Summary
का टीका
Abstract
ट्रायपैनोसोमा cruzi तीव्र शैशव और बचपन में अधिग्रहण संक्रमण स्पर्शोन्मुख लगते हैं, लेकिन लंबे समय से संक्रमित मामलों की लगभग एक तिहाई Chagas रोग दिखाने के तीन दशकों या बाद में. Autoimmunity और परजीवी हठ सिद्धांतों के रोगजनन Chagas रोग 1, 2 की व्याख्या करने के लिए प्रतिस्पर्धा कर रहे हैं. अलग Chagas रोग में परजीवी दृढ़ता और autoimmunity द्वारा निभाई गई भूमिकाओं के लिए हम टी. टीका लगाना निषेचित अंडे की हवा कक्ष में cruzi. परिपक्व चिकन प्रतिरक्षा प्रणाली टी. के खिलाफ एक तंग जैविक बाधा cruzi संक्रमण और अपनी प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास पर 3 विकास के पहले सप्ताह के अंत तक खत्म. लड़कियों अंडे सेने में परजीवी से मुक्त कर रहे हैं, लेकिन वे एकीकृत बनाए रखने परजीवी है mitochondrial kinetoplast डीएनए (kDNA) के उनके जीनोम है कि उनकी संतान को हस्तांतरित कर रहे हैं के भीतर minicircle. चिकन जीनोम में kDNA minicircle एकीकरण की प्रलेखन targ द्वारा प्राप्त किया गया थाeted प्रधानमंत्री पूंछ-पीसीआर, दक्षिणी hybridizations के, क्लोनिंग, और अनुक्रमण 3, 4. kDNA एकीकरण minicircle टूटना प्रतिलेखन और प्रतिरक्षा प्रणाली कारकों के लिए खुला पढ़ने फ्रेम, फॉस्फेट (GTPase), adenylate साइक्लेज और phosphorylases के (PKC, NF-रूई बी उत्प्रेरक, PI-3K) सेल फिजियोलॉजी, विकास, और भेदभाव 3, 5 के साथ जुड़े 7, और अन्य जीन कार्यों. गंभीर लक्ष्य दिल फाइबर की effectors साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा अस्वीकृति के लिए कारण मायोकार्डिटिस kDNA उत्परिवर्तित मुर्गियों में देखा जाता है, एक सूजन मानव Chagas रोग में देखा है कि इसी तरह कार्डियोमायोपैथी दिखा. विशेष रूप से, दिल की विफलता और कंकाल मांसपेशियों में कमजोरी वयस्क मुर्गियों में 1 गुणसूत्र 8 में dystrophin जीन के kDNA टूटना साथ मौजूद हैं. इसी तरह के genotipic परिवर्तन हैं ऊतक effectors CD45 +, CD8γδ + लिम्फोसाइटों CD8α द्वारा किए गए विनाश के साथ जुड़े रहे हैं. इस प्रकार इस प्रोटोजोआ संक्रमण के आनुवंशिक रूप से संचालित autoimmune रोग पैदा कर सकते हैं.
Protocol
1. परजीवी का विकास
- टी. trypomastigote रूपों बढ़ता है cruzi Berenice और β-galactosidase व्यक्त Tulahuen टी. MHOM/CH/00 cruzi murine मांसपेशी कोशिका में C4 (L6) 10% FSB, 100 IU / मिलीलीटर पेनिसिलिन, में स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 / μg मिलीलीटर और 250 एनएम एल glutamin (7.2 पीएच) के साथ Dulbecco न्यूनतम आवश्यक मध्यम में खेती, 5% 37 में सीओ 2 डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला मध्यम में नि: शुल्क तैराकी trypomastigotes चिकन अंडे टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
- लीशमैनिया (पौंड) LTB300 20% FBS साथ DMEM में बड़े हो स्टॉक braziliensis आगे बढ़ें. घातीय वृद्धि चरण में पौंड promastigote के फार्म का अंडे 9 टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
2. निषेचित चिकन अंडे में परजीवी इनोकुलेशन
- 100 टी. के निलंबन टीका लगाना cruzi 2 मिमी व्यास छेद के माध्यम से संस्कृति के माध्यम के 10 μl में मंच की हवा कक्ष के शीर्ष पर अंडे के खोल में trypomastigotesएक्स उपजाऊ अंडे. और भ्रूण कोशिकाओं में ज़हरीले परजीवी के आक्रमण प्रतिकृति S1 के वीडियो में दिखाया जाता है. नियंत्रण समूह के रूप में निम्नानुसार है:) नियंत्रण मुर्गियों, ख) नकली नियंत्रण अंडे संस्कृति माध्यम के 10 μl प्राप्त की, ग) स्टेज एक्स उपजाऊ संस्कृति माध्यम के 10 μl में 100 पौंड promastigotes के निलंबन के साथ inoculated अंडे टी.. cruzi और पौंड kinetoplastid परिवार के हैं. क्रमशः, इन protozoans के cytoplasm में या 10 मेजबान कोशिकाओं की parasitophorous रिक्तिका में मुक्त हो जाना.
