Summary
Den ødelæggelse af kornafgrøder ved frø-inficerende svampe har fået mange forskningsindsats for bedre at forstå plante-patogen interaktioner. At studere frø-svampe interaktioner i et laboratorium indstilling, har vi udviklet en robust metode til kvantificering af svampe reproduktion, biomasse, og mykotoksinkontaminering brugen af kernel bioassays.
Abstract
Den forrådnelse af korn af frø-inficerende svampe udgør en af de største økonomiske udfordringer til kornproduktion på verdensplan, for ikke at nævne alvorlige risici for menneskers og dyrs sundhed. Blandt kornproduktion, er majs nok den hårdest ramte afgrøde, på grund af patogen-inducerede tab i korn integritet og mycotoxin frø forurening. De to mest udbredte og problematisk mykotoksiner for majs avlere og fødevarer og foder processorer er aflatoksin og fumonisin, produceret af Aspergillus flavus og Fusarium verticillioides, hhv.
Nylige undersøgelser i molekylær plante-patogen interaktioner har vist sig lovende i forståelsen særlige mekanismer i forbindelse med plante svar på svampeinfektion og mykotoksinkontaminering 1,2,3,4,5,6. Da mange laboratorier anvender kerne assays for at undersøge plante-patogen interaktioner, der er et behov for en standardiseret fremgangsmåde til kvantificering forskellige biologiske parametre, såResultaterne fra forskellige laboratorier kan tværs fortolkes. For et robust og reproducerbar midler til kvantitative analyser på frø, har vi udviklet in-lab kerne analyser og efterfølgende metoder til at kvantificere svampevækst, biomasse, og mykotoksin forurening. Fire steriliserede majskerner inokuleres i hætteglas med en fungal suspension (10 6) og inkuberes i en forudbestemt periode. Prøvehætteglas udvælges derefter til tælling af conidier af hæmocytometer, ergosterol-biomasse analyse ved væskechromatografi med høj ydeevne (HPLC), aflatoxin kvantificering ved anvendelse af en AflaTest fluorometeret metode, og fumonisin kvantificering ved HPLC.
Protocol
1. Majs Kernel Bioassay
- To uger før, dyrkning af fungale patogener på kartoffeldextroseagar (PDA) ved 28 ° C.
- Vælge kerner med lignende størrelse og form, fortrinsvis fladtrykt, så de lå i niveau med bunden af bioassay hætteglas, og anbringes i 50 ml Falcon-rør. Udvalgte Kerner skal være fremstillet samtidigt i samme miljø for at sikre et ensartet frø alder og metabolit sammensætning.
- Overfladen steriliseres kerner ved omrystning rør ved stuetemperatur i 5 minutter med 70% ethanol, 1 minut med sterilt vand, og 10 minutter med 6% natriumhypochlorit. Skylning tre gange i 5 minutter hver gang, med sterilt vand, samtidig med omrystning. Pat kerner tørre på autoklaverede håndklæder.
- For at lette infektion af Aspergillus flavus, skaber en lille sår på embryo-side med en 18 G nål til dybde på 0,5 cm. Men i vores erfaring en større sår der er behov for Fusarium verticillioides infektion. Therefore, anvendes et barberblad at skære ind i embryo-side i en dybde på 0,5 mm.
- Fremstille inokulumsuspension ved skrabning dyrkede plader i cirka 5 ml autoklaveret 0,01% Tween-20 opløsning for at frigøre sporer og fjerne myceliet ved hjælp af tyngdekraften filtrering gennem mindst 4 lag osteklæde autoklaveret. Beregn sporekoncentration med hæmocytometer og justeres til 10 6 sporer / ml for A. flavus eller F. verticillioides. Hvis der anvendes andre arter af pathogen eller vært, er det vigtigt at evaluere koncentrationer af inokulum for passende infektion.
