Kvantificering af svampekolonisering, sporedannelse, og produktionen af mycotoksiner brugen af kernel Bioassays
Summary
Den ødelæggelse af kornafgrøder ved frø-inficerende svampe har fået mange forskningsindsats for bedre at forstå plante-patogen interaktioner. At studere frø-svampe interaktioner i et laboratorium indstilling, har vi udviklet en robust metode til kvantificering af svampe reproduktion, biomasse, og mykotoksinkontaminering brugen af kernel bioassays.
Abstract
Den forrådnelse af korn af frø-inficerende svampe udgør en af de største økonomiske udfordringer til kornproduktion på verdensplan, for ikke at nævne alvorlige risici for menneskers og dyrs sundhed. Blandt kornproduktion, er majs nok den hårdest ramte afgrøde, på grund af patogen-inducerede tab i korn integritet og mycotoxin frø forurening. De to mest udbredte og problematisk mykotoksiner for majs avlere og fødevarer og foder processorer er aflatoksin og fumonisin, produceret af Aspergillus flavus og Fusarium verticillioides, hhv.
Nylige undersøgelser i molekylær plante-patogen interaktioner har vist sig lovende i forståelsen særlige mekanismer i forbindelse med plante svar på svampeinfektion og mykotoksinkontaminering 1,2,3,4,5,6. Da mange laboratorier anvender kerne assays for at undersøge plante-patogen interaktioner, der er et behov for en standardiseret fremgangsmåde til kvantificering forskellige biologiske parametre, såResultaterne fra forskellige laboratorier kan tværs fortolkes. For et robust og reproducerbar midler til kvantitative analyser på frø, har vi udviklet in-lab kerne analyser og efterfølgende metoder til at kvantificere svampevækst, biomasse, og mykotoksin forurening. Fire steriliserede majskerner inokuleres i hætteglas med en fungal suspension (10 6) og inkuberes i en forudbestemt periode. Prøvehætteglas udvælges derefter til tælling af conidier af hæmocytometer, ergosterol-biomasse analyse ved væskechromatografi med høj ydeevne (HPLC), aflatoxin kvantificering ved anvendelse af en AflaTest fluorometeret metode, og fumonisin kvantificering ved HPLC.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Brandon Hassett og Carlos Ortiz for deres tekniske assistance. Dette arbejde blev støttet af NSF tilskud IOB-0544428, IOS-0951272, og IOS-0925561 til Dr. Michael Kolomiets, og af USDA National Institute of Levnedsmiddel-og Landbrugsorganisation (NifA), AFRI Planteforædling og Uddannelse Grant # 2010-85117 -20539 til Drs. Seth Murray, Thomas Isakeit, og Michael Kolomiets.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog # |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifc | S71659A |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 |
| Blender | Vicam | 20200 |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 |
| Afla Test column | Vicam | G1024 |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 |
| Methanol | Vicam | 35016 |
| Acetonitrile | Fisher Scientifc | AC14952-0025 |
| Ethanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientifc | 60108-304 |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g |
| Boric acid | Fisher Scientifc | BP168-500 |
| Sodium borate | Fisher Scientifc | RDCS0330500 |
| Mercaptoethanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20AT |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL |
| Sodium phosphate | Fisher Scientifc | AC38987-0010 |
| FB1 standards | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg |
| Chloroform | VWR | MK444410 |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Life Science | 4426 |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F |
| Scintillation vials | VWR | 66021-602 |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -. B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus – seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -. E., Park, Y. -. S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -. B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -. B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -. B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -. B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Christensen, S. A. . Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -. H., Shim, W. -. B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