- चिपकने वाला टेप के साथ छेद सील.
- टी. सेते हैं cruzi संक्रमित अंडे और नकली और uninfected नियंत्रण नमूने 37.5 डिग्री सेल्सियस और 65% आर्द्रता 21 दिनों के लिए.
- 32 ° C पर तीन सप्ताह के लिए लड़कियों कि 24 घंटे के लिए और उसके बाद इनक्यूबेटर में पक्षियों के बच्चे रखें.
3. डीएनए निष्कर्षण के लिए प्राप्त करने के नमूने
- परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं मुर्गियों से प्राप्त किया गया:)टी. से रची cruzi टीका अंडे, ख) नियंत्रण, ग) संस्कृति माध्यम के 10 μl प्राप्त mocks, घ) पौंड टीका अंडे से रची, मुर्गियों से सफेद रक्त कोशिकाओं के डीएनए निष्कर्षण के लिए अनुसार एक मानक प्रोटोकॉल के साथ 11 संसाधित कर रहे हैं.
- डीएनए roosters से, और unfertile (<5 मिमी) टी. साथ inoculated अंडे से रची मुर्गियाँ से एकत्र oocytes से एकत्र वीर्य से भी निकालें cruzi, और नियंत्रण 3 अंडे, 4 से रची मुर्गियाँ से.
- टी. से kDNA निकालें cruzi epimastigote रूपों और भी, पौंड promastigotes से, के रूप में 9 कहीं वर्णित है.
4. खेतों में प्रयुक्त किए गए प्राइमर्स और जांच
पीसीआर amplifications और थर्मल शर्तों के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों तालिका 1 में दिखाया जाता है.
जांच थे दक्षिणी धब्बा hybridizations में इस्तेमाल किया:
- जंगली प्रकार minicircle (~ 1.4 केबी) पुरी दृश्योंटी. से स्तर पर fied cruzi epimastigote रूपों;
- (362 बीपी) टुकड़े NSI से प्राप्त मैं जंगली प्रकार kDNA के हज़म Minicircle;
- परमाणु (nDNA) दोहराव अनुक्रम डीएनए (188 बीपी) Tcz1 / 2 प्राइमरों के साथ परजीवी डीएनए का प्रवर्धन द्वारा प्राप्त की. जांच 1% agarose 3 जैल से शुद्ध किया गया.
- पौंड promastigotes से जंगली प्रकार minicircle दृश्यों (~ 0.820 केबी).
5. पीसीआर विश्लेषण
- संक्रमित लड़कियों और uninfected नियंत्रण से जीनोमिक DNAs के साथ मानक पीसीआर प्रक्रिया चलाने के लिए और टी. का उपयोग नकली cruzi Tcz1 / 2 nDNA 12 और kDNA s35/s36 13 प्राइमरों. इसके अलावा, मुर्गियों से जीनोमिक DNAs पौंड प्रोटोजोआ में विशिष्ट Lb3 और Lb5 प्राइमरों (तालिका 1) का उपयोग संक्रमित अंडे से रची साथ पीसीआर चला.
- 100 एनजी टेम्पलेट डीएनए, प्राइमरों, 2 यू Taq डीएनए पोलीमरेज़, 0.2 मिमी dNTP, प्रत्येक जोड़ी के 0.4 माइक्रोन और 1.5 मिमी MgCl के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण
- 5 मिनट, 30 सेकंड 30 चक्रों में 95 ° C/30 सेकंड के लिए 68 ° C / 72 पर 1 मिनट डिग्री सेल्सियस प्रशीतन से पहले 5 मिनट अंतिम विस्तार के साथ 95 thermocycler के लिए कार्यक्रम डिग्री सेल्सियस सेट.
- प्रवर्धन में 1.3% agarose जेल है, जो विशिष्ट जांच के साथ लेबल के साथ संकरण के लिए alkaline विधि द्वारा एक सकारात्मक चार्ज नायलॉन झिल्ली (जीई लाइफ साइंसेज) के लिए स्थानांतरित कर रहा है उत्पादों का विश्लेषण [α-32 पी] रैंडम प्राइमर लेबल किट (Invitrogen का उपयोग dATP , Carlsbad, CA).
6. जीनोमिक दक्षिणी blots
- MBO मैं / और या पारिस्थितिकी आरआई के साथ (Invitrogen) एंजाइमों कि शरीर के ऊतकों के डीएनए के नमूने में एकीकृत minicircles में एक कटौती करने का उपयोग करें.
- असंक्रमित नियंत्रण मुर्गियों से और मुर्गियों से डाइजेस्ट डीएनए विषमय टी. साथ inoculated अंडे से रची cruzi रूपों.
- विषय टी. से डीएनए का हज़म cruzi औरचिकन परीक्षण के नमूने से 4 डिग्री सेल्सियस में 0.8% agarose जेल में 50 वी रातोंरात वैद्युतकणसंचलन
- सकारात्मक आरोप लगाया नायलॉन झिल्ली के लिए स्थानांतरण अलग डीएनए बैंड.