- Skabe et fugtighedskammer i en plastbeholder (29,2 cm x 18,7 cm x 8,3 cm) fyldt med fem ark papirservietter og 100 ml sterilt vand. Afdeling er ikke vand-eller lufttæt og yderligere vand bør tilføjes under hele eksperimentet for at holde papirservietter fugtig.
- Placer fire kerner i en autoklaveret 20 ml glasscintillationshætteglas og optage deres masse. Inokulere med 200 ul sporesuspension,cap, og vortex til jævnt kerner med suspension. Løsn hætter til frit at give luftskifte og anbringes i fugtigt kammer.
Bemærk: For frø eller svampe andre end dem, der er beskrevet i disse metoder, kan mængden af inokulum krævede være anderledes og skal udledes eksperimentelt.
- Inkuber kerner under en 12-h-light/12-h-dark fotoperiode ved 28 ° C i 7 dage eller indtil ønsket.
2. Conidia Enumeration
- Efter infektionen periode, tilsættes 5 ml autoklaveret 0,01% Tween-20 til scintillationsglas, der indeholder inficerede kerner og vortex grundigt i 1 minut.
- Ved anvendelse af en stor indvendig diameter pipettespids, fortyndes straks ved at overføre to separate 200 ul alikvoter af sporesuspension i 2,0 ml Eppendorf-rør indeholdende 1,8 ml 0,01% Tween-20 (eller fortyndet efter behov afhængigt af infektion).
- Optælle hver 200 pi alikvot to gange med et hæmocytometer 4og sammenligne niveauer af konidier mellem behandlingerne.
3. Aflatoxin Kvantificering
- Tilsættes kerner fra en prøve på 50 ml blender bæger med 20 ml 80% methanol og 0,05 g NaCl, dækslet og blanding ved høj hastighed i 1 min.
- Placer en riflet filterpapir over en ren samling beholder og hæld ekstrakt i filteret.
- Overfør 10 ml af filtratet til en ren beholder, der tilsættes 20 ml destilleret H2O, og bland godt.
- Filteret prøven gennem en 1,5 um glasmikrofiberfilter i en ren skål.
- Anvendes 1 ml filtrerede ekstrakt til Afla testsøjle og ved hjælp af komprimeret luft, tvinges den filtrerede ekstrakt gennem søjlen med en hastighed på 1-2 dråber / sekund, indtil tømt.
- Vask kolonne to gange med 1 ml destilleret H2O og passere gennem søjlen ved 1-2 dråbe / sekund, indtil luft kommer igennem.
- Eluer søjlen med 1 ml 100% HPLC ren methanol ved en 1-2 dråbe / sekund på opsamlet i en glaskuvette.
- Tilføj1 ml af Afla Test Udvikler til eluatet og bland godt. Sted kuvette i kalibreret fluorometer og aflæst ved 60 sek.
Bemærk: Når du bruger Aflatest FGIS-protokollen, er målingen fra fluorometer beregnes på grundlag af en indledende 50 gram prøve ekstraheres i 100 ml. Hvis du mener, at fortynding af prøven med vand, 1 ml på en kolonne repræsenterer 0,166 gram af prøven. Så når ændre protokollen, er du nødt til at tage hensyn til forskelle i stikprøvestørrelse og den indledende ekstraktion løsning. For eksempel er 2 gram kerner ekstraheret i 20 ml 80% methanol. Dette er 0,1 g / ml. Når 1 ml af denne prøve blandes med 2 ml vand, den del af prøven i væsken er nu 0,033 g / ml. Hvis denne prøve giver et fluorometer aflæsning på 100 ppb, er den faktiske koncentration baseret på den del af prøven til 0,166, dvs ppb = (0,166 gram x 100 ppb) / 0,1 gram) eller 166 ppb. For alternativ aflatoxin kvantificekation metoder, se reference 7.
4. Fumonisin B1 (FB1) Analyse
- Når svampen dyrkes i majskerner, ekstrahere prøver natten over med 10 ml acetonitril / vand (50/50, v / v) ved stuetemperatur uden omrøring. Derefter blandes ekstrakt (2 ml) med deioniseret vand (6 ml), og anvende denne blanding (8 ml) direkte til C-18 fastfaseekstraktion.
