Parasite indotta geneticamente Driven Autoimmune Disease Cuore Chagas nel modello di pollo

Summary

L'inoculazione di

Abstract

Le infezioni acute Trypanosoma cruzi acquisite durante l'infanzia e l'infanzia sembrano asintomatica, ma circa un terzo dei casi con infezione cronica mostrano la malattia di Chagas fino a tre decenni o versioni successive. Autoimmunità e persistenza parassita sono in competizione le teorie per spiegare la patogenesi della malattia di Chagas ^{1, 2.} Per ruoli distinti svolto dalla persistenza parassita e autoimmunità nella malattia di Chagas si inoculare il T. cruzi nella camera d'aria di uova fecondate. Il sistema immunitario di pollo maturo è una barriera a tenuta biologica contro T. cruzi e l'infezione è sradicata sullo sviluppo del suo sistema immunitario dalla fine della prima settimana di crescita ^3. I pulcini sono parassiti-free al momento della schiusa, ma mantengono integrato parassita cinetoplasto DNA mitocondriale (kDNA) minicircle nel loro genoma che vengono trasferiti alla loro progenie. Documentazione di integrazione kDNA minicircle nel genoma di pollo è stato ottenuto da un targeted prime TAIL-PCR, ibridazioni del Sud, la clonazione e sequenziamento ^{3, 4.} Il kDNA minicircle integrazioni rottura cornici di lettura aperte per la trascrizione e fattori del sistema immunitario, fosfatasi (GTPasi), adenilato ciclasi e fosforilasi (PKC, NF-kappa B attivatore, PI-3K) associata fisiologia cellulare, la crescita, la differenziazione e ^{3, 5 - 7,} e altre funzioni geniche. Miocardite grave a causa di rifiuto di fibre cardiache bersaglio da parte dei linfociti citotossici effettori è visto nei polli kDNA mutati, mostrando una cardiomiopatia infiammatoria simile a quella osservata nell'uomo la malattia di Chagas. In particolare, insufficienza cardiaca e debolezza muscolare scheletrico sono presenti polli in adulti con kDNA rottura del gene distrofina nel cromosoma 1 ^8. Simili alterazioni genotipiche sono associati con la distruzione dei tessuti effettuata da effettori CD45 + e + e CD8γδ CD8α linfociti. Così questa infezione protozoo può indurre geneticamente guidato malattia autoimmune.

Protocol

1. Crescita dei parassiti

1. Grow forme trypomastigote di T. Berenice cruzi e la β-galattosidasi-esprimono Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 in cellule muscolari murino (L6) coltivate in terreno essenziale minimo di Dulbecco con il 10% FSB, 100 IU / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina, e 250 nM L-glutamina (pH 7,2), 5% CO ₂ a 37 ° C. I free-nuoto tripomastigoti nel mezzo supernatante sono state utilizzate per inoculare uova di gallina.
2. Grow Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 magazzino coltivate in DMEM con 20% FBS. La forma promastigote Lb nella fase di crescita esponenziale è stata utilizzata per inoculare uova ^9.

2. Parasite inoculazione in uova di gallina fecondate

1. Inoculare una sospensione di 100 T. cruzi tripomastigoti in 10 pl di mezzo di coltura attraverso un foro di 2 mm di diametro nel guscio dell'uovo sulla parte superiore della camera d'aria di stadioX uova fertili. L'invasione e la replicazione dei parassiti virulenti nelle cellule embrionali sono mostrati in video S1. I gruppi di controllo sono le seguenti: a) polli di controllo; b) uova controllo finte ricezione 10 pl di mezzo di coltura; c) fase X uova fertili inoculate con una sospensione di 100 promastigoti Lb in 10 pl di mezzo di coltura T.. cruzi e Lb appartengono alla famiglia kinetoplastidi. Rispettivamente, questi protozoi crescere liberi nel citoplasma o nel vacuolo parassitoforo delle cellule ospiti ^10.
2. Sigillare i fori con nastro adesivo.
3. Incubare la T. cruzi-uova infette e dei campioni di controllo finte e non infetti a 37,5 ° C e 65% di umidità per 21 giorni.
4. Tenere i pulcini che si schiudono in incubatrice per 24 ore e successivamente a 32 ° C per tre settimane.

3. I campioni per l'estrazione del DNA

1. Cellule mononucleari di sangue periferico sono stati ottenuti da polli: a)nati da T. uova inoculate cruzi, b), c) controlli deride trattati con 10 microlitri di terreno di coltura; d) nati da uova Lb inoculate; globuli bianchi provenienti da polli sono trattati per l'estrazione del DNA in accordo con un protocollo standard ^11.
2. Estrarre il DNA anche da sperma raccolto galli, e da ovociti sterili (<5 mm) raccolti da galline nati da uova inoculate con T. cruzi, e da galline da uova schiuse di controllo ^{3, 4.}
3. Estratto kDNA dal T. cruzi epimastigote forma e, anche, dal promastigoti Lb, come descritto altrove ^9.

4. Primers e sonde utilizzate

Gli inneschi usati per amplificazioni di PCR e le condizioni termiche sono mostrati nella Tabella 1.

Le sonde utilizzate in ibridazioni Southern blot sono stati:

1. Wild-type minicircle (~ 1,4 kb) sequenze puricato da T. cruzi epimastigote forme;
2. Minicircle frammenti (362 bp) ottenuti da Nsi I digest di wild-type kDNA;
3. DNA nucleare (nDNA) sequenza ripetitiva (188 bp) ottenuto mediante amplificazione del DNA parassita con i Tcz1 / 2 primer. Le sonde sono stati purificati da gel di agarosio 1% ^3.
4. Wild-type minicircle (~ 0,820 kb) sequenze promastigoti Lb.

5. Analisi PCR

1. Esegui procedura standard di PCR con DNA genomico da pulcini infetti e non infetti controlli e deridere con T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 ¹² e ¹³ kDNA s35/s36 primers. Inoltre, eseguire PCR con DNA genomico da polli nati da uova di Lb infetto utilizzando le specifiche LB3 protozoi e LB5 primer (Tabella 1).
2. Fare miscela di reazione con 100 ng di DNA templato, 0,4 pM di ogni coppia di inneschi, 2 U di DNA polimerasi Taq, 0,2 mM dNTP, e 1,5 mM MgCl
3. Impostare programma termociclatore per 95 ° C per 5 minuti, 30 cicli di 30 sec a 95 ° C/30 secondi a 68 ° C / 1 min a 72 ° C con 5 min estensione finale prima refrigerazione.
4. Analizzare i prodotti di amplificazione in gel di agarosio 1,3%, che viene trasferito ad una membrana di nylon caricata positivamente (GE Life Sciences) con il metodo alcalino per ibridazione con sonde specifiche marcate con _[α-32 P] dATP utilizzando casuale Primer Labeling Kit (Invitrogen , Carlsbad, CA).

6. Genomiche Southern Blot

1. Utilizzare Mbo I e / o con Eco RI (Invitrogen) enzimi che rendono tagli singoli in minicircles integrati in campioni di DNA di tessuti corporei.
2. DNA Digest dai polli infetti e di controllo da polli nati da uova inoculate con virulento T. cruzi forma.
3. Oggetto del digest di DNA da T. cruzi eda campioni di pollame ad elettroforesi in gel di agarosio 0,8% a 50 V notte a 4 ° C.
4. Trasferire bande di DNA separati di membrana di nylon caricata positivamente.
5. Ibridare le bande di DNA marcato con radio kDNA sonda.
6. Lavare la membrana due volte per 15 min a 65 ° C con 2X SSC e 0,1% SDS, due volte per 15 min a 65 ° C ciascuno con 0,2 x SSC e 0,1% SDS, e autoradiograph per periodi di tempo variabili.