- डीएनए बैंड रेडियो में लेबल kDNA जांच के साथ संकरण करना.
- झिल्ली दो बार 15 मिनट के लिए 65 को धो ° 2X एसएससी और 0.1% एसडीएस के साथ सी, दो बार 65 में 15 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 0.2X एसएससी और 0.1% एसडीएस, और अलग अलग समय अवधि के लिए autoradiograph साथ प्रत्येक.
7. प्रधानमंत्री पूंछ - पीसीआर लक्षित
- प्राप्त kDNA का प्रवर्धन minicircle एक संशोधित तकनीक पूंछ - पीसीआर, जो में विशिष्ट प्राइमर के साथ kDNA प्राइमरों को जोड़ती है में 2 सेट के द्वारा चिकन जीनोम में एकीकृत तीन चलने में पीसीआर नेस्टेड चक्र, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है.
- प्राथमिक चक्र प्रत्येक प्रतिक्रिया में 200 एनजी टेम्पलेट डीएनए, 2.5 मिमी 2 MgCl, और kDNA प्राइमरों (S34 या S67) के 0.4 माइक्रोन, 0.2 मिमी dNTPs, 2.5 यू Taq प्लेटिनम (Invitrogen, Carlsbad, सी में शामिलएक). Gg प्राइमरों (Gg1 Gg6, तालिका 1) का 0.04 माइक्रोन के साथ संयोजन में kDNA प्राइमरों अलग का उपयोग करें. तापमान 57.9 से 60.1 के लिए सेट ° सी kDNA और प्राइमरों के लिए 59.9 से 65.6 डिग्री सेल्सियस CR-1 प्राइमर के लिए. ध्यान दें कि इन तापमान उन से अधिक है (~ 45 ° सी) पूंछ-पीसीआर 10 में मनमाने ढंग से विकृत इस्तेमाल किया प्राइमरों के लिए आवश्यक है. तापमान और चक्र (MyCycle Thermocycler, जैव रेड प्रयोगशालाओं, पहलवान, सीए) पिछले 3 समाचार पत्र में वर्णित का उपयोग करें.
- माध्यमिक चक्र: पानी में प्राथमिक चक्र 01:40 (v / v) से पीसीआर उत्पादों पतला. kDNA प्राइमरों S35 और S35 antisense पिछले वाले एक ही gg प्राइमरों के साथ बदल दिया.
- तृतीयक चक्र: पानी में माध्यमिक चक्र 01:10 (v / v) से पीसीआर उत्पादों पतला और gg प्राइमरों antisense S67 या S36 के साथ गठबंधन के लिए, अलग.
- सीधे pGEM टी आसान सदिश (Promega, मैडिसन, WI) में क्लोन: पीसीआर तृतीयक चक्र उत्पादों का क्लोनपिछले प्रवर्धन के उत्पादों कि kDNA जांच के साथ संकरण.
- KDNA जांच और अनुक्रम के साथ संकरण द्वारा क्लोनों का चयन करें.
- टी. से 300 kDNA की स्नातकोत्तर के मिश्रण में tpTAIL-पीसीआर मान्य kDNA नियंत्रण पक्षियों से 200 एनजी डीएनए के साथ cruzi कभी नहीं उजागर. तापमान और प्रवर्धन चक्र परीक्षण पक्षियों के डीएनए के लिए इस्तेमाल किया वही कर रहे हैं.
8. Chagas रोग क्लिनिक अभिव्यक्ति
- टी. से रची मुर्गियों के विकास और विकास की निगरानी cruzi अंडे संक्रमित और गैर संक्रमित अंडे से स्वस्थ नियंत्रण की मृत्यु और रोग के अभिव्यक्तियों के लिए साप्ताहिक के लिए दैनिक रची.
- उन मुर्गियों (चित्रा 2) में नैदानिक असामान्यताएं का पता लगाने और electrocardiograph रिकॉर्डिंग (ईसीजी) को बिजली के अक्ष, दिल की दर और 3 अतालता का मूल्यांकन करने के लिए.
- विषय kDNA-उत्परिवर्तित और संवर्धित निलय संयुक्त राष्ट्र की ईसीजी रिकॉर्डिंग करने के लिए मासिक मुर्गियों नियंत्रणipolar aVF (बाएं पैर), AVL (बाएं हाथ), और AVR (दाहिना हाथ) होता है, और मतलब छोड़ दिया है, जो दिल इज़ाफ़ा 3 के विचारोत्तेजक है बिजली अक्ष के विचलन का आकलन है.
9. पैथोलॉजी और Immunochemical विश्लेषण
- रिकॉर्ड दिल और kDNA उत्परिवर्तित मुर्गियों की प्राकृतिक मृत्यु के बाद शरीर के वजन अनुक्रमित (चित्रा 3). अनुक्रमित भी एक ही उम्र और लिंग का नियंत्रण मुर्गियों प्राप्त करने के लिए.
