Summary
Den inokulering av
Abstract
De Trypanosoma cruzi akutte infeksjoner ervervet i barndommen synes asymptomatiske, men omtrent en tredjedel av de kronisk infiserte saker viser Chagas sykdom inntil tre tiår eller senere. Autoimmunitet og parasitt utholdenhet konkurrerer teorier for å forklare patogenesen av Chagas en sykdom, to. Å skille roller parasitt utholdenhet og autoimmunitet i Chagas sykdom inokulere vi T. cruzi i luftkammer av befruktede egg. Den modne kylling Immunsystemet er et stramt biologisk barriere mot T. cruzi og infeksjonen er utryddet ved utvikling av sitt immunsystem ved utgangen av første uke av vekst tre. Ungene er parasitt-fri ved klekking, men de beholder integrert parasitt mitokondrie kinetoplast DNA (kDNA) minicircle innenfor sitt genom som er overført til avkom sin. Dokumentasjon av kDNA minicircle integrering i kylling genomet ble innhentet av en Targeted prime TAIL-PCR, Southern hybridizations, kloning og sekvensering 3, 4. Den kDNA minicircle integrasjoner ruptur åpne leserammer for transkripsjon og immunforsvaret faktorer, fosfatase (GTPase), adenylat cyclase og phosphorylases (PKC, NF-Kappa B aktivator, PI-3K) forbundet med cellefysiologi, vekst, og differensiering 3, 5 - 7, og andre genet funksjoner. Alvorlig myokarditt grunn avvisning av geografiske hjertet fibrer av effektbokser cytotoksiske lymfocytter er sett i kDNA muterte kyllinger, viser en inflammatorisk kardiomyopati lik den som ses i menneskelig Chagas sykdom. Spesielt, hjertesvikt og skjelettmuskelbetennelse muskelsvakhet er tilstede hos voksne kyllinger med kDNA ruptur av dystrophin genet i kromosomet 1 8. Lignende genotipic endringer er assosiert med vev ødeleggelse utført av effektorer CD45 + og CD8γδ + og CD8α lymfocytter. Derfor er denne protozo infeksjon kan indusere genetisk drevet autoimmun sykdom.
Protocol
1. Vekst av parasitter
- Grow trypomastigote former for T. cruzi Berenice og β-galaktosidase-uttrykke Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 i murine muskelcelle (L6) dyrket i Dulbecco minimal viktig medium med 10% FSB, 100 IE / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin, og 250 nM L-Glutamin (pH 7,2), 5% CO 2 ved 37 ° C. De frittsvømmende trypomastigotes i supernatanten medium ble brukt til å vaksinere kylling egg.
- Grow Leishmania braziliensis (LB) LTB300 lager vokst i DMEM med 20% FBS. LB promastigote form i den eksponentielle vekstfasen ble brukt til å vaksinere egg 9.
2. Parasitten Inokulasjon i Befruktede kylling egg
- Inokuler en suspensjon av 100 T. cruzi trypomastigotes i 10 mL av kultur medium gjennom en 2 mm diameter hull i egget skallet på toppen av luftkammer av scenenX fruktbare egg. Invasjonen og replikering av de virulente parasitter inn i embryoet cellene er vist i Video S1. Kontrollgruppene er som følger: a) kontrollere kyllinger, b) mock kontroll egg mottak 10 mL av kultur medium; c) Stage X fruktbare egg inokulert med en suspensjon av 100 LB promastigotes i 10 mL av kultur medium T.. cruzi og Lb tilhører kinetoplastid familien. Henholdsvis disse protozoer vokse fritt i cytoplasma eller i parasitophorous vakuole av vertsceller 10.
- Tett hull med tape.
- Inkuber T. cruzi-infiserte egg og mock og uinfisert kontrollprøver ved 37,5 ° C og 65% luftfuktighet i 21 dager.
- Hold ungene som klekkes i inkubator for 24 timer og deretter ved 32 ° C i tre uker.
3. Oppnå prøver for DNA-ekstraksjon
- Perifere mononukleære celler ble hentet fra kyllinger: a)klekket fra T. cruzi inokulerte egg, b) kontroller, c) spotter som fikk 10 mL av kultur medium; d) klekket fra LB inokulerte egg; Hvite blodlegemer fra kyllinger blir behandlet for DNA-ekstraksjon ifølge med en standard protokoll 11.