7. Prime mirata TAIL-PCR

1. Ottenere amplificazione del kDNA minicircle integrato nel genoma di un pollo modificato TAIL-PCR tecnica, che combina primer kDNA con primer specifica fissa ² in tre cabina cicli annidati PCR, come mostrato nella Figura 1.
2. Ciclo elementare: Ogni reazione include 200 ng di DNA modello, 2,5 mM MgCl _2, e 0,4 pM di kDNA primer (S34 o S67), dNTP 0,2 mM, 2,5 U Taq platino (Invitrogen, Carlsbad, CA). Utilizzare i primer kDNA in combinazione con 0,04 pM di Gg primer (GG1 a GG6, tabella 1), separatamente. Impostare la temperatura 57,9-60,1 ° C per kDNA primer e 59,9-65,6 ° C per la CR-1 primer. Si noti che queste temperature sono superiori a quelli (~ 45 ° C) richiesto per i primer degenerati arbitrari utilizzati nel TAIL-PCR ^10. Temperatura di utilizzo e cicli (MyCycle Thermocycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) descritte in un precedente articolo ^3.
3. Ciclo secondario: diluire i prodotti PCR da 1:40 ciclo primario (v / v) in acqua. kDNA primer antisenso S35 e S35 sostituito quelli precedenti, insieme con gli inneschi Gg stessi.
4. Ciclo terziario: diluire i prodotti PCR da 1:10 ciclo secondario (v / v) in acqua e si combinano con Gg primer antisenso S67 o S36, separatamente.
5. Clonare i prodotti di PCR terziario ciclo: clonare direttamente nel vettore pGEM T easy (Promega, Madison, WI)i prodotti di amplificazione ultimo che ibridano con kDNA sonda.
6. Selezionare cloni mediante ibridazione con sonda kDNA e sequenza.
7. Convalidare il tpTAIL-PCR in un mix di 300 pg di kDNA da T. cruzi con 200 ng di DNA da volatili di controllo non esposto kDNA. I cicli di temperatura e amplificazione sono gli stessi utilizzati per il DNA degli uccelli test '.

8. Malattia di Chagas Manifestazione Clinic

1. Monitorare la crescita e lo sviluppo di polli nati da T. cruzi infettato uova e dei controlli sani non-nati da uova infette al giorno per mortalità e settimanale per le manifestazioni della malattia.
2. Rilevare anomalie cliniche a quei polli (Figura 2) e fare elettrocardiografo (ECG) registrazioni per valutare gli assi elettrici, battito cardiaco e aritmie ^3.
3. Oggetto kDNA-mutato e controlla polli mensili registrazioni ECG di ventricolare aumentata delle Nazioni Uniteipolar conduce aVF (gamba sinistra), aVL (braccio sinistro), e AVR (braccio destro), e di valutare la deviazione della media asse elettrico a sinistra, che è indicativa di ingrandimento del cuore ^3.

9. Analisi e Patologia immunochimica

1. Record cuore e indici peso corporeo dopo morti naturali di polli kDNA mutati (Figura 3). Ottenere indici anche per i polli di controllo della stessa età e sesso.
2. Prendere sezioni dal cuore, esofago, intestino, muscolo scheletrico, polmoni, fegato e reni.
3. Fissare il tessuto in formalina tamponata al 10% (pH 7,4), incorporare in paraffina e tagliati a 4 micron di spessore per sezioni ematossilina-eosina (HE), colorazione ed analisi istologiche (Figura 3).
4. Harvest tessuti e bisect a partire da embrioni nati da uova inoculate con parassiti che esprimono β-galattosidasi, e subordinatamente a X-Gal-macchia. ⁹
5. Fissare l'altra metà dei tessuti embrionali in 10% formalina, pH 7.4 e procedere come indicato al punto 9.3.
6. Tagliare 4 _m sottile sezione di tessuto inclusi in paraffina e montata sul vetrino per l'esame microscopico.
7. Incubare le sezioni che mostrano le cellule blu X-Gal-macchiati con umana chagasic antisiero (diluizione 1:1024) contro anti-T. cruzi antigene.
8. Lavare le sezioni trice con PBS, pH 7.4, 5 minuti ciascuna.
9. Colora le cellule blu nei tessuti embrionali dalla seconda incubazione con fluoresceina-coniglio coniugato anti-IgG umane.
10. Lavare le sezioni con PBS (punto 8), montaggio con coprioggetto e osservare le cellule azzurro-up verde dopo l'esame ai raggi UV a lunghezza d'onda 502 nm, ingrandimento 200x, per colocalizing T. cruzi su cellule embrionali.

