter udviklingen af immunsystemet i den tidlige periode af embryo vækst. Desuden at være infektion uden de kyllinger, der klækkes fra T. cruzi inokulerede æg, i mangel af specifikke antistoffer, er tolerante over for de parasitantigener. Afvisningen af de udvalgte hjerteceller ved cytotoksiske lymfocytter (minimal afvisning enhed, figur 3) ses i kDNA-muterede kyllinger viser genotype ændringer og fordelingen af immunologisk overvågning 3. De genotypisk modificerede T-celler til stede accelereret afstødning af selv væv i kroppen. Den primære læsion site er hjertet, hvilket er kendetegnende for Chagas sygdom. Overgangen fra en fysiologisk (overvågning) til en physiopathologic tilstand ses i kDNA-muterede kylling viser klonalt spredning af cytotoksiske lymfocytter 3.

Thans transkingdom modelsystem viser en parasit-induceret, genetisk drevet autoimmun sygdom (Figur 6), som stammer fra genomet modifikationer af T. cruzi kDNA minicircle integrationer. Disse ændringer er ikke set i kyllinger udklækket af Lb-podede æg.

Dette fænomen viser, at eksperimentel behandling af inflammatoriske autoimmune kardiomyopati i kDNA-muterede kyllinger kan kræve lægemiddel undertrykkelse af knoglemarv stamfader specifik T-celle fænotype infiltrerer myocardium, og transplantation af histokompatibelt sunde knoglemarv for at undgå afstødning af selv-væv.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi står i gæld til Nancy R. Sturm, Department of Immunology, Mikrobiologi og Molekylær Biologi, David Geffen School of Medicine, University of California i Los Angeles, for kritisk gennemlæsning af manuskriptet. Det Nationale Råd for forskning-CNPq, og Fonden for Forskning Udvikling-FAPDF, Brasilien, støttet undersøgelsen. Vi takker teknisk hjælp af Alessandro O. Souza, Maria C. Guimaro, Ciro Cordeiro, Ana de Cassia Rosa, Roseneide Alves, og Rafael Andrade, fra University of Brasilia, Brasilien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Platinum Taq DNA Polymerase Invitrogen 10966-030
Random Primers DNA Labeling System Invitrogen 18187-013
EcoRI Invitrogen 15202-021
MboI Invitrogen 15248-016
dNTP Set, 100mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Amersham Hybond - N+ -- Cat n. GE Healthcare RPN303B
PlasmidPrep Mini Spin kit GE Healthcare 28-9042-70
NsiI Sigma-Aldrich R5884 1KU
DNA, Sodium Salt Fish Sperm AMRESCO 0644-10G
Mouse anti-chicken Bu-1b SouthernBiotech 8370-02
Mouse anti-chicken CD45 SouthernBiotech 8270-08
Mouse anti-chicken TCRγδ SouthernBiotech 8230-08
Mouse anti-chicken CD8α SouthernBiotech 9220-02
Mouse anti-chicken monocyte/macrophage SouthernBiotech 8420-02
MyCycle Termocycler Bio-Rad 580BR 5501

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teixeira, A. R. Pathogenesis of chagas' disease: parasite persistence and autoimmunity. CMR. 24, 592-630 (2011).
  2. Teixeira, A. R. Chagas disease. Postg. Med. J. 82, 788-798 (2006).
  3. Teixeira, A. R. Trypanosoma cruzi in the chicken model: Chagas-like heart disease in the absence of parasitism. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1000 (2011).
  4. Hecht, M. M. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 5, e9181 (2010).
  5. Xing, Z. Roles of the ERK MAPK in the regulation of proinflammatory and apoptotic responses in chicken macrophages infected with H9N2 avian influenza virus. J. Gen. Virol. 91, 343-351 (2010).
  6. Kim, H. B. NIK and IKKbeta interdependence in NF-kappaB signalling--flux analysis of regulation through metabolites. Biosystems. 99, 140-149 (2010).
  7. Karakhanova, S. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets. Eur. J. Immunol. 40, 254-266 (2010).
  8. Finsterer, J. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
  9. Nitz, N. Heritable integration of kDNA minicircle sequences from Trypanosoma cruzi into the avian genome: insights into human Chagas disease. Cell. 118, 175-186 (2004).
  10. Simpson, L. Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates. Int. Rev. Cytol. 99, 1-19 (1986).
  11. Bonney, K. M. Heat-killed Trypanosoma cruzi induces acute cardiac damage and polyantigenic autoimmunity. PLoS One. 6, e14571 (2011).
  12. Moser, D. R. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27, 1477-1482 (1989).
  13. Sturm, N. R. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Mol. Biochem. Parasitol. 33, 205-214 (1989).
  14. Teixeira, A. R. Evolution and pathology in chagas disease--a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101, 463-491 (2006).
  15. Yurchenko, V. Y. Structure of Leishmania minicircle kinetoplast DNA classes. J. Clin. Microbiol. 37, 1656-1657 (1999).
  16. Simpson, L. The genomic organization of guide RNA genes in kinetoplastid protozoa: several conundrums and their solutions. Mol. Biochem. Parasitol. 86, 133-141 (1997).
  17. Thomas, S. A non-universal transcription factor? The Leishmania tarentolae TATA box-binding protein LtTBP associates with a subset of promoters. Int J. Parasitol. 36, 1217-1226 (2006).
Parasite Induceret Genetisk Drevet Autoimmun Chagas hjertesygdom i Kylling Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hecht, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. J. Vis. Exp. (65), e3716, doi:10.3791/3716 (2012).More

Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hecht, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. J. Vis. Exp. (65), e3716, doi:10.3791/3716 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter