Summary
Förödelsen av spannmål för utsäde-infekterar svampen har fått många forskningsinsatser för att bättre förstå växt-patogen interaktioner. Att studera frö-svamp interaktioner i en laboratoriemiljö, har vi utvecklat en robust metod för kvantifiering av svamp reproduktion, biomassa och kontaminering med mykotoxiner användningen av kernel bioanalyser.
Abstract
Den ruttnande av korn med utsäde infekterar svampar utgör en av de största ekonomiska utmaningarna för global spannmålsproduktion, för att inte tala om allvarliga risker för människors och djurs hälsa. Bland spannmålsproduktion, är majs utan tvekan den mest drabbade grödan på grund av patogen-inducerade förluster i spannmål integritet och mykotoxiner frön förorening. De två vanligaste och problematiska mykotoxiner för majs odlare och mat och processorer foder är aflatoxin och fumonisin, som framställts av Aspergillus flavus och Fusarium verticillioides, respektive.
Nyligen genomförda studier inom molekylär växt-patogen interaktioner har visat lovande resultat i att förstå specifika mekanismer som är förknippade med växter svar svampinfektion och kontaminering med mykotoxiner 1,2,3,4,5,6. Eftersom många laboratorier använder kärnan analyser för att studera växt-patogen interaktioner, finns det ett behov av en standardiserad metod för kvantifiering av olika biologiska parametrar, såresultat från olika laboratorier kan cross-tolkas. För en robust och reproducerbart sätt för kvantitativa analyser av frön, har vi utvecklat i-lab kärnan analyser och efterföljande metoder för att kvantifiera svamptillväxt, biomassa och kontaminering med mykotoxiner. Fyra steriliserade majs kärnor ympas i glasampuller med en svampsuspension (10 6) och inkuberades under en förutbestämd period. Provflaskor selekteras sedan för räkning av konidier med hemocytometer, ergosterol-baserad biomassa analys genom high performance vätskekromatografi (HPLC), aflatoxin kvantifiering med användning av en fluorometer AflaTest metod, och fumonisin kvantifiering genom HPLC.
Protocol
1. Majs Kärna Bioanalys
- Två veckor före, odling av svamppatogener på potatisdextrosagar (PDA) vid 28 ° C.
- Välj kärnor med liknande storlek och form, helst platta så att de låg i nivå med botten av bioanalysresultaten flaskor, och placera den i 50 ml Falcon rör. Utvalda kärnor skall ha framställts samtidigt i samma miljö för att säkerställa att samma frö ålder och metabolit sammansättning.
- Ytan sterilisera kärnor genom skakning rören vid rumstemperatur under 5 minuter med 70% etanol, 1 minut med sterilt vatten, och 10 minuter med 6% natrium-hypoklorit. Sköljning tre gånger, under 5 minuter varje gång, med sterilt vatten under fortsatt skakning. Pat kärnor torra på autoklaverade handdukar.
- För att underlätta infektion av Aspergillus flavus skapa ett litet sår på embryot vid sida med en 18 G nål för djup av 0,5 cm. I vår erfarenhet en större sår behövs för Fusarium verticillioides infektion. Therefore, använda ett rakblad för att skära in i embryo-sidan på ett djup av 0,5 mm.
- Bered inokulatsuspension genom skrapning odlade plattor i ca 5 ml autoklaverat 0,01% Tween-20 lösning för att frisätta sporer och avlägsna mycel genom tyngdkraften filtrering genom åtminstone 4 skikt av autoklaverat ostduk. Beräkna spore koncentration med hemocytometer och justera till 10 6 sporer / ml för A. flavus eller F. verticillioides. Vid användning av andra arter av patogen eller värd, är det viktigt att utvärdera koncentrationen av ymp för lämplig infektion.
- Skapa en fuktkammare i en plastbehållare (29,2 cm x 18,7 cm x 8,3 cm) fodrad med fem ark av hushållspapper och 100 ml sterilt vatten. Handelskammaren är inte vatten-eller lufttät och ytterligare vatten bör läggas under försöket för att hålla pappershanddukar fuktig.