- दिल, घेघा, आंतों, कंकाल की मांसपेशी, फेफड़े, जिगर और गुर्दे से वर्गों ले लो.
- फिक्स में ऊतक 10% formalin बफर (7.4 पीएच), पैराफिन में एम्बेड और 4 (एचई) Hematoxylin लाल भामसान रंग धुंधला और histological विश्लेषण (चित्रा 3) के लिए मोटी वर्गों माइक्रोन कटौती.
- भ्रूण से फसल और द्विविभाजित ऊतकों β-galactosidase व्यक्त परजीवी के साथ inoculated, अंडे, और विषय से एक्स - लड़की दाग रची 9.
- 1 में भ्रूण के ऊतकों के अन्य आधा फिक्स0 formalin%, पीएच 7.4 और 9.3 कदम में आगे बढ़ना.
- कट में 4μm पतली आयल एम्बेडेड ऊतक अनुभाग और सूक्ष्म परीक्षण के लिए गिलास स्लाइड पर माउंट.
- अंडों पर बैठना एक्स लड़की से सना हुआ विरोधी टी. के खिलाफ मानव chagasic सीरमरोधी (1:1024 मन्दन) के साथ नीले रंग की कोशिकाओं दिखा वर्गों cruzi प्रतिजन.
- वर्गों के साथ पल PBS, 7.4 पीएच, 5 प्रत्येक न्यूनतम धो लें.
- Fluorescein संयुग्मित खरगोश आईजीजी विरोधी मानव के साथ दूसरे ऊष्मायन द्वारा भ्रूण के ऊतकों में कोशिकाओं नीले दाग.
- पीबीएस (कदम 8) के साथ धो वर्गों, coverslip साथ माउंट और टी. colocalizing के लिए नीले प्रकाश 502 एनएम तरंगदैर्ध्य, 200x बढ़ाई, यूवी प्रकाश के तहत परीक्षा पर हरे रंग की कोशिकाओं का निरीक्षण भ्रूण कोशिकाओं में cruzi.
10. Phenotype हार्ट घावों में प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं
- Phenotype kDNA पॉजिटिव से और नियंत्रण kDNA नकारात्मक मुर्गियों से दिल के ऊतक वर्गों में प्रतिरक्षा effectors कोशिकाओं.
- के साथ स्लाइड प्लेसऊतक आयल में 65 ° C पर 30 मिनट के लिए 100% से 70% xylene में और फिर पूर्ण इथेनॉल पीबीएस में 5 मिनट प्रत्येक के लिए चार washes में प्रस्तुत करने के लिए पिछले मोम पिघला करने के लिए एम्बेडेड अनुभाग.
- आसुत जल, हवा शुष्क में स्लाइड कुल्ला, और विशिष्ट मोनोक्लोनल (, fluorescein या आर phycoerythrin संयुग्मित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) एंटीबॉडी SouthernBiotech, बर्मिंघम, अल से प्राप्त के साथ इलाज.
- माउस का प्रयोग करें विरोधी चिकन (बुउ-1 एक और बुउ-1 ख alleles, श्री 70-75 केडीए) बुउ 1 मैब AV20 जन्मजात मुर्गियों के बी सेल एंटीजन पर विकास प्रक्रिया मे जिसका आकार न बदलता हो निर्धारक पहचान करने के लिए.
- माउस का प्रयोग CD45 विरोधी चिकन, पुलिस महानिरीक्षक निर्धारण IgM1 κ चिकन थाइमस वंश कोशिकाओं (190 श्री 215 केडीए संस्करण के लिए) के लिए विशिष्ट है.
- माउस का प्रयोग विरोधी चिकन TCRγδ के (90 केडीए श्री heterodimer) मैब थाइमस निर्भर CD8α + टी कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है.
- माउस का प्रयोग करें विरोधी चिकन मैब CD-8 वें चिकन α श्रृंखला (श्री 34 केडीए) के लिए विशिष्ट पहचानई thymocytes, तिल्ली, दिल, और अन्य ऊतकों में CD8 कोशिकाओं.
- माउस विरोधी चिकन KuL01 के प्रयोग के लिए विशेष रूप से monocytes / भक्षककोशिकीय प्रणाली के मैक्रोफेज पहचान.
- स्लाइड 0.1 एम पीबीएस, 7.4 पीएच, 5 मिनट एक नम कक्ष में 90 मिनट के लिए प्रत्येक विशिष्ट एंटीबॉडी विरोधी phenotype के साथ के बाद ऊष्मायन के साथ तीन बार धो.
- तरंग दैर्ध्य 567 के उत्सर्जन फिल्टर और 502 एनएम के साथ एक फ्लोरोसेंट रोशनी खुर्दबीन के तहत परीक्षा के लिए बफर ग्लिसरीन के साथ स्लाइड इकट्ठे, क्रमशः, लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति लेबल की कोशिकाओं (चित्रा 4) का पता लगाने.