- Utdrag DNA også fra sæd samlet inn fra haner, og fra unfertile oocytter (<5 mm) samlet fra høner klekket fra egg inokulert med T. cruzi, og fra høner klekket fra kontroll egg 3, 4.
- Utdrag kDNA fra T. cruzi epimastigote danner og, også, fra LB promastigotes, som beskrevet andre steder 9.
4. Primere og prober Brukte
De primere som brukes til PCR presiseringer og de termiske betingelsene er vist i tabell 1.
Sondene brukes i blot hybridizations var:
- Villtype minicircle (~ 1,4 kb) sekvenser Purisert fra T. cruzi epimastigote former;
- Minicircle fragmenter (362 bp) fremstilt ved NSi jeg fordøyer av vill-type kDNA;
- Nuclear DNA (nDNA) repeterende sekvens (188 bp) fås ved forsterkning av parasitten DNA med Tcz1 / 2 primere. De prober ble renset fra 1% agarose gels tre.
- Villtype minicircle (~ 0.820 kb) sekvenser fra LB promastigotes.
5. PCR Analyser
- Kjør standard PCR prosedyre med genomisk DNAS fra infiserte kyllinger og friske kontroller og spotte hjelp T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 og kDNA s35/s36 13 primere. Også kjøre PCR med genomisk DNAS fra kyllinger klekket fra LB infisert-egg ved hjelp av protozo spesifikke Lb3 og Lb5 primere (Tabell 1).
- Gjør reaksjon bland med 100 ng mal DNA, 0,4 mM for hvert par av primere, 2 U Taq DNA polymerase, 0,2 mm dNTP, og 1,5 mM MgCl
- Still thermocycler program for 95 ° C i 5 min, 30 sykluser på 30 sek på 95 ° C/30 sek ved 68 ° C / 1 min ved 72 ° C med 5 min endelige forlengelse før kjøling.
- Analyser forsterkningsbehov produktene i 1,3% agarose gel, som er overført til en positivt ladet nylon membran (GE Life Sciences) med alkaliske metode for hybridisering med spesifikke prober merket med [α-32 P] dATP bruker Random Primer Labeling Kit (Invitrogen , Carlsbad, California).
6. Genomisk Southern blotter
- Bruk MBO I og / eller med Eco RI (Invitrogen) enzymer som gjør enkle kutt i minicircles integrert i DNA-prøver av kroppens vev.
- Digest DNA fra friske kontroll kyllinger og fra kyllinger klekket fra egg inokulert med virulente T. cruzi danner.
- Subject den fordøyer av DNA fra T. cruzi ogfra kylling testprøvene til elektroforese i 0,8% agarose gel ved 50 V over natten ved 4 ° C.
- Overfør atskilt DNA band til positivt ladet nylon membran.
- Hybridize DNA band med radio merket kDNA sonde.
- Vask membranen to ganger for 15 minutter ved 65 ° C med 2X SSC og 0,1% SDS, to ganger for 15 minutter ved 65 ° C hver med 0,2 x SSC og 0,1% SDS, og autoradiograph for variable perioder.
7. Målrettet Prime TAIL-PCR
- Skaff forsterkning av kDNA minicircle integrert i kylling genomet av en modifisert TAIL-PCR teknikk, som kombinerer kDNA primere med spesifikke primer setter to i tre walk-in sykluser nestet PCR, som vist i Figur 1.
- Primær syklus: Hver reaksjon inneholder 200 ng mal DNA, 2,5 mM MgCl 2, og 0,4 mM av kDNA primere (S34 eller S67), 0,2 mm dNTPs, 2,5 U Taq Platinum (Invitrogen, Carlsbad, CA). Bruk kDNA primere i kombinasjon med 0,04 mM av GG primere (Gg1 til Gg6, Tabell 1), separat. Still temperaturer 57,9 til 60,1 ° C for kDNA grunning og 59,9 til 65,6 ° C for CR-1 primer. Merk at disse temperaturene er høyere enn de (~ 45 ° C) kreves for vilkårlige degenererte primere som brukes i halen-PCR 10. Bruk temperatur og sykluser (MyCycle Thermocycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, California) er beskrevet i en tidligere artikkel 3.
- Sekundær syklus: Tynn PCR-produkter fra primær syklus 01:40 (v / v) i vann. kDNA primere S35 og S35 antisens erstattet de tidligere, sammen med de samme GG primere.
- Tertiær syklus: Tynn PCR produktene fra videregående syklus 01:10 (v / v) i vann og kombinere GG primere med S67 antisens eller S36, separat.
- Klone PCR høyere syklus produkter: Clone direkte i pGEM T enkel vektor (Promega, Madison, WI)produkter av siste forsterkning som hybridize med kDNA sonde.
- Velg kloner av hybridisering med kDNA sonde og sekvens.
- Validere tpTAIL-PCR i en blanding av 300 pg av kDNA fra T. cruzi med 200 ng av DNA fra kontroll fugler aldri utsettes for kDNA. Temperatur og forsterkning sykluser er den samme som brukes for testen fuglenes DNA.
8. Chagas sykdom Clinic Manifestasjon
- Overvåk vekst og utvikling av kyllinger klekket fra T. cruzi smittet egg og friske kontroller klekket fra ikke-infiserte egg daglig for dødelighet og ukentlig for sykdom manifestasjoner.
- Oppdage kliniske abnormiteter i disse kyllingene (figur 2) og gjøre elektrokardiograf (EKG) opptak for å evaluere de elektriske akser, hjerte priser og arytmier 3.
- Subject kDNA-mutert og kontrollerer kyllinger månedlige til EKG-opptak av augmented ventrikkel unipolar fører aVF (venstre ben), AVL (venstre arm), og AVR (høyre arm), og å vurdere avvik i gjennomsnittlig elektrisk akse til venstre, som tyder på hjertet utvidelse tre.
9. Patologi og immunkjemiske Analyser
- Record hjerte og kroppsvekt indekser etter naturlige dødsfall av kDNA muterte kyllinger (figur 3). Skaff indekser også for kontroll kyllinger av samme alder og kjønn.
- Ta deler fra hjertet, spiserøret, tarmene, skjelettmuskulatur, lunger, lever og nyrer.
- Fastsette vev i bufret 10% formalin (pH 7,4), legge i parafin og kuttet til 4 mikrometer tykke seksjoner for Hematoxylin-eosin (HE) flekker og histologiske analyser (figur 3).
- Harvests og halvere vev fra befruktede egg klekket fra egg inokulert med parasitter som uttrykker β-galaktosidase, og underlagt X-Gal-beis. 9
- Fest den andre halvparten av embryoet vev i en0% formalin, pH 7,4 og fortsett som i trinn 9.3.
- Skjær 4μm tynn parafin innebygd vev delen og montere på glass-slide for mikroskopisk undersøkelse.
- Inkuber seksjoner som viser X-Gal-fargede blå celler med menneskelig chagasic antiserum (1:1024 fortynning) mot anti-T. cruzi antigen.
- Vask seksjoner blunk med PBS, 7,4 pH, 5 min hver.
- Flekk blå celler i embryoet vev av andre inkubasjon med en fluorescein-konjugert kanin anti-human IgG.
- Vask seksjoner med PBS (trinn 8), mount med dekkglass og observere de blå cellene lys-Up Green ved undersøkelse under UV-lys ved 502 nm bølgelengde, 200x forstørrelse, for colocalizing T. cruzi i embryo celler.
10. Fenotype immunsystem celler i hjerte Lesjoner
- Fenotype immun effektbokser celler i vev deler av hjerte fra kDNA-positive og fra kontroll kDNA-negative kyllinger.
- Plasser lysbildene medvev seksjon innebygd i parafin ved 65 ° C i 30 min å smelte voks tidligere til innlevering i fire vasker i 100% til 70% xylen og deretter i absolutt etanol PBS i 5 min hver.
- Skyll lysbildene i destillert vann, luft tørr, og behandle med spesifikke monoklonale antistoffer (fluorescein-eller R-phycoerythrin-konjugerte monoklonale antistoffer) fremstilt fra SouthernBiotech, Birmingham, AL.
- Bruk musen anti-kylling Bu-1 (Bu-1 a og BU-1 b alleler, Mr 70-75 kDa) Mab AV20 å gjenkjenne monomorf determinant på B-celle antigener av innavlede kyllinger.
- Bruk musen anti-kylling CD45, Ig isotype IgM1 κ spesifikk for kylling thymus avstamning celler (Mr 190-215-kDa variant).
- Bruk musen anti-kylling TCRγδ + (Mr 90-kDa heterodimer) Mab spesifikk for thymus avhengige CD8α + T celler.