- Placera fyra kärnor i en autoklav 20 ml glasskintillationsflaska och registrera deras massa. Inokulera 200 ^ sporsuspension,mössa, och vortexa att jämnt belägga kärnor med suspension. Lossa Caps att fritt få luft och placera i fuktkammare.
Obs: För frön eller svampar andra än de som beskrivs i dessa metoder kan mängden inokulum krävs vara annorlunda och bör härledas experimentellt.
- Inkubera kärnor under ett 12-h-light/12-h-dark fotoperiod vid 28 ° C under 7 dagar eller önskat fram.
2. Konidier Räkning
- Efter infektionen perioden, tillsätt 5 ml autoklaverat 0,01% Tween-20 till scintillationsflaskor innehåller infekterade kärnor och vortexa grundligt under 1 minut.
- Användning av en stor diameter pipettspets, omedelbart späds genom att överföra två separata 200 | il alikvoter av sporsuspensionen i 2,0 ml Eppendorf-rör innehållande 1,8 ml av 0,01% Tween-20 (eller utspädd efter behov beroende på infektion).
- Räkna varje 200 | il alikvot två gånger med en hemocytometer 4och jämföra nivåer av konidier mellan behandlingarna.
3. Aflatoxin Kvantifiering
- Tillsätt kärnor från 1 prov till 50 ml blandarskål med 20 ml 80% metanol och 0,05 g NaCl, locket och blandning vid hög hastighet under 1 min.
- Placera ett veckfilter över en ren uppsamlingskärl och häll extraktet till filter.
- Överför 10 ml av filtratet till ett rent kärl, tillsätt 20 ml destillerat H 2 O, och blanda väl.
- Filtret provet genom ett 1,5 | im glasmikrofiber-filter in i en ren bägare.
- Tillämpas 1 ml filtreras extraktet till Afla test kolonn och med användning av tryckluft, tvingar det filtrerade extraktet genom kolonnen med en hastighet av 1-2 droppar per sekund tills tömda.
- Tvätta kolonnen två gånger med 1 ml destillerat H2O och passera genom kolonnen vid 1-2 droppe / sekund tills luft kommer igenom.
- Eluera kolonnen med 1 ml av 100% HPLC-kvalitet metanol vid en 1-2 droppe / sekund hastighet uppsamlas i en glaskuvett.
- Tillsätt1 ml Afla Test Developer till eluat och blanda väl. Placera kyvetten i kalibrerade fluorometer och läsa vid 60 sek.
Obs: När du använder Aflatest FGIS protokollet, mätningen från fluorometern beräknas på en inledande 50 gram prov extraheras i 100 ml. Om du anser att utspädningen av provet med vatten som tillämpas den 1 ml till en kolumn representerar 0,166 gram prov. Så när du ändrar protokollet, måste du ta hänsyn till de skillnader i stickprovsstorlek och den ursprungliga extraktionslösningen. Till exempel är 2 gram av korn som extraheras i 20 ml 80% metanol. Det är 0,1 gram per ml. När 1 ml av detta prov blandades med 2 ml vatten, är den andel av provet i flytande nu 0,033 gram per ml. Om detta prov ger en fluorometer läsning av 100 ppb, den faktiska koncentrationen baserat på andelen av provet till 0,166, dvs ppb = (0,166 gram x 100 ppb) / 0,1 gram), eller 166 ppb. För alternativ aflatoxin kvantifieringkatjon metoder, se referens 7.
4. Fumonisin B1 (FB1) Analys
- När svampen odlas på majskornen, extrahera prover över natten med 10 ml acetonitril / vatten (50/50, volym / volym) vid rumstemperatur utan omröring. Därefter blanda extraktet (2 ml) med avjoniserat vatten (6 ml) och tillämpa denna blandning (8 ml) direkt till C-18-fastfasextraktion.