11. डेटा विश्लेषण
- चिकन जीनोम (डेटाबेस का उपयोग करें http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 BLASTn अनुक्रम विश्लेषण के लिए).
- CLUSTALW संरेखण का उपयोग करने के लिए ई - मूल्य स्कोर निर्धारित करने के लिए.
- सैनिक रोजगारआरआई दोहराने मास्किंग एल्गोरिथ्म सेंसर ( http://girinst.org/censor/index.php chimeric दृश्यों में दोहराता के विभिन्न वर्गों के स्थानीयकरण के लिए).
- Kinetoplastid निवेशन और विलोपन अनुक्रम खोज उपकरण (चुंबन) Wu-3 Blastn - बार संशोधित मैट्रिक्स की सहायता साथ kDNA दृश्यों में संभावित gRNAs, पहचान रोजगार.
- टी. का उपयोग करें cruzi दृश्यों http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8 -133 s1.fas chimeras kDNA मेजबान डीएनए gRNAs खोज में. 11.6) का प्रयोग करें विद्यार्थी टी और Kolmorov - स्मिर्नोव परीक्षण, क्रमशः, करने के लिए प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों में प्राप्त बिजली अक्ष के विचलन के बीच और दिल / शरीर के वजन अनुक्रमित के बीच महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए, और मृत्यु दर अनुपात रची मुर्गियों के समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने टी. से cruzi मैंअंडे noculated और नियंत्रण से.
12. प्रतिनिधि परिणाम
100 विषमय टी. का टीका उपजाऊ चिकन अंडे की हवा कक्ष में cruzi trypomastigotes काफी जीवित रची लड़कियों का अनुपात कम नहीं है. लगभग 60% स्वस्थ लड़कियों पक्षियों के बच्चे और 40% अंडे सेने में भ्रूण द्रवीकरण या भ्रूण की मौत से गुजरना सकता है. जीवित लड़कियों kDNA minicircle जीनोम में एकीकृत अनुक्रम बरकरार रहती है. हालांकि, यह उम्मीद है कि कुछ लड़कियों हृद्बृहत्ता और विफलता के साथ सप्ताह में अंडे सेने के बाद मर जाएगा. शेष लड़कियों बाहर स्वस्थ वयस्कों के लिए विकसित होगा. उनके रक्त mononuclear कोशिकाओं से डीएनए निकाला kDNA की पीसीआर प्रवर्धन जीवन के सभी चरणों में उपज है, लेकिन नहीं nDNA. लक्षित प्रधानमंत्री 3 पूंछ पीसीआर, 4 उत्पादों है कि क्लोन कर रहे हैं और अनुक्रम दिखाएगा kDNA मुख्य रूप से 5 करने के लिए कोडिंग 1 macrochromosomes के क्षेत्रों में एकीकृत minicircles. कई kDNA मैं दिखा मुर्गियांसेल के विकास और भेदभाव, प्रतिरक्षा प्रणाली के विनियमन कारकों, और डीएनए की मरम्मत के लिए जीन कोडिंग में ntegrations स्वयं लक्ष्य ऊतकों (चित्रा 3) की अस्वीकृति से गुजरना करने के लिए उम्मीदवार हैं. उदाहरण के लिए, dystrophin जीन (चित्रा 5) का टूटना साथ kDNA उत्परिवर्तन दिखा रहा है, एक प्रोटीन है कि कोशिका झिल्ली को cytoskeleton बांध कोडन, चिकन autoimmune सूजन कार्डियोमायोपैथी और विफलता के विकास के लिए एक उम्मीदवार है.
इन जीनोमिक संशोधनों पौंड संक्रमित अंडे से रची लड़कियों में नहीं देखा जाता है. वहाँ टी. बीच मतभेद हैं cruzi और पौंड kDNA minicircles, टी. cruzi कश्मीर डीएनए minicircle औसत चार चर क्षेत्र (वी.आर.) के साथ 1.4 केबी संरचना संरक्षित क्षेत्रों (सीआर) प्रत्येक CSB1 पेश CSB2, और CSB3 क्षेत्रों, जिसमें सीए अमीर तुला डीएनए प्रतिकृति की दीक्षा के लिए विशिष्ट साइटों पर विचार कर रहे हैं प्रतिलेखन द्वारा interspersed, पुनर्संयोजन, और पार्श्व डीएनए के हस्तांतरण के लिए
| भजन की पुस्तक | लक्ष्य डीएनए | अनुक्रम | Tm * |
| 34 एस | टी. cruzi kDNA | 5 'एसीए सीसीए एसीसी सीसीए एटीसी GAA 3 सीसी' | 57.9 |
| 67 एस | टी.cruzi kDNA | 5 'GGT TTT GGG AGG जी जी (जी / सी) (जी / सी) (टी / जी) 3 टीसी' | 60.1 |
| 35 एस | टी. cruzi kDNA | 5 'ATA ATG टीएसी (टी / जी) GGG GA जी ए टी 3 जी सी' | 59.4 |