- Før lastning prøve forudsætning C-18 fastfaseekstraktionskolonne ved skylning med 2 ml acetonitril, efterfulgt af 2 ml vand.
- Efter påsætning af prøven, vaskes søjlen med 2 ml vand efterfulgt af 2 ml acetonitril / vand (15/85, v / v). Prøve til HPLC-analyse (indeholdende FB1) elueres med 2 ml acetonitril / vand (70/30, v / v).
- Derivatisere FB1 med o-phthaldehyd (OPA) ved at overføre 0,1 ml af søjleeluatet til et hætteglas indeholdende 0,1 ml boratpuffer (0,05 M borsyre acid/0.05 M natriumborat [50/50, v / v], pH 8,5) og 0,1 ml OPA (0,1 mg / ml i acetoneitrile med 0,5% - mercaptoethanol).
- Reaktionen standses efter 10 minutter ved tilsætning af 0,5 ml acetonitrile/0.01 M borsyre (40/60, v / v).
- Analyse FB1 på et Shimadzu HPLC LC-20AT-system udstyret med en analytisk Zorbax ODS-søjle (4,6 150 mm) og en variabel bølgelængde Shimatzu RF-10Axl fluorescensdetektor (excitation 335 nm / emission 440 nm).
- En lineær gradient anvendes (opløsningsmiddel A: acetonitrile/0.1 M natriumphosphat (40/60), pH 3,3; opløsningsmiddel B: acetonitril / 0,1 M natriumphosphat (60/40), pH 3,3) og gradientprogram er som følger: 100% A til 100% B i 10 minutter, 100% B i 5 minutter.
- Analysere FB1 standarder ved HPLC, og toparealet målinger anvendes til at generere standardkurve. Efterfølgende kvantificere FB1 niveau i en prøve ved sammenligning toparealer med FB1 standardkurve.
5. Ergosterol Analyse
- Kultur svampen på majs kerner i 7-14 dage.
- Efter inkubationsperioden tilsættes 10 ml chloroform: methanol (2:1, vol / vol) i hvert hætteglas. Gang tilsat, rystes prøverne godt og derefter inkuberes hætteglas i mørke ved stuetemperatur i 24 timer.
- Efter 24 timer centrifugeres prøverne, og indsamle supernatanten og filtreres gennem 0,45 um nylon membran.
- Indsprøjtning af prøve direkte ind i en Shimadzu HPLC LC-20AT-system udstyret med en 4,6 U ODS-C18-søjle (200 Å, 250 ± 4,6 mm) og en Shimadzu SPD-20A UV / VIS-detektor indstillet til overvågning ved 282 nm.
- Anvende methanol (100%) ved en strømningshastighed på 1,5 ml / min som den mobile fase. Bestemme kvantificering af ergosterol i prøver ved sammenligning Toparealerne for prøver med en standardkurve genereret ud fra HPLC-kvalitet ergosterol.
6. Repræsentative resultater
Efter podning og inkubation i et fugtigt kammer i to til tre dage, bør svampevækst begynde at blive vist på kernerne. Syv dage efter behandlingen, vegetativ vækst på behandlede planter skal være tydeligt, while mock kontroller bør være uinficeret (figur 1B, øverst). Perioder med længere inkubation er befordrende for mere fyldige vegetativ vækst (figur 1B, nederst). Under de betingelser, der er beskrevet heri (fig. 2G), A. flavus vildtype-NRRL 3357 viste maksimale værdier for kolonisering, aflatoksin ophobning og sporer produktion på 8, 6 og 8 dage (figur 2, AC). Når mykotoksinkontaminering og conidiation blev sammenlignet pr ergosterol, blev de største observerede niveauer på 4 og 6 dage (figur 2, DE). Figur 2F opsummerer disse fungale biomasse-afhængige maksimale værdi observationer. Interessant 4-6 dage efter inokulering, undergår kernerne nukleinsyre nedbrydning, som det ses ved total RNA fra prøver på tidsforløbet (figur 2H, nederst).