10. Fenotipo cellule del sistema immunitario a lesioni cardiache

1. Fenotipo delle cellule immunitarie effettori in sezioni di tessuto del cuore da kDNA-positivi e dal controllo kDNA-negativi polli.
2. Porre i vetrini contessuto sezione inclusi in paraffina a 65 ° C per 30 minuti a sciogliersi cera precedente presentazione in quattro lavaggi in 100% al 70% xilene e quindi in etanolo assoluto PBS per 5 min ciascuna.
3. Sciacquare i vetrini in acqua distillata, aria secca, e trattare con specifici anticorpi monoclonali (fluoresceina o R-ficoeritrina coniugati con anticorpi monoclonali) ottenuti da SouthernBiotech, Birmingham, AL.
   1. Usa il mouse anti-pollo Bu-1 (Bu-1 _a e BU-1 alleli _B, signor 70-75 kDa) Mab AV20 di riconoscere determinante monomorfa sulle antigeni delle cellule B di polli consanguinee.
   2. Usa il mouse anti-CD45 di pollo, isotipo Ig IgM1 κ specifico di cellule del timo lignaggio di pollo (MR 190-215-KDa variante).
   3. Usa il mouse anti-pollo TCRγδ + (Mr 90 kDa eterodimero) monoclonale specifico per le cellule del timo dipendenti CD8α + t.
   4. Usa il mouse anti-pollo Mab CD-8 specifica al pollo della catena α (Mr 34 kDa) riconoscono °di e cellule CD8 in timociti, milza, cuore, e altri tessuti.
   5. Utilizzare topo anti-pollo KuL01 riconoscere esclusivamente monociti / macrofagi del sistema fagocita.
4. Lavare il vetrino tre volte con PBS 0,1 M, pH 7,4, 5 minuti dopo ogni incubazione con anticorpi specifici anti-fenotipo anticorpo per 90 min in una camera umida.
5. Montare il vetrino con glicerolo tamponato per esame sotto un microscopio con luce fluorescente filtro per le emissioni di lunghezza d'onda 567 e 502 nm, rispettivamente, per rilevare le cellule marcato per fluorescenza rossa e verde (Figura 4).

11. Analisi dei dati

1. Utilizzare il database genoma pollo ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) per le analisi di sequenza BLASTN.
2. Utilizzare allineamenti CLUSTALW per determinare e valore punteggi.
3. Impiega il GIRI ripetizione algoritmo di mascheramento CENSOR ( http://girinst.org/censor/index.php ) per la localizzazione di diverse classi di ripetizioni nelle sequenze chimerici.
4. Utilizzare l'inserimento kinetoplastidi e Sequence strumento di eliminazione di ricerca (KISS) per identificare i potenziali gRNAs nelle sequenze kDNA, con l'aiuto di WU-BLASTN-modified-matrice ^3.
5. Utilizzare T. sequenze cruzi http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-~~HEAD=NNS 2164-8-133-s1.fas per cercare in gRNAs nei kDNA-ospite chimere DNA. 11.6) Student Use t e le Kolmorov-Smirnov test, rispettivamente, per individuare differenze significative tra deviazioni di assi elettrici e tra cuore / corpo indici di peso ottenuti nei gruppi sperimentali e di controllo, e di rilevare tassi di mortalità differenze significative tra i gruppi di polli nati da T. cruzi inoculated uova e dai controlli.

12. Risultati rappresentativi

L'inoculo di 100 virulento T. tripomastigoti cruzi nella camera d'aria di uova di gallina fertili non riduce sensibilmente i rapporti di pulcini vivo. Circa il 60% si schiudono pulcini sani e il 40% possono subire liquefazione embrione o la morte dell'embrione al momento della schiusa. I pulcini sopravvissuti mantengono la sequenza minicircle kDNA integrato nel genoma. Tuttavia, si prevede che alcuni pulcini morirà con cardiomegalia e di scompenso nelle settimane dopo la schiusa. I pulcini rimanenti crescere per adulti apparentemente sani. In tutte le fasi della vita del DNA estratto da loro cellule mononucleate del sangue darà l'amplificazione PCR di kDNA, ma non nDNA. Il mirata-prime TAIL-PCR ^{3, 4} prodotti che vengono clonati e la sequenza mostrerà il kDNA minicircles integrato soprattutto in regioni codificanti di macrochromosomes da 1 a 5. I polli che mostrano i più kDNAntegrations in geni che codificano per la crescita e la differenziazione cellulare, fattori di regolazione del sistema immunitario, e la riparazione del DNA sono candidati a subire il rifiuto dei tessuti bersaglio sé (Figura 3). Ad esempio, il pollo mostra mutazione kDNA con rottura del gene distrofina (figura 5), codifica una proteina che lega il citoscheletro alla membrana cellulare, è un candidato per sviluppare autoimmune cardiomiopatia infiammatoria e guasti.