| 36 एस | टी. cruzi kDNA | 5 'GGT TCG ATT GGG GTT GGT जी 3' | 57,9 |
| Lb3 | पौंड kDNA | 5 'GGG GTT GGT GTA एटीए टैग TGG जी 3' | 55.9 |
| Lb5 | पौंड kDNA | 5 'CTA ATT GTG सीएसी GGG भूमिकाः 3 जी' | 61.4 |
| 1 gg | Gallus gallus | 5 'AGC TGA टीसीसी TAA AGG सीएजी AGC 3' | 60.1 |
| Gg2 | Gallus जी | 5 'CTG AGC सीटीसी टी जी सीTTT GAA एक 3 ' | 56.8 |
| Gg3 | Gallus जी | 5 'TTT CAA AGC आगा GGC TCG जी 3' | 60.1 |
| Gg4 | Gallus जी | 3 'GCT CTG CCT TTA GGA TCA 5 GCT' | 64.2 |
| Gg5 | Gallus जी | 3 'AGC AAC TCA GCG टीसीसी एसीसी 5 टीटी' | 62.3 |
| Gg6 | Gallus जी | 3 'CTG TTA GCA, TGA GGC टीटीसी एक 5 एसीए' | 60.4 |
तालिका 1. Primes पीसीआर amplifications में प्रयुक्त. * Tm = औसत annealing के तापमान डिग्री सेल्सियस
चित्रा 1 टी.पी. रणनीति पूंछ-पीसीआर Gallus gallus जीनोम के में ट्रायपैनोसोमा cruzi के kDNA एकीकरण का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया. एक) kDNA का एक टुकड़ा के साथ एक chimeric अनुक्रम (गहरे नीले) संरक्षित और चर (हल्का नीला) चिकन 10 जीनोम (हरा) 4 गुणसूत्र (AY237306) के में NW_001471687.1 बिन्दुपथ में एकीकृत क्षेत्रों minicircle होस्ट करने के लिए प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था विशिष्ट प्राइमर सेट के (Gg1 Gg6). बी) टी.पी. पूंछ पीसीआर amplifications (प्राथमिक चक्र) minicircle विशिष्ट चिकन विशेष Gg1 के Gg6 प्राइमरों के साथ S34 या S67 संयोजन में प्राइमरों annealing के द्वारा शुरू किया गया. पतला उत्पादों माध्यमिक चक्र के लिए (भावना antisense /) S35 प्राइमरों और gg प्राइमरों के संयोजन के साथ टेम्पलेट प्रदान की है. तृतीयक चक्र में माध्यमिक उत्पादों की एक कमजोर पड़ने S36 kDNA या S67 antisense प्राइमरों के साथ gg प्राइमर के साथ संयोजन में प्रवर्धन के अधीन थाहै. सी) इन प्रवर्धन उत्पादों के 1% agarose जैल में अलग हो गए थे और नायलॉन झिल्ली को हस्तांतरित, विशिष्ट kDNA जांच के साथ संकरण हुआ. एकीकरण के बिंदु निर्धारित करने के लिए सकारात्मक संकेत दिखा नमूने क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया. kDNA का संयोजन और Gg1 के लिए Gg6 लक्षित जेल के शीर्ष पर दिखाया जाता है. अनुक्रमिक पीसीआर प्रतिक्रियाओं kDNA minicircles (नीला) और एवियन अनुक्रम (हरा) के साथ लक्ष्य kDNA मेजबान डीएनए दृश्यों प्रवर्धित. (उष्णकटिबंधीय रोगों 3 उपेक्षित PLoS से पुनर्प्रकाशित).
चित्रा 2 टी. से एक 9 महीने की उम्र में mitochondrial kDNA के एकीकरण द्वारा आनुवंशिक रूप से संशोधित चिकन में बिगड़ा दिल समारोह के नैदानिक अभिव्यक्तियाँ minicircle. cruzi. mitochondrial kDNA उत्परिवर्तित नियंत्रण 9 महीने की उम्र में chicke की चमकदार लाल कंघी के साथ एक बैंगनी कंघी विरोधाभासों दिखा चिकन की गरीब रक्त oxygenationn दिल क्षति से मुक्त है. (उष्णकटिबंधीय रोगों 3 उपेक्षित PLoS से संशोधित).
चित्रा 3 kDNA म्यूटेशनों के साथ Gallus gallus में सकल और सूक्ष्म विकृति. ए) cardiomegaly 9 महीने की उम्र में एक मुर्गी है कि दिल की विफलता की मृत्यु हो गई. बी) एक noninfected मुर्गी 9 महीने की उम्र से नियंत्रण दिल. सी) लक्ष्य हृदय कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों द्वारा अस्वीकृति: लिम्फोसाइटों द्वारा प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लक्ष्य lyses साथ एक न्यूनतम अस्वीकृति इकाई (चक्र) में दिखाया गया है. डी) नियंत्रण हृदय ऊतक विज्ञान (उष्णकटिबंधीय रोगों 3 उपेक्षित PLoS से संशोधित).