- Före laddning prov, förutsättning att C-18-fast fas-extraktionskolonn av sköljning med 2 ml acetonitril, följt av 2 ml vatten.
- Efter laddning av provet, tvättades kolonnen med 2 ml vatten följt av 2 ml acetonitril / vatten (15/85, volym / volym). Provet för HPLC-analys (innehållande FB1) elueras med 2 ml acetonitril / vatten (70/30, volym / volym).
- Derivatisera FB1 med o-ftalaldehyd (OPA) genom att överföra 0,1 ml av kolonn-eluatet till en flaska innehållande 0,1 ml boratbuffert (0,05 M borsyra acid/0.05 M natriumborat [50/50, volym / volym], pH 8,5) och 0,1 ml OPA (0,1 mg / ml i acetonitrile med 0,5% - merkaptoetanol).
- Stoppa reaktionen efter 10 min genom tillsats av 0,5 ml av acetonitrile/0.01 M borsyra (40/60, volym / volym).
- Analysera FB1 på ett Shimadzu HPLC LC-20AT system utrustat med en analytisk kolonn Zorbax ODS-kolonn (4,6 150 mm) och en variabel våglängd Shimatzu RF-10Axl fluorescensdetektor (excitation 335 nm / emission 440 nm).
- En linjär gradient användes (lösningsmedel A: acetonitrile/0.1 M natriumfosfat (40/60), pH 3,3; lösningsmedel B: acetonitril / 0,1 M natriumfosfat (60/40), pH 3,3) och gradientprogram är som följer: 100% A till 100% B i 10 min, 100% B under 5 minuter.
- Analysera FB1 standarder med HPLC, och topparea mätningar används för att generera standardkurvan. Därefter kvantifiera FB1 nivå i ett prov genom att jämföra toppareor med FB1 standardkurva.
5. Ergosterol Analys
- Kultur svampen på majs kärnor i 7-14 dagar.
- Efter inkubationsperioden, tillsätt 10 ml kloroform: metAnol (2:1, v / v) i varje injektionsflaska. När du har lagt, skaka proverna väl och inkubera sedan flaskorna i mörker vid rumstemperatur i 24 timmar.
- Efter 24 timmar, centrifugera proverna, och samla in supernatanten och filtrera den genom 0,45 um nylonmembran.
- Insprutning av provet direkt i en Shimadzu HPLC-LC-20AT system utrustat med en 4,6 U ODS-C18-kolonn (200 Å, 250 ± 4,6 mm) och en Shimadzu SPD-20A UV / VIS-detektor inställd för att övervaka vid 282 nm.
- Använda metanol (100%) vid en flödeshastighet av 1,5 ml / min som den mobila fasen. Bestämma kvantifiering av ergosterol i prover genom att jämföra toppytorna för prover med en standardkurva genererad från HPLC-kvalitet ergosterol.
6. Representativa resultat
Efter ympning och inkubering i en fuktkammare två till tre dagar, bör svamptillväxt börja visas på kärnorna. Sju dagar efter behandling, vegetativ tillväxt på behandlade växter ska vara klart synliga, while håna kontroller bör infekterade (Figur 1B, överst). Perioder med längre inkubationstid bidrar till mer rikliga vegetativ tillväxt (Figur 1B, nederst). Under de betingelser som beskrivs här (figur 2G), A. flavus vildtyp NRRL 3357 visade maxvärden av kolonisering, aflatoxin ackumulering och konidier produktion på 8, 6 och 8 dagar, respektive (figur 2, AC). Men när kontaminering med mykotoxiner och conidiation jämfördes per ergosterol, var största uppmätta värdena vid 4 och 6 dagar, respektive (figur 2, DE). Figur 2F sammanfattar dessa svampar biomassa beroende max-värde observationer. Intressant, mellan 4-6 dagar efter ympning, kärnorna genomgår nukleinsyra nedbrytning, vilket framgår av total RNA från prover på tidsförloppet (Figur 2H, nederst).