Queste modifiche genomiche non si vedono in pulcini nati da uova infette Lb. Ci sono differenze tra T. cruzi e Lb minicircles kDNA; Il T. cruzi k DNA minicircle media 1,4 kb struttura con quattro regione variabile (VR) intervallate da regioni conservate (CR) ognuna delle quali presenta CSB1, i CSB2 e CSB3 regioni, in cui sono considerati CA ricco di DNA piegate siti specifici per l'inizio della replicazione, trascrizione, ricombinazione, e per il trasferimento di DNA laterale l'Lb kDNA minicircle (dimensione media 820 bp) contiene solo CR seguita da VR. CR ha conservato CSB1 (GGGCGT) e CSB2 (CCCCGTTC) blocchi, che sono diverse da quelle del T. cruzi minicircles ^{15, 16 e 17.} Considerando che Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) 12 mostra omologia nts al T. cruzi è concepibile che sia la Lb kDNA minicircle integra in una frequenza molto bassa, che può non essere visibile dalle tecniche utilizzate, o che può, eventualmente, non integrarsi nel genoma pollo affatto.

Primer	Obiettivo DNA	Sequenza	Tm *
S 34	T. cruzi kDNA	5 'ACC ACA CCA CCA ATC GAA CC 3'	57,9
S 67	T.cruzi kDNA	5 'TTT GGT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3'	60,1
S 35	T. cruzi kDNA	5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3'	59,4
S 36	T. cruzi kDNA	5 'GGT TCG ATT GGG GGT GTT G 3'	57,9
Lb3	Lb kDNA	5 'GGG GGT GTT GTA TAG ATA TGG G 3'	55,9
LB5	Lb kDNA	5 'CTA ATT GTG GAG CAC GGG G 3'	61,4
Gg 1	Gallus gallus	5 'AGC TGA TCC TAA AGG CAG AGC 3'	60,1
Gg2	G. gallus	5 'CTG AGC CTC TGCTTT GAA A 3 '	56,8
Gg3	G. gallus	5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3'	60,1
Gg4	G. gallus	3 'GCT CTG CCT TTA GGA TCA GCT 5'	64,2
Gg5	G. gallus	3 'AGC AAC TCA TCC GCG ACC TT 5'	62,3
GG6	G. gallus	3 'CTG GCA TTA TGA GGC TTC ACA A 5'	60,4

Primes Tabella 1. Utilizzato nelle amplificazioni PCR. * Tm = temperatura media di ricottura ° C.

Figura 1. La TAIL-PCR tp strategia utilizzata per rilevare Trypanosoma cruzi kDNA integrazione nel genoma Gallus gallus. A) Una sequenza chimerico con un frammento di kDNA minicircle conservate (blu scuro) e variabile (luce blu) regioni integrati nel locus NW_001471687.1 sul cromosoma 4 (AY237306) del genoma pollo ¹⁰ (verde) è stato utilizzato per ottenere l'host serie di primer specifici (GG1 a GG6). B) la coda tp-PCR amplificazioni sono state avviate (ciclo elementare) mediante ricottura delle minicircle specifici S34 o S67 primer in combinazione con i polli-specifici GG1 a GG6 primer. Prodotti diluito previsto modello per il ciclo secondario con l'S35 (senso / antisenso) primer e le combinazioni di primer Gg. Nel ciclo terziario una diluizione dei prodotti secondari è stato sottoposto ad amplificazione con kDNA S36 o S67 primer antisenso in combinazione con l'innesco Ggs. C) Questi prodotti di amplificazione sono stati separati in 1% gel di agarosio e trasferito su una membrana di nylon, ibridato con la sonda specifica kDNA. Campioni che mostrano segnale positivo sono stati usati per la clonazione per determinare il punto di integrazione. Le combinazioni di kDNA e mirate GG1 per GG6 sono mostrati sulla superficie del gel. Le reazioni sequenziali di PCR amplificato bersaglio kDNA-host sequenze di DNA con kDNA minicircles (blu) e la sequenza aviaria (verde). (Ristampato da PLoS Neglected Tropical Diseases ^3).

