Summary
Die Verwüstung von Getreide durch Samen-Pilzresistenz hat zahlreiche Forschungsarbeiten zum besseren Verständnis Pflanze-Pathogen-Interaktionen dazu aufgefordert werden. Um Saatgut-Pilz-Interaktionen in einem Labor untersuchen, entwickelten wir eine robuste Methode zur Quantifizierung von Pilz-Reproduktion, Biomasse und Mykotoxinkontamination mit Kernel Bioassays.
Abstract
Die Verrottung der Körner durch Samen-Pilzresistenz stellt eine der größten wirtschaftlichen Herausforderungen zu Getreideproduktion weltweit, nicht zu ernsthaften Gefahren für die menschliche und tierische Gesundheit zu erwähnen. Unter Getreideproduktion ist Mais wohl die betroffenen Kultur, durch Pathogen-induzierte Verluste in Korn Integrität und Mykotoxin-Verunreinigung von Saatgut. Die beiden am weitesten verbreiteten und problematisch für Mykotoxine Maiserzeuger und Lebens-und Futtermittel-Prozessoren sind Aflatoxin und Fumonisin, durch Aspergillus flavus und Fusarium verticillioides produziert bzw..
Neuere Untersuchungen in der molekularen Pflanze-Pathogen-Interaktionen haben Versprechen für das Verständnis spezifischer Mechanismen mit pflanzlichen Reaktionen auf Pilzinfektion und Mykotoxinkontamination 1,2,3,4,5,6 verbunden demonstriert. Da viele Labs verwenden Kernel-Assays, um Pflanzen-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen, besteht ein Bedarf für ein standardisiertes Verfahren zur Quantifizierung von unterschiedlichen biologischen Parameter, soErgebnisse aus verschiedenen Laboratorien können Cross-interpretiert werden. Für eine robuste und reproduzierbare Mittel für quantitative Analysen auf Saatgut, haben wir im Labor Kernel-Assays und anschließender Methoden entwickelt, um das Pilzwachstum, Biomasse und Mykotoxinkontamination quantifizieren. Vier sterilisiert Maiskörner in Glasfläschchen mit einer Pilz-Suspension (10 6) beimpft und für einen vorbestimmten Zeitraum. Probenfläschchen werden dann für die Zählung von Conidien mit einem Hämocytometer, Ergosterin-Biomasse Analyse ausgewählt durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), Aflatoxin Quantifizierung mit Hilfe eines AflaTest Fluorometer Verfahren und Fumonisin Quantifizierung durch HPLC.
Protocol
1. Maiskorn Bioassay
- Zwei Wochen vor, die Kultur pilzliche Erreger auf Kartoffeldextroseagar (PDA) bei 28 ° C
- Wählen Kerne mit ähnlicher Größe und Form, vorzugsweise abgeflacht, so dass sie auf Höhe der Unterkante der Bioassay Fläschchen, und in 50 ml Falcon-Röhrchen zu legen. Kernel ausgewählt werden, müssen produziert worden sind gleichzeitig in derselben Umgebung, um ähnliche Samen Alters-und Metabolit-Zusammensetzung zu gewährleisten.
- Oberfläche sterilisiert Kernel, die von Schüttelkolben bei Raumtemperatur für 5 Minuten mit 70% Ethanol, 1 Minute mit sterilem Wasser, und 10 Minuten mit 6% Natriumhypochlorit. Spülen, dreimal, jeweils 5 Minuten Zeit, mit sterilem Wasser dabei weiterhin zittern. Pat Kerne trocken auf autoklavierten Handtücher.
- Um eine Infektion von Aspergillus flavus zu erleichtern, eine kleine Wunde auf den Embryo-Seite mit einer 18 G Nadel in die Tiefe von 0,5 cm. Aber nach unserer Erfahrung eine größere Wunde wird für Fusarium verticillioides Infektion benötigt. Therefore Verwenden einer Rasierklinge in den Embryo-Seite in einer Tiefe von 0,5 mm geschnitten.
- Bereiten Inokulumsuspension durch Schaben kultivierten Platten in etwa 5 ml autoklavierten 0,01% Tween-20 Lösung, um Sporen zu befreien und zu entfernen Myzel durch die Schwerkraft Filterung durch mindestens 4 Schichten von autoklavierten Gaze. Berechnen Sie Sporenkonzentration mit Hämozytometer und justieren bis 10 6 Sporen / ml für A. flavus oder F. verticillioides. Bei Verwendung anderer Arten von Pathogenen oder einen Host, ist es wichtig, die Konzentration von Inokulum für geeignete Infektion zu bewerten.