Flere undersøgelser, herunder vores egen, har examined F. verticilliodies infektion på majskerner 2,8,9,10,11,12 og med succes anvendt 7-13 dage så tid-point for observationer. Anvendelse af de heri beskrevne fremgangsmåder, fumonisin niveauer området fra 3,500-8,000 ng / g kerne 4,13 og ergosterol i området fra 5.000-10.000 ng / g kerne 14,13. Figur 3 viser repræsentative toppe for fumonisin (øverst) og ergosterol (nederst ) fra HPLC chromatogrammer. Måling af ergosterol kan også udføres via absorbansspektre 15.
Figur 1. Rutediagram for kvantificering af svampe biomasse, sporedannelse, og mykotoksin produktion og repræsentative resultater for vegetativ vækst fra kerne bioassays. A) Flow diagram skitserer den beskrevne metode til kvantificering af grundlæggende biologiske parametre, der anvendes til at vurdere svampe patogenese på majskerner. B) RepræsentantResultaterne for kerne bioassays. Top, A. flavus (NRRL3357) vegetativ vækst på majskerner i B73 genetiske baggrund. Frø blev inokuleret med 200 gl 10 6 sporer / ml og billeder blev taget 7 dage efter inokulering. Bund, F. verticillioides inokuleret kerner i B73 baggrunden 13 dage efter infektion. Kerner blev inokuleret med 200 pi 10 6 sporer / ml.
Figur 2. Aspergillus flavus kernel bioassay tidsforløb. B73 kerner blev inokuleret med 200 pi 10 6 sporer / ml Aspergillus flavus konidiesuspension og inkuberet i 2-8 dage (G). Alle værdier blev bestemt ud fra tørvægten gennemsnittet af 4 kerner (n = 3-4; middelværdi ± SE). A) Colonization (baseret på ergosterol), (B) aflatoxin, og (C) conidiation blev kvantificeret ved anvendelse af fremgangsmåder beskrevet ovenfor. E) aflatoksin og (F) conidiation visessom en funktion af svampebiomasse målt ved t ergosterol. F) Maksimumværdier for ergosterol, aflatoksin ophobning og conidiation som en funktion af svampe biomasse - den største værdi for hver mængde observeret blev sat til 100%. (H) 1 ug pr bane af totalt RNA fra tidsforløbet.
Figur 3. Repræsentative High performance liquid chromatography (HPLC)-kromatogrammer for fumonisin B1 (øverst) og ergosterol (nederst) er isoleret fra kerner inficeret med Fusarium verticillioides (M3125).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Brandon Hassett og Carlos Ortiz for deres tekniske assistance. Dette arbejde blev støttet af NSF tilskud IOB-0544428, IOS-0951272, og IOS-0925561 til Dr. Michael Kolomiets, og af USDA National Institute of Levnedsmiddel-og Landbrugsorganisation (NifA), AFRI Planteforædling og Uddannelse Grant # 2010-85117 -20539 til Drs. Seth Murray, Thomas Isakeit, og Michael Kolomiets.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientific | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Blender | Vicam | 20200 | |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 | |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 | |
| Afla Test column | Vicam | G1024 | |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 | |
| Methanol | Vicam | 35016 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | AC14952-0025 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC39769-0025 | |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientific | 60108-304 | |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma-Aldrich | 79760-5g | |
| Boric acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Sodium borate | Fisher Scientific | RDCS0330500 | |
| Mercapt–thanol | Fisher Scientific | 45-000-231 | |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Corporation | LC-20AT | |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Corporation | RF-10AXL | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | AC38987-0010 | |
| FB1 standards | Sigma-Aldrich | F1147-1mg | |
| Chloroform | VWR international | MK444410 | |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Corporation | 4426 | |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F | |
| Scintillation vials | VWR international | 66021-602 | |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -H., Shim, W. -B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