Figura 2. Le manifestazioni cliniche della funzione cardiaca compromessa in un pollo 9 mesi geneticamente modificati attraverso l'integrazione della mitocondriale kDNA minicircle da T. cruzi. La scarsa ossigenazione del sangue del pollo kDNA mitocondriale mutato mostrando contrasti a pettine viola con il pettine rosso del controllo 9-month-old chicken esenti da attacchi di cuore. (Modificato da PLoS Neglected Tropical Diseases ^3).

Figura 3. Gross e microscopica patologia in Gallus gallus con mutazioni kDNA. A) Cardiomegalia in un 9-month-old gallina che morì di insufficienza cardiaca. B) il cuore di controllo da un non infetto 9-month-old gallina. C) Il rigetto delle cellule del cuore bersaglio da parte dei linfociti citotossici: Un'unità rifiuto minimo con lisi delle cellule bersaglio da parte dei linfociti del sistema immunitario è raffigurato (cerchio). D) Controllo cuore istologia (Modificato da PLoS Neglected Tropical Diseases ^3).

Figura 4. Immunocitochimici analisi delle cellule del sistema immunitario infiltranti cuore di kDNA-mutato pollo mostrato in Figura 3. A) linfociti CD45 + identificato (frecce) nel cuore lesioni da un ficoeritrina-marcato anticorpo monoclonale specifico. B) CD8 + γδ linfociti del sistema immunitario (frecce) coinvolti nella distruzione severa del cuore. C) abbondanti CD8α + cellule T presenti nelle lesioni più gravi, con lisi delle cellule cardiache. Gli inserti dimostrare l'assenza di cellule del sistema immunitario nel cuore di pollo infetto di controllo (Modificato da PLoS Neglected Tropical Diseases ^3).

Figura 5. Chagas-like cardiomiopatia dilatativa infiammatoria in una progenie F2 con integrazione kDNA nel gene della distrofina. A) in un cuore dilatato di 10 mesi di pollo che occupa la maggior parte della cavità toracica (peso del cuore = 16 g). B) scuri rotondi infiltrati mononucleari e distrugge le cellule del miocardio della gallina kDNA-mutato. C) le dimensioni del cuore normale (7 g di peso) di un 10-mese-vecchia pollo controllo. D) istologia normale di un cuore di pollo controllo. (Modificato da Tropic PLoS NeglectedMalattie al ^3).

Figura 6. Patologia Comparata in kDNA mutato pollo e nell'uomo la malattia di Chagas. A) grave miocardite e di destinazione lisi delle cellule cardiache nel pollo kDNA-mutato. B) miocardite grave e lisi delle cellule bersaglio da parte dei linfociti del sistema immunitario in un caso di malattia cardiaca di Chagas. C) Il rigetto delle cellule del cuore da parte dei linfociti del sistema immunitario del pollo kDNA-mutato. D) Il rigetto delle cellule del cuore da parte dei linfociti del sistema immunitario umano nella malattia di Chagas. Macchiato da Hematoxilin e eosina. (Modificato da Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro ^14).

Discussion

In contrasto mammiferi sensibili alla vita lunga T. infezioni cruzi, polli sono refrattari a T. cruzi infezione. Il principale vantaggio del sistema modello pollo è l'eliminazione del precoce dell'infezione nello sviluppo del sistema immunitario embrionale. Pertanto, il DNA parassita solo rimane all'interno del corpo pollo integrato su più loci.