Flera studier, inklusive vår egen, har att granskaed F. verticilliodies infektion majs kärnor 2,8,9,10,11,12 och använts med framgång 7-13 dagar i mån av tid-punkter för observationer. Användning av metoderna som beskrivs häri, fumonisin nivåer intervallet från 3,500-8,000 ng / g kärna 4,13 och ergosterol nivåer varierar från 5000-10000 ng / g kärna 14,13. Figur 3 visar representativa toppar för fumonisin (överst) och ergosterol (botten ) från HPLC-kromatogrammen. Mätning av ergosterol kan också utföras via absorbansspektra 15.
Figur 1. Flödesschema för kvantifiering av svamp biomassa, sporogenes och mykotoxiner produktion och resultat representativa för vegetativ tillväxt kärnan bioanalyser. A) Flödesschema som beskriver den beskrivna metoden för kvantifiering av grundläggande biologiska parametrar som används för att bedöma svamppatogenes på majs kärnor. B) Representativaresultat kernel bioanalyser. Top, A. flavus (NRRL3357) vegetativ tillväxt på majs kärnor i B73 genetisk bakgrund. Frön inokulerades med 200 | il av 10 6 sporer / ml och bilder togs 7 dagar efter inokulering. Botten, F. verticillioides inokulerades kärnor i B73 bakgrunden 13 dagar efter infektion. Kärnor inokulerades med 200 | il av 10 6 sporer / ml.
Figur 2. Aspergillus flavus kernel bioassay tidsförlopp. B73-kärnor inokulerades med 200 | il av 10 6 sporer / ml Aspergillus flavus konidial suspension och inkuberades under 2-8 dagar (g). Alla värden bestämdes från den torra vikten i genomsnitt 4 kärnor (n = 3-4; medelvärdet ± SE). A) Kolonisering (baserat på ergosterol), (B) aflatoxin, och (C) conidiation kvantifierades med användning av metoder beskrivna ovan. E) Aflatoxin och (F) conidiation visassom en funktion av fungös biomassa såsom uppmätt genom ^ H ergosterol. F) Största tillåtna värden för ergosterol, aflatoxin ackumulering och conidiation som en funktion av fungös biomassa - gränsvärden för varje kvantitet observerats sattes till 100%. (H) 1 ^ g per bana av totalt RNA från tidsförloppet.
Figur 3. Representativa High Performance Liquid Chromatography (HPLC)-kromatogram för fumonisin B1 (överst) och ergosterol (botten) isolerades från kärnor som infekterats med Fusarium verticillioides (M3125).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka Brandon Hassett och Carlos Ortiz för deras tekniskt bistånd. Detta arbete stöddes av NSF bidrag IOB-0544428, IOS-0951272 och IOS-0925561 till Dr Michael Kolomiets, och av USDA National Institute of Food och jordbruksorganisation (NifA), Afri Växtförädling och utbildning Grant # 2010-85.117 -20.539 till Dr. Seth Murray, Thomas Isakeit och Michael Kolomiets.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientific | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Blender | Vicam | 20200 | |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 | |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 | |
| Afla Test column | Vicam | G1024 | |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 | |
| Methanol | Vicam | 35016 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | AC14952-0025 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC39769-0025 | |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientific | 60108-304 | |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma-Aldrich | 79760-5g | |
| Boric acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Sodium borate | Fisher Scientific | RDCS0330500 | |
| Mercapt–thanol | Fisher Scientific | 45-000-231 | |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Corporation | LC-20AT | |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Corporation | RF-10AXL | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | AC38987-0010 | |
| FB1 standards | Sigma-Aldrich | F1147-1mg | |
| Chloroform | VWR international | MK444410 | |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Corporation | 4426 | |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F | |
| Scintillation vials | VWR international | 66021-602 | |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -H., Shim, W. -B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