- Bruk musen anti-kylling Mab CD-8 som er spesifikk for kylling α-kjeden (Mr 34 kDa) gjenkjenne the CD8 celler i thymocytter, milt, hjerte og andre vev.
- Bruk musen anti-kylling KuL01 å utelukkende gjenkjenne monocytter / makrofager i phagocyte systemet.
- Vask sliden tre ganger med 0,1 M PBS, 7,4 pH, 5 min hver etter inkubasjon med spesifikk anti-fenotype antistoff for 90 min i en fuktig kammer.
- Monter lysbildet med buffered glyserin for eksamen under et fluorescerende lys mikroskop med utslipp filter av bølgelengde 567 og 502 nm, henholdsvis å oppdage røde og grønne fluorescens-merkede celler (figur 4).
11. Data Analyser
- Bruk kylling genomet database ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) for BLASTn sekvens analyser.
- Bruk ClustalW justeringer for å avgjøre e-verdi score.
- Ansett GIRI gjenta maskering algoritmen Sensor ( http://girinst.org/censor/index.php ) for lokalisering av ulike klasser av gjentakelser i chimeric sekvenser.
- Ansett den Kinetoplastid Innsetting og sletting Sequence Search Tool (KISS) for å identifisere potensielle gRNAs i kDNA sekvenser, med hjelp av WU-Blastn-modified-matrise tre.
- Bruk T. cruzi sekvenser http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-~~HEAD=NNS 2164-8-133-s1.fas å søke inn gRNAs i kDNA-vert DNA chimeras. 11.6) Bruk Student t og Kolmorov-Smirnov tester, henholdsvis, for å oppdage signifikante forskjeller mellom avvik i elektriske akser og mellom hjerte / kroppsvekt indekser innhentet i de eksperimentelle og kontroll grupper, og å oppdage dødelighet forholdstall signifikante forskjeller mellom grupper med kyllinger klekket fra T. cruzi inoculated egg og fra kontroller.
12. Representative Resultater
Inokuleringen av 100 virulente T. cruzi trypomastigotes inn i luftkammer av fruktbare kylling egg ikke redusere betydelig prosenter av kyllingene klekkes i live. Omtrent 60% klekker friske kyllinger og 40% kan gjennomgå embryo LNG eller embryo død ved klekking. De overlevende kyllinger beholde kDNA minicircle sekvensen integrert i genomet. Imidlertid forventes det at noen unger vil dø med cardiomegaly og svikt i ukene etter klekking. De resterende ungene skal vokse til å ytre friske voksne. I alle faser av livet DNA ekstrahert fra sine mononukleære blodceller vil gi PCR amplifikasjon av kDNA, men ikke nDNA. Den målrettede-prime 3 TAIL-PCR, 4 produkter som er klonet og sekvens viser kDNA minicircles integrert hovedsakelig i koding regioner av macrochromosomes 1 til 5. Kyllingene som viser flere kDNA integrations inn gener som koder for cellevekst og differensiering, immunforsvaret regulering faktorer, og DNA-reparasjon er kandidater til gjennomgår avvisning av selvtillit målvevet (figur 3). For eksempel er det kylling viser kDNA mutasjon med ruptur av dystrophin genet (figur 5), koding et protein som binder cytoskjelettet til cellemembranen, en kandidat til å utvikle autoimmun inflammatorisk kardiomyopati og svikt.
Disse genomisk modifikasjoner er ikke sett i kyllinger klekket fra LB infiserte egg. Det er forskjeller mellom T. cruzi og Lb kDNA minicircles; The T. cruzi k DNA minicircle gjennomsnitt 1,4 kb struktur med fire variable region (VR) ispedd med bevarte regioner (CR) hver presentere CSB1 og CSB2 og CSB3 regioner, der CA-rike bøyd DNA regnes spesifikke områder for initiering av replikasjon, transkripsjon, rekombinasjon, og for lateral DNA overføring
| Primer | Target DNA | Sequence | Tm * |
| S 34 | T. cruzi kDNA | 5 'ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3' | 57,9 |
| S 67 | T.cruzi kDNA | 5 'GGT TTT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3' | 60,1 |
| S 35 | T. cruzi kDNA | 5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3' | 59,4 |
| S 36 | T. cruzi kDNA | 5 'GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3' | 57,9 |
| Lb3 | Lb kDNA | 5 'GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3' | 55,9 |
| Lb5 | Lb kDNA | 5 'CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3' | 61,4 |
| Gg 1 | Gallus gallus | 5 'AGC TGA TCC TAA AGG CAG AGC 3' | 60,1 |
| Gg2 | G. Gallus | 5 'CTG AGC CTC TGCTTT GAA A 3 ' | 56,8 |
| Gg3 | G. Gallus | 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3' | 60,1 |
| Gg4 | G. Gallus | 3 'GCT CTG CCT TTA GGA TCA GCT 5' | 64,2 |
| Gg5 | G. Gallus | 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' | 62,3 |
| Gg6 | G. Gallus | 3 'CTG TTA GCA TGA GGC TTC ACA en 5' | 60,4 |
Tabell 1. Primtall brukt i PCR presiseringer. * Tm = gjennomsnittlig annealing temperatur ° C.