- Erstellen Sie eine feuchte Kammer in einem Plastikbehälter (29,2 cm x 18,7 cm x 8,3 cm) mit fünf Blatt Papier Handtücher und 100 ml sterilem Wasser gefüttert. Kammer ist nicht wasser-oder luft-und zusätzliches Wasser sollte in der gesamten Experiment zu halten feuchten Papiertüchern hinzugefügt werden.
- Platz vier Kerne in einer autoklavierten 20 ml Glasszintillationsröhrchen und Aufzeichnung ihrer Masse. Impfen mit 200 ul Sporensuspension,Kappe und Wirbel gleichmäßig zu beschichten Kerne mit Federung. Lösen Sie sich frei Kappen ermöglichen den Luftaustausch und Ort in feuchten Kammer.
Hinweis: Samen oder anderen Pilzen als die in dieser beschriebenen Verfahren, die Menge an Inokulum erforderlichen verschieden sein kann und sollte experimentell abgeleitet werden.
- Inkubieren Kernel unter einem 12-h-light/12-h-dark Photoperiode bei 28 ° C für 7 Tage oder bis die gewünschte.
2. Konidien Enumeration
- Nach der Infektion Zeitraum, 5 ml autoklavierten 0,01% Tween-20 in Szintillationsgefäße mit infizierten Körner und gründlich vortexen für 1 Minute.
- Mit einer breit Bohrung Pipettenspitze, sofort durch die Übertragung von zwei getrennten 200 ul Aliquots Sporensuspension in 2,0 ml Eppendorf-Röhrchen mit 1,8 ml 0,01% Tween-20 (oder verdünnter als je nach Infektion erforderlich) zu verdünnen.
- Zählen Sie jeweils 200 ul Aliquot zweimal mit einem Hämocytometer 4und vergleichen Ebenen der Konidien zwischen den Behandlungen.
3. Aflatoxin Quantifizierung
- Add-Kernel von 1 Probe zu 50 ml Mixbecher mit 20 ml 80% Methanol und 0,05 g NaCl, Deckel und Mischung bei hoher Geschwindigkeit für 1 min.
- Setzen Sie ein Faltenfilter über eine saubere Sammlung Gefäss auf und füllen Extrakt in Filter.
- Übertragen Sie 10 ml Filtrat in ein sauberes Gefäß, mit 20 ml destilliertem H 2 O, und gut mischen.
- Filter Probe durch eine 1,5 um Glas-Mikrofaser-Filter in einen sauberen Becher.
- Bewerben 1 ml filtrierte Extrakt zu Afla Spalte Test und mit Hilfe von Druckluft, zwingen das gefilterte Extrakt durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1-2 Tropfen / Sekunde, bis entleert.
- Waschkolonne zweimal mit 1 ml destilliertem H 2 O und durchlaufen Säule bei 1-2 Tropfen / Sekunde, bis Luft kommt durch.
- Eluieren Säule mit 1 ml 100% HPLC-Qualität Methanol bei einer 1-2 Tropfen / Sekunde Geschwindigkeit in einen Glasküvette gesammelt.
- Hinzufügen1 ml Afla Test-Entwickler auf Eluat und gut mischen. Ort Küvette in kalibriert Fluorometer und lesen bei 60 sek.
Hinweis: Bei Verwendung des Aflatest FGIS Protokoll, die Messung aus dem Fluorometer wird basierend auf einer anfänglichen 50 g Probe in 100 ml extrahiert berechnet. Wenn Sie die Verdünnung der Probe mit Wasser betrachten, das 1 ml aufgetragen, um eine Spalte darstellt 0,166 g Probe. Also, bei einer Änderung des Protokolls, müssen Sie berücksichtigen die Unterschiede in der Stichprobengröße und die anfängliche Extraktionslösung. Zum Beispiel werden 2 g der Samen in 20 ml 80% Methanol extrahiert. Dies ist 0,1 g / ml. Wenn 1 ml dieser Probe werden mit 2 ml Wasser gemischt wird, ist der Anteil der Probe in der Flüssigkeit nun 0,033 g / ml. Wenn in diesem Beispiel gibt einen Fluorometer Lesung von 100 ppb, wird die tatsächliche Konzentration auf den Anteil der Probe 0,166, das heißt ppb = (0,166 g X 100 ppb) / 0,1 g), oder 166 ppb bezogen. Für alternative Aflatoxin QuantifizierungKation Methoden finden Sie unter Referenz 7.
