Summary
Ødeleggelsen av korn avlinger ved frø-smitte sopp har bedt en rekke forskningsinnsats for å bedre forstå plante-patogen interaksjoner. Å studere frø-sopp interaksjoner i et laboratorium setting, utviklet vi en robust metode for kvantifisering av sopp reproduksjon, biomasse, og mykotoksin forurensning ved hjelp av kernel bioassay.
Abstract
Den råtnende av korn ved frø-smitte sopp utgjør en av de største økonomiske utfordringene til kornproduksjon i verden, for ikke å nevne alvorlige risikoer for menneskers og dyrs helse. Blant kornproduksjon, er mais uten tvil den mest berørte avling, grunnet patogen-induserte tap i korn integritet og mykotoksin frø forurensning. De to mest utbredte og problematisk mykotoksiner for mais growers og mat og fôr prosessorer er aflatoksin og fumonisin, produsert av Aspergillus flavus og Fusarium verticillioides, henholdsvis.
Nyere studier i molekylære plante-patogen interaksjoner har vist lovende i å forstå spesifikke mekanismer knyttet til plante svar soppinfeksjon og mykotoksin forurensning 1,2,3,4,5,6. Fordi mange laboratorier bruker kernel-analyser for å studere plante-patogen interaksjoner, er det behov for en standardisert metode for å kvantifisere ulike biologiske parametre, såresultater fra ulike laboratorier kan kryss-tolket. For en robust og reproduserbar måte for kvantitative analyser på frø, har vi utviklet i-lab kernel analyser og påfølgende metoder for å kvantifisere soppvekst, biomasse, og mykotoksin forurensning. Fire steriliserte mais kjerner er inokulert i hetteglass med en sopp suspensjon (10 6) og inkubert for en forhåndsbestemt periode. Smak ampuller blir deretter valgt for telling av conidia av hemocytometer, ergosterol-basert biomasse analyse av høy ytelse væskekromatografi (HPLC), aflatoksin kvantifisering ved hjelp av en AflaTest fluorometer metode, og fumonisin kvantifisering av HPLC.
Protocol
1. Mais Kernel bioassay
- To uker før, kultur de sopp på potet Dextrose Agar (PDA) ved 28 ° C.
- Velg kjerner med samme størrelse og form, fortrinnsvis flate slik at de lå på nivå med bunnen av bioassay ampuller, og plass i 50 ml falcon rør. Kjerner utvalgte må ha blitt produsert samtidig i samme miljø for å sikre lik frø alder og metabolitt komposisjon.
- Overflaten sterilisere kjerner ved å riste rør i romtemperatur i 5 minutter med 70% etanol, 1 minutt med sterilt vann, og 10 minutter med 6% natriumhypokloritt. Skyll, tre ganger, i 5 minutter hver gang, med sterilt vann mens du fortsetter å riste. Pat kjerner tørre på autoklaveres håndklær.
- For å lette infeksjon av Aspergillus flavus, lage en liten sår på embryo-side med en 18 G nål til dybde på 0,5 cm. Men i vår erfaring en større sår er nødvendig for Fusarium verticillioides infeksjon. Therefore, bruke et barberblad til å skjære inn i embryo-side på en dybde på 0,5 mm.
- Forbered podestoff suspensjon ved å skrape dyrkede plater i ca 5 ml autoklaveres 0,01% Tween-20-løsning for å frigjøre sporer og fjerne mycel av tyngdekraften filtrere gjennom minst 4 lag autoklaveres cheesecloth. Beregn spore konsentrasjon med hemocytometer og justere til 10 6 sporer / ml for A. flavus eller F. verticillioides. Hvis du bruker andre arter av patogen eller vert, er det viktig å evaluere konsentrasjoner av podestoff for passende infeksjon.
- Lag en fuktighet kammer i en plastbeholder (29,2 cm x 18,7 cm x 8,3 cm) foret med fem ark papirhåndklær og 100 ml sterilt vann. Kammer er ikke vann eller luft-tett og ekstra vann skal legges gjennom eksperiment for å holde papirhåndklær fuktig.
- Plasser fire kjerner i en autoklaveres 20 ml glass scintillation hetteglass og registrere deres masse. Inokuler med 200 mL sporeoppløsning,cap, og virvle til jevnt coat kjerner med suspensjon. Løsne caps fritt tillate luftgjennomgang og sted inn fuktighet kammer.
Merk: For frø eller sopp enn de beskrevet i disse metodene, kan mengden av podestoff nødvendig være annerledes og bør være avledet eksperimentelt.
- Inkuber kjerner under en 12-h-light/12-h-dark fotoperiode ved 28 ° C i 7 dager eller til ønsket.
2. Conidia Bestemmelse
- Etter infeksjon perioden, tilsett 5 ml autoklaveres 0,01% Tween-20 til scintillation hetteglass som inneholder infiserte kjerner og vortex grundig i 1 minutt.
- Ved hjelp av en bred-boring pipettespissen, straks tynnes ved å overføre to separate 200 mL alikvoter av sporeoppløsning inn 2,0 ml Eppendorf rør som inneholder 1,8 ml av 0,01% Tween-20 (eller fortynne etter behov avhengig av infeksjon).
- Nummerere hver 200 mL delmengde to ganger med en hemocytometer 4og sammenligne nivåer av conidia mellom behandlingene.
3. Aflatoksin Kvantifisering
- Legg kjerner fra en prøve til 50 ml blender kopp med 20 ml 80% metanol og 0,05 g NaCl, dekning og blanding i høy hastighet i 1 min.
- Plasser en riflet filter papir over en ren beholder og hell pakke inn filteret.
- Overfør 10 ml av filtratet til rene kar, tilsett 20 ml destillert H 2 O, og bland godt.
- Filter prøven gjennom en 1,5 mikrometer glass mikrofiber filter i en ren kopp.
- Påfør 1 ml filtrert ekstrakt til Afla Test kolonne, og ved hjelp av trykkluft, tvinger det filtrerte uttrekket