Figur 1. TP TAIL-PCR strategien brukes til å oppdage Trypanosoma cruzi kDNA integrering i Gallus gallus genomet. A) En chimeric sekvens med et fragment av kDNA minicircle bevarte (mørk blå) og variable (lys blå) regioner som er integrert i locus NW_001471687.1 på kromosom 4 (AY237306) av kylling 10 genomet (grønn) ble brukt for å få verten spesifikke primer sett (Gg1 til Gg6). B) TP TAIL-PCR presiseringer ble igangsatt (primær syklus) med avspenning av minicircle-spesifikke S34 eller S67 primere i kombinasjon med kylling-spesifikke Gg1 til Gg6 primere. Utvannet produkter gitt mal for den sekundære syklus med S35 (forstand / antisens) grunning, og kombinasjonene av GG primere. I tertiær syklus en utvanning av de sekundære produktene ble utsatt for forsterkning med kDNA S36 eller S67 antisens primere i kombinasjon med Gg primers. C) Disse forsterkningsbehov produktene ble separert i 1% agarose gels og overført til nylon membran, hybridisert med den spesifikke kDNA sonden. Prøver som viser positive signal ble brukt for kloning å bestemme det punktet av integrering. De kombinasjoner av kDNA og målrettet Gg1 til Gg6 vises på toppen av gel. De sekvensielle PCR reaksjoner forsterket målet kDNA-vert DNA-sekvenser med kDNA minicircles (blå) og aviær sekvens (grønn). (Gjengitt fra PLoS forsømte tropiske sykdommer 3).
Figur 2. Kliniske manifestasjoner på nedsatt hjertefunksjon i en 9 måneder gammel kylling genetisk modifisert av integreringen av mitokondrie kDNA minicircle fra T. cruzi. De fattige blod oksygenering av mitokondrie kDNA muterte kylling viser en lilla kam kontraster med den lyse røde kammen av kontrollen ni måneder gamle chicken fri fra skader på hjertet. (Modifisert fra PLoS forsømte tropiske sykdommer 3).
Figur 3. Gross og mikroskopisk patologi i Gallus gallus med kDNA mutasjoner. A) cardiomegaly i en 9 måneder gammel høne som døde av hjertesvikt. B) Kontroll hjerte fra en noninfected 9 måneder gammel høne. C) Avvisning av geografiske hjertet celler ved cytotoksiske lymfocytter: En minimal avvisning enhet med lyses av målcellene av immune lymfocytter er avbildet (sirkel). D) Kontroll hjerte histologi (Modifisert fra PLoS forsømte tropiske sykdommer 3).
Figur 4. Immunocytochemical analyser av immunsystemet celler infiltrere hjertet av kDNA-muterte kylling vist i figur 3. A) CD45 + lymfocytter identifisert (piler) i hjertet leutslipp ved en phycoerythrin-merket spesifikt monoklonalt antistoff. B) CD8 + γδ immun lymfocytter (piler) er involvert i alvorlig ødeleggelse av hjertet. C) Rikelig CD8α + T celler presentere i alvorlige lesjoner med hjerteproblemer celle lyses. Skjærene viser fravær av immunsystemet celler i kontroll infisert kylling hjerte (Modifisert fra PLoS forsømte tropiske sykdommer 3).