Uso della quantità ottimale di virulento T. cruzi tripomastigoti per inoculare uovo fertile è il passo fondamentale verso l'ottenimento di integrazione del minicircles kDNA nel genoma dell'embrione di pollo. Il tasso di schiusa in diretta pulcini dalle uova inoculate con 100 tripomastigoti è quattro volte superiore a quello ottenuto con 500 parassiti. Si deve prestare attenzione per inoculare la sospensione parassiti in 10 microlitri di terreno di coltura nella camera d'aria dell'uovo. Non ci dovrebbero essere perdite di bianco d'uovo. In condizioni ottimali, l'infezione parassita intracellulare avviene wisottile poche ore dopo l'incubazione e la moltiplicazione dei parassiti all'interno dei proventi cellule ospiti per una settimana, dopo l'infezione viene eliminata l'immunità innata. L'integrazione kDNA richiede una infezione vivo, e l'inoculazione di minicircles nudi in uova di pollo primi embrioni non si traduca in integrazione. Le kDNA positivi embrioni e controlli devono essere alloggiati in condizioni controllate a 37,5 ° C e 65% di umidità. I pulcini sono tenuti in gabbie per due settimane a 33 ° C temperatura ambiente. Successivamente i polli sono tenuti in gabbie sospese su graticci navate separate da 1,5 metri di larghezza in una stanza a 22 ° C con aria filtrata e pressione positiva in esaurimento costante per garantire condizioni di benessere degli animali. Gli adulti sono alimentati pollo-chow e bere acqua corrente potabile per ottenere piena crescita e la maturità, le uova a cinque mesi di età. Manutenzione delle procedure igieniche sono essenziali per la riproducibilità dei risultati quando si lavora con T. cruzi inoculatoin uova di pollo fertili.

Nel sistema modello di pollo al T. infezioni cruzi sono sradicate dopo lo sviluppo del sistema immunitario nel primo periodo di crescita dell'embrione. Inoltre ad essere privo di infezioni, i pulcini che si schiudono da T. cruzi inoculato le uova, in mancanza di anticorpi specifici, sono tolleranti agli antigeni del parassita. Il rigetto delle cellule del cuore di destinazione da parte dei linfociti citotossici (unità di rifiuto minima, figura 3) si vede nei polli kDNA-mutati che mostrano modifiche genotipo e dal cedimento di sorveglianza immunologica ^3. Le genotipicamente modificate cellule T presenti rifiuto accelerata dei tessuti sé nel corpo. Il sito della lesione principale è il cuore, che è una caratteristica della malattia di Chagas. Il passaggio da uno fisiologico (sorveglianza) ad uno stato fisiopatologico si vede nella kDNA-mutato pollo mostra clonale proliferazione dei linfociti citotossici ^3.

Til suo modello di sistema transkingdom mostra un parassita indotta, geneticamente-driven malattia autoimmune (Figura 6), derivanti da modifiche del genoma della T. cruzi kDNA minicircle integrazioni. Queste modifiche non si vedono in pulcini nati da uova Lb-inoculate.

Questo fenomeno suggerisce che il trattamento sperimentale della cardiomiopatia infiammatoria autoimmune in kDNA mutato polli possono richiedere la soppressione farmaco di midollo osseo progenitrici delle cellule T specifiche per fenotipo con infiltrazione del miocardio, istocompatibili e il trapianto di midollo osseo sano per prevenire il rigetto di auto-tessuto.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA Polymerase Recombinant	Invitrogen	11615-010
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-030
Random Primers DNA Labeling System	Invitrogen	18187-013
EcoRI	Invitrogen	15202-021
MboI	Invitrogen	15248-016
dNTP Set, 100mM Solutions	GE Healthcare	28-4065-51
Amersham Hybond - N+ -- Cat n.	GE Healthcare	RPN303B
PlasmidPrep Mini Spin kit	GE Healthcare	28-9042-70
NsiI	Sigma-Aldrich	R5884 1KU
DNA, Sodium Salt Fish Sperm	AMRESCO	0644-10G
Mouse anti-chicken Bu-1b	SouthernBiotech	8370-02
Mouse anti-chicken CD45	SouthernBiotech	8270-08
Mouse anti-chicken TCRγδ	SouthernBiotech	8230-08
Mouse anti-chicken CD8α	SouthernBiotech	9220-02
Mouse anti-chicken monocyte/macrophage	SouthernBiotech	8420-02
MyCycle Termocycler	Bio-Rad	580BR 5501