4. Fumonisin B1 (FB1) Analyse
- Wenn Pilz auf Maiskörnern angebaut wird, zu extrahieren Proben über Nacht mit 10 ml Acetonitril / Wasser (50/50, v / v) bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Anschließend mischen den Extrakt (2 ml) mit destilliertem Wasser (6 ml), und wenden Sie diese Mischung (8 ml) direkt mit dem C-18-Festphasenextraktion.
- Vor dem Einlegen der Probe, die Voraussetzung C-18 Festphasenextraktionssäule durch Spülen mit 2 ml Acetonitril von 2 ml Wasser gefolgt.
- Nach dem Laden der Probe wird die Säule mit 2 ml Wasser mit 2 ml Acetonitril / Wasser (15/85, v / v) gewaschen. Probe für die HPLC-Analyse (mit FB1) mit 2 ml Acetonitril / Wasser (70/30, v / v) eluiert.
- Derivatisieren FB1 mit o-Phthalaldehyd (OPA) durch Übertragung von 0,1 ml Eluat der Säule in ein Fläschchen mit 0,1 ml Boratpuffer (0,05 M Borsäure acid/0.05 M Natriumborat [50/50, V / V], pH 8,5) und 0,1 OPA ml (0,1 mg / ml in Acetonitrile mit 0,5% - Mercaptoethanol).
- Die Reaktion nach 10 min durch Zugabe von 0,5 ml acetonitrile/0.01 M Borsäure (40/60, v / v).
- Analysieren FB1 auf einem Shimadzu HPLC LC-20AT-System mit einer analytischen Zorbax-ODS-Säule (4,6 150 mm) und einer variablen Wellenlänge Shimatzu RF-10Axl Fluoreszenzdetektor (Anregung 335 nm / Emission 440 nm) ausgestattet.
- Ein linearer Gradient verwendet wird (Lösungsmittel A: acetonitrile/0.1 M Natriumphosphat (40/60), pH 3,3, Lösungsmittel B: Acetonitril / 0,1 M Natriumphosphat (60/40), pH 3,3) und die Gradienten-Programms ist wie folgt: 100% A bis 100% B in 10 min, 100% B für 5 Minuten.
- Analysieren FB1 Standards mittels HPLC und Peakfläche Messungen werden verwendet, um Standardkurve zu erstellen. Anschließend quantifizieren FB1 Ebene in einer Probe durch Vergleich Peakflächen mit FB1 Standardkurve.
5. Ergosterol Analyse
- Kultur der Pilz auf Maiskörner für 7-14 Tage.
- Nach der Inkubationszeit, fügen Sie 10 ml Chloroform: methnol (2:1, v / v) in jedem Fläschchen. Einmal aufgenommen, schütteln Sie die Proben gut und dann inkubieren Fläschchen im Dunkeln bei Raumtemperatur für 24 Stunden.
- Nach 24 Stunden, die Proben zentrifugieren und den Überstand und filtern es durch 0,45 um Nylonmembran.
- Die Probe direkt in ein Shimadzu HPLC LC-20AT-System mit einem 4,6 U ODS-C18-Säule (200 A, 250 ± 4,6 mm) und einem Shimadzu SPD-20A UV / VIS Detektor eingestellt bei 282 nm-Monitor ausgestattet.
- Verwendung Methanol (100%) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml / min als mobile Phase. Bestimmen Quantifizierung von Ergosterol in Proben durch Vergleichen der Spitzenbereiche von Proben mit einer Standardkurve von HPLC-Qualität Ergosterol erzeugt.
6. Repräsentative Ergebnisse
Nach der Inokulation und die Inkubation in einer feuchten Kammer für zwei bis drei Tage, das Pilzwachstum zu beginnen, auf den Kernen zu sehen. Sieben Tage nach der Behandlung, das vegetative Wachstum auf behandelten Pflanzen sollten gut sichtbar sein, while Mock Kontrollen sollten nicht infiziert sind (Abbildung 1B, oben). Zeiträume von mehr Inkubation förderlich sind mehr reichlich vegetativen Wachstums (Abbildung 1B, unten). Unter den hier beschriebenen Bedingungen (Abbildung 2G), A. flavus Wildtyp-NRRL 3357 angezeigt Maximalwerte der Kolonisation, Aflatoxin Akkumulation, Produktion und Konidien bei 8, 6, und 8 Tage, (Abbildung 2, AC). Allerdings, wenn Mykotoxinkontamination und conidiation pro Einheit von Ergosterol verglichen wurden, wurden die größten Werte bei 4 und 6 Tage lang beobachtet, (Abbildung 2, DE). 2F fasst diese pilzliche Biomasse-abhängige maximale Wert-Beobachtungen. Interessanterweise zwischen 4-6 Tagen nach der Inokulation, unterzogen die Kerne Nukleinsäureabbaus, wie Gesamt-RNA von Proben auf den zeitlichen Verlauf (2H, unten) gesehen.