Figur 5. Chagas-aktig dilatert inflammatorisk kardiomyopati i en F2 avkom med kDNA integrering i dystrophin genet. A) dilatert hjerte i en 10-måneder gamle kylling opptar det meste av brysthula (hjerte vekt = 16 g). B) Mørke runde mononukleære celler infiltrerer og ødelegger hjertemuskelen av kDNA-muterte høne. C) Normal hjerte størrelse (vekt 7 g) i en 10-måneder gamle kontroll kylling. D) Normal histologi av en kontroll kylling hjerte. (Modifisert fra PLoS forsømte Tropical Sykdommer 3).
Figur 6. Komparativ patologi i kDNA-mutert kylling og i menneskelig Chagas sykdom. A) Alvorlig myokarditt og geografiske hjertet celle lyses i kDNA-mutert kylling. B) Alvorlig myokarditt og målcellen lyses av immune lymfocytter i en sak av Chagas hjertesykdom. C) Avvisning av hjertet celler av immune lymfocytter i kDNA-mutert kylling. D) Avvisning av hjertet celler av immune lymfocytter i menneskelig Chagas sykdom. Farget av Hematoxilin og eosin. (Modifisert fra Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 14).
Discussion
I motsetning til pattedyr er mottakelige for livslang T. cruzi infeksjoner, kyllingene er refraktær til T. cruzi-infeksjon. Den store fordelen med kylling modellen systemet er eliminering av infeksjonen tidlig i utviklingen av embryonale immunsystemet. Dermed er den eneste parasitten DNA gjenværende i kylling kroppen integrert på flere loci.
Bruk av optimal mengde virulente T. cruzi trypomastigotes å vaksinere fruktbare egg er den kritiske skritt mot å oppnå integrering av kDNA minicircles inn kyllingen embryo genomet. Satsen for levende kyllinger klekkes fra egg inokulert med 100 trypomastigotes er fire ganger høyere enn den som oppnås med 500 parasitter. Forsiktighet bør utvises for å vaksinere den parasitter suspensjon i 10 mL av kultur medium inn i egget luftkammer. Det bør ikke være lekkasje av eggehvite. Under optimale forhold, tar den intracellulære parasittinfeksjon sted witynn noen timer etter inkubering og parasitt multiplikasjon inne i vertsceller utbyttet for en uke, deretter infeksjonen er eliminert ved medfødt immunitet. Den kDNA integrering krever en levende infeksjon, og inokulering av nakne minicircles inn tidlig embryo kylling egg ikke resulterer i integrering. De kDNA-positive embryoer og kontroller bør plassert under kontrollerte forhold ved 37,5 ° C og 65% luftfuktighet. Kyllingene holdes i bur for to uker ved 33 ° C romtemperatur. Deretter kyllingene holdes i bur på hengende racks atskilt med 1,5 meter bredde midtganger i et rom på 22 ° C med filtrert luft og overtrykk under konstant utmattelse å sikre dyrevelferd forhold. De voksne blir matet kylling-chow og drikke drikkevann rennende vann for å oppnå full vekst og modenhet, legger egg på fem måneders alder. Vedlikehold av hygieniske rutiner er avgjørende for reproduserbarhet av resultater når man jobber med T. cruzi inokulerteinn i fruktbare kylling egg.
I kyllingen modellen systemet T. cruzi infeksjoner blir utryddet etter utviklingen av immunsystemet i den første perioden av embryo vekst. I tillegg til å være smitte-fri, ungene som klekkes fra T. cruzi inokulert egg, i mangel av spesifikke antistoffer, er tolerante mot parasitten antigener. Avvisningen av målet hjertet celler ved cytotoksiske lymfocytter (minimal avvisning enhet, figur 3) er sett i kDNA-muterte kyllinger viser genotype modifikasjoner og nedbryting av immunologiske overvåkingen tre. De genotypically modifiserte T-celler presentere akselerert avvisning av selvtillit vev i kroppen. Den viktigste lesjon nettstedet er hjertet, som er et kjennetegn på Chagas sykdom. Passasjen fra en fysiologisk (overvåking) til en physiopathologic tilstand er sett i kDNA-muterte kylling viser clonally spredning av cytotoksiske lymfocytter 3.
Thans transkingdom modellsystem viser en parasitt-indusert, genetisk-drevet autoimmun sykdom (figur 6), stammer fra genomet modifikasjoner av T. cruzi kDNA minicircle integrasjoner. Disse endringene er ikke sett i kyllinger klekket fra Lb-inokulerte egg.