चित्रा 4 प्रतिरक्षा प्रणाली kDNA-उत्परिवर्तित 3 चित्र में दिखाया चिकन के दिल में घुसपैठ की कोशिकाओं के Immunocytochemical विश्लेषण. एक CD45) लिम्फोसाइटों दिल ले में पहचान (तीर)वजहें एक phycoerythrin - लेबल विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के द्वारा. बी) सीडी 8 + γδ प्रतिरक्षा लिम्फोसाइटों (तीर) दिल की गंभीर विनाश में शामिल किया गया. सी) प्रचुर मात्रा में CD8α + टी कोशिकाओं दिल सेल lyses के साथ गंभीर घावों में उपस्थित थे. आवेषण नियंत्रण असंक्रमित चिकन दिल (उष्णकटिबंधीय रोगों 3 उपेक्षित PLoS से संशोधित) में प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं का अभाव दिखा.
चित्रा 5 dystrophin जीन kDNA एकीकरण के साथ एक F2 संतान में फैली हुई भड़काऊ कार्डियोमायोपैथी Chagas की तरह. एक) एक 10 महीने की उम्र में चिकन वक्ष गुहा (दिल वजन = 16 ग्राम) की सबसे कब्जे में फैली हुई दिल. बी) डार्क दौर mononuclear कोशिकाओं पैठ और kDNA - उत्परिवर्तित मुर्गी की मायोकार्डियम को नष्ट कर देता है. सी) की 10 महीने की उम्र में एक नियंत्रण चिकन सामान्य दिल आकार (वजन 7 ग्राम). डी) एक नियंत्रण चिकन दिल की सामान्य ऊतक विज्ञान. (PLoS से संशोधित उपेक्षित रेखाअल रोगों 3).
चित्रा 6 kDNA - उत्परिवर्तित चिकन और मानव Chagas रोग में तुलनात्मक विकृति. ए) गंभीर और चिकन kDNA-उत्परिवर्तित में मायोकार्डिटिस लक्ष्य दिल सेल lyses. बी) गंभीर और Chagas हृदय रोग के मामले में प्रतिरक्षा लिम्फोसाइटों द्वारा मायोकार्डिटिस लक्ष्य सेल lyses. सी) kDNA-उत्परिवर्तित चिकन में प्रतिरक्षा लिम्फोसाइटों द्वारा हृदय कोशिकाओं की अस्वीकृति. डी) मानव Chagas रोग प्रतिरक्षा लिम्फोसाइटों द्वारा हृदय कोशिकाओं की अस्वीकृति. Hematoxilin और लाल भामसान रंग से सना हुआ. (Memórias से संशोधित करते हैं Instituto ओस्वाल्दो क्रूज़, रियो डी जनेरियो 14).
Discussion
जीवन भर टी. अतिसंवेदनशील स्तनधारियों के विपरीत cruzi संक्रमण, मुर्गी टी. के लिए आग रोक रहे हैं cruzi संक्रमण. चिकन मॉडल प्रणाली का प्रमुख लाभ भ्रूण प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास में जल्दी संक्रमण के उन्मूलन है. इस प्रकार, केवल परजीवी चिकन शरीर के भीतर शेष डीएनए कई loci में एकीकृत है.
इष्टतम विषमय टी. की मात्रा का प्रयोग cruzi उपजाऊ अंडा टीका लगाना trypomastigotes चिकन भ्रूण जीनोम में kDNA minicircles के एकीकरण को प्राप्त करने की दिशा में महत्वपूर्ण कदम है. 100 trypomastigotes साथ inoculated अंडे से जीना लड़कियों अंडे सेने की दर चार गुना 500 परजीवी के साथ प्राप्त की तुलना में अधिक है. देखभाल के लिए संस्कृति के माध्यम 10 μL में है अंडा हवा कक्ष में परजीवी निलंबन टीका लगाना करने के लिए लिया जाना चाहिए. अंडे का सफेद का रिसाव नहीं होना चाहिए. इष्टतम शर्तों के तहत, intracellular परजीवी संक्रमण जगह वाई लेता हैउसके बाद संक्रमण सहज रोगक्षमता से सफाया कर दिया है, एक सप्ताह के लिए मेजबान कोशिकाओं आय अंदर ऊष्मायन और परजीवी गुणन के बाद कुछ घंटे पतली. kDNA एकीकरण रहने वाले संक्रमण की आवश्यकता है, और जल्दी भ्रूण चिकन अंडे में minicircles की नग्न टीका एकीकरण में परिणाम नहीं करता है. kDNA सकारात्मक भ्रूण और नियंत्रण में 37.5 डिग्री सेल्सियस और 65% आर्द्रता नियंत्रित परिस्थितियों में रखा जाना चाहिए. लड़कियों को दो सप्ताह के लिए पिंजरों में 33 डिग्री सेल्सियस कमरे के तापमान पर रखा जाता है. इसके बाद मुर्गियों निलंबित 22 में एक कमरे में 1.5 मीटर चौड़ाई aisles के द्वारा अलग रैक पर पिंजरों में रखा जाता है डिग्री सेल्सियस फ़िल्टर्ड हवा और निरंतर थकान के तहत सकारात्मक दबाव पशु कल्याण की स्थिति को सुरक्षित करने के साथ. वयस्कों चिकन चाउ खिलाया जाता है और पीने योग्य पानी चल रहा है पीने के पूर्ण विकास और परिपक्वता को प्राप्त करने के लिए, उम्र के पांच महीने में अंडे बिछाने. स्वच्छ प्रक्रियाओं के रखरखाव के परिणामों के reproducibility के लिए आवश्यक हैं जब टी. साथ काम cruzi टीकाउपजाऊ चिकन अंडे में.