Mehrere Studien, einschließlich unserer eigenen, haben ExaminEd F. verticilliodies Infektion auf Maiskörnern 2,8,9,10,11,12 und erfolgreich eingesetzt 7-13 Tage als Zeit-Punkte für Beobachtungen. Mit den hier beschriebenen Verfahren, Fumonisin liegen im Bereich von 3,500-8,000 ng / g und 4,13 Kernel Ergosterin liegen im Bereich von 5.000-10.000 ng / g Kernel 14,13. Abbildung 3 zeigt repräsentative Peaks für Fumonisin (oben) und Ergosterol (unten ) von HPLC-Chromatogrammen. Messung von Ergosterol kann auch über Absorptionsspektren 15 durchgeführt werden.
Abbildung 1. Ablaufschema für die Quantifizierung von pilzlichen Biomasse, Sporogenese und Mykotoxin-Produktion und repräsentative Ergebnisse für das vegetative Wachstum von Kernel-Bioassays. A) Flow-Diagramm, in der beschriebenen Methode zur Quantifizierung der grundlegenden biologischen Parameter verwendet werden, um die Pathogenität von Pilzen auf Maiskörnern zu beurteilen. B) VertreterErgebnisse für die Kernel-Bioassays. Top, A. flavus (NRRL3357) vegetatives Wachstum auf Maiskörnern in die B73 genetischen Hintergrund. Die Samen wurden mit 200 ul 10 6 Sporen / mL und Bilder aufgenommen wurden 7 Tage nach der Impfung geimpft. Unten, F. verticillioides inokulierten Körner in B73 Hintergrund 13 Tage nach der Infektion. Kerne wurden mit 200 ul 10 6 Sporen / ml inokuliert.
Abbildung 2. Aspergillus flavus Kernel Bioassay zeitlichen Verlauf. B73 Kerne wurden mit 200 ul 10 6 Sporen / ml Aspergillus flavus Konidienaufschwemmung beimpft und für 2-8 Tage (G). (; Mittelwert ± SE n = 3-4) Alle Werte wurden aus dem Trockengewicht durchschnittlich 4 Kernel bestimmt. A) Die Kolonisation (bezogen auf Ergosterol), (B) Aflatoxin, und (C) wurden unter Verwendung conidiation oben beschriebenen Verfahren. E) und Aflatoxin (F) conidiation werden angezeigtin Abhängigkeit von pilzlicher Biomasse, wie durch h Ergosterol gemessen. F) Maximalwerte für Ergosterol, Aflatoxin Akkumulation und conidiation als Funktion der pilzlichen Biomasse - Maximalwerte für jede Menge beobachtet wurde auf 100% gesetzt. (H) 1 g pro Spur von Gesamt-RNA aus zeitlichen Verlauf.
Abbildung 3. Vertreter High Performance Liquid Chromatographie (HPLC)-Chromatogramme für Fumonisin B1 (oben) und Ergosterol (unten) aus Kernen mit Fusarium verticillioides (M3125) infiziert isoliert.
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Discussion
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Acknowledgments
Wir möchten Brandon Hassett und Carlos Ortiz für ihre technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde von der NSF Zuschüsse IOB-0544428, 0951272-IOS, IOS-0925561 und an Dr. Michael Kolomiets unterstützt und von der USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA), Afri Pflanzenzüchtung und Bildung Grant # 2010-85117 -20539 bis Drs. Seth Murray, Thomas Isakeit, und Michael Kolomiets.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientific | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Blender | Vicam | 20200 | |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 | |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 | |
| Afla Test column | Vicam | G1024 | |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 | |
| Methanol | Vicam | 35016 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | AC14952-0025 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC39769-0025 | |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientific | 60108-304 | |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma-Aldrich | 79760-5g | |
| Boric acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Sodium borate | Fisher Scientific | RDCS0330500 | |
| Mercapt–thanol | Fisher Scientific | 45-000-231 | |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Corporation | LC-20AT | |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Corporation | RF-10AXL | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | AC38987-0010 | |
| FB1 standards | Sigma-Aldrich | F1147-1mg | |
| Chloroform | VWR international | MK444410 | |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Corporation | 4426 | |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F | |
| Scintillation vials | VWR international | 66021-602 | |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
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