Dette fenomenet tyder på at eksperimentell behandling av inflammatorisk autoimmune kardiomyopati i kDNA-muterte kyllinger kan kreve narkotika undertrykkelse av beinmargen stamfar spesifikk T-celle fenotype infiltrere hjertemuskelen, og transplantasjon av histocompatible sunn benmarg for å hindre avvisning av selv-vev.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi står i gjeld til Nancy R. Sturm, Avdeling for immunologi, mikrobiologi og molekylærbiologi, David Geffen School of Medicine, University of California i Los Angeles, for kritisk lesing av manuskriptet. Nasjonalt råd for forskningsdrevet CNPq, og Fondet for forskningsavgift Development-FAPDF, Brasil, støttet studien. Vi takker teknisk hjelp av Alessandro O. Souza, Maria C. Guimaro, Ciro Cordeiro, Ana de Cassia Rosa, Roseneide Alves, og Rafael Andrade, fra University of Brasilia, Brasil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase Recombinant | Invitrogen | 11615-010 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-030 | |
| Random Primers DNA Labeling System | Invitrogen | 18187-013 | |
| EcoRI | Invitrogen | 15202-021 | |
| MboI | Invitrogen | 15248-016 | |
| dNTP Set, 100mM Solutions | GE Healthcare | 28-4065-51 | |
| Amersham Hybond - N+ -- Cat n. | GE Healthcare | RPN303B | |
| PlasmidPrep Mini Spin kit | GE Healthcare | 28-9042-70 | |
| NsiI | Sigma-Aldrich | R5884 1KU | |
| DNA, Sodium Salt Fish Sperm | AMRESCO | 0644-10G | |
| Mouse anti-chicken Bu-1b | SouthernBiotech | 8370-02 | |
| Mouse anti-chicken CD45 | SouthernBiotech | 8270-08 | |
| Mouse anti-chicken TCRγδ | SouthernBiotech | 8230-08 | |
| Mouse anti-chicken CD8α | SouthernBiotech | 9220-02 | |
| Mouse anti-chicken monocyte/macrophage | SouthernBiotech | 8420-02 | |
| MyCycle Termocycler | Bio-Rad | 580BR 5501 |
References
- Teixeira, A. R. Pathogenesis of chagas' disease: parasite persistence and autoimmunity. CMR. 24, 592-630 (2011).
- Teixeira, A. R. Chagas disease. Postg. Med. J. 82, 788-798 (2006).
- Teixeira, A. R. Trypanosoma cruzi in the chicken model: Chagas-like heart disease in the absence of parasitism. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1000 (2011).
- Hecht, M. M. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 5, e9181 (2010).
- Xing, Z. Roles of the ERK MAPK in the regulation of proinflammatory and apoptotic responses in chicken macrophages infected with H9N2 avian influenza virus. J. Gen. Virol. 91, 343-351 (2010).
- Kim, H. B. NIK and IKKbeta interdependence in NF-kappaB signalling--flux analysis of regulation through metabolites. Biosystems. 99, 140-149 (2010).
- Karakhanova, S. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets. Eur. J. Immunol. 40, 254-266 (2010).
- Finsterer, J. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
- Nitz, N. Heritable integration of kDNA minicircle sequences from Trypanosoma cruzi into the avian genome: insights into human Chagas disease. Cell. 118, 175-186 (2004).
- Simpson, L. Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates. Int. Rev. Cytol. 99, 1-19 (1986).
- Bonney, K. M. Heat-killed Trypanosoma cruzi induces acute cardiac damage and polyantigenic autoimmunity. PLoS One. 6, e14571 (2011).
- Moser, D. R. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27, 1477-1482 (1989).
- Sturm, N. R. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Mol. Biochem. Parasitol. 33, 205-214 (1989).
- Teixeira, A. R. Evolution and pathology in chagas disease--a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101, 463-491 (2006).
- Yurchenko, V. Y. Structure of Leishmania minicircle kinetoplast DNA classes. J. Clin. Microbiol. 37, 1656-1657 (1999).
- Simpson, L. The genomic organization of guide RNA genes in kinetoplastid protozoa: several conundrums and their solutions. Mol. Biochem. Parasitol. 86, 133-141 (1997).
- Thomas, S. A non-universal transcription factor? The Leishmania tarentolae TATA box-binding protein LtTBP associates with a subset of promoters. Int J. Parasitol. 36, 1217-1226 (2006).