चिकन मॉडल प्रणाली टी. में cruzi संक्रमण भ्रूण विकास के प्रारंभिक काल में प्रतिरक्षा प्रणाली के विकास के बाद खत्म कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त संक्रमण से मुक्त किया जा रहा है, लड़कियों कि टी. से पक्षियों के बच्चे cruzi अंडे टीका, विशिष्ट एंटीबॉडी के अभाव में, परजीवी प्रतिजनों के लिए सहिष्णु हैं. साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों (कम से कम अस्वीकृति इकाई, चित्रा 3) के द्वारा लक्ष्य हृदय कोशिकाओं की अस्वीकृति kDNA-उत्परिवर्तित जीनोटाइप प्रतिरक्षाविज्ञानी निगरानी के 3 और संशोधनों टूटने दिखा मुर्गियों में देखा जाता है. genotypically संशोधित टी कोशिकाओं को शरीर में स्वयं के ऊतकों के त्वरित अस्वीकृति प्रस्तुत करते हैं. मुख्य घाव साइट दिल है, जो Chagas रोग की एक बानगी है. एक शारीरिक (निगरानी) से एक physiopathologic राज्य के लिए पारित kDNA-उत्परिवर्तित clonally के साइटोटोक्सिक 3 लिम्फोसाइटों प्रसार दिखा चिकन में देखा जाता है.
टीअपने transkingdom मॉडल प्रणाली एक परजीवी प्रेरित, आनुवंशिक रूप से संचालित autoimmune रोग है (चित्रा 6) से पता चलता है, टी. द्वारा जीनोम संशोधनों से stemming cruzi kDNA एकीकरण minicircle. इन संशोधनों के पौंड - टीका अंडे से रची लड़कियों में नहीं देखा जाता है.
इस घटना kDNA उत्परिवर्तित मुर्गियों में सूजन autoimmune cardiomyopathy के कि प्रयोगात्मक उपचार का पता चलता है विशिष्ट टी सेल मायोकार्डियम घुसपैठ phenotype की अस्थि मज्जा पूर्वज की दवा, दमन और histocompatible स्वस्थ हड्डी मज्जा के प्रत्यारोपण की आवश्यकता होती है आत्म - ऊतक की अस्वीकृति को रोकने सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम नैन्सी आर Sturm, इम्यूनोलॉजी विभाग, सूक्ष्म जीव विज्ञान और आण्विक जीवविज्ञान, दाऊद Geffen स्कूल ऑफ मेडिसिन, लॉस एंजिल्स में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय महत्वपूर्ण पढ़ने पांडुलिपि के लिए, के लिए आभारी हैं. अनुसंधान CNPq की राष्ट्रीय परिषद और विकास FAPDF, ब्राजील अनुसंधान के लिए फाउंडेशन, अध्ययन का समर्थन किया. हम ब्रासीलिया, ब्राजील के विश्वविद्यालय से Alessandro ओ सूजा, मारिया सी. Guimaro, सिरो Cordeiro, Ana डे कैसिया रोजा, Roseneide Alves, और राफेल Andrade की तकनीकी सहायता, धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase Recombinant | Invitrogen | 11615-010 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-030 | |
| Random Primers DNA Labeling System | Invitrogen | 18187-013 | |
| EcoRI | Invitrogen | 15202-021 | |
| MboI | Invitrogen | 15248-016 | |
| dNTP Set, 100mM Solutions | GE Healthcare | 28-4065-51 | |
| Amersham Hybond - N+ -- Cat n. | GE Healthcare | RPN303B | |
| PlasmidPrep Mini Spin kit | GE Healthcare | 28-9042-70 | |
| NsiI | Sigma-Aldrich | R5884 1KU | |
| DNA, Sodium Salt Fish Sperm | AMRESCO | 0644-10G | |
| Mouse anti-chicken Bu-1b | SouthernBiotech | 8370-02 | |
| Mouse anti-chicken CD45 | SouthernBiotech | 8270-08 | |
| Mouse anti-chicken TCRγδ | SouthernBiotech | 8230-08 | |
| Mouse anti-chicken CD8α | SouthernBiotech | 9220-02 | |
| Mouse anti-chicken monocyte/macrophage | SouthernBiotech | 8420-02 | |
| MyCycle Termocycler | Bio-Rad | 580BR 5501 |
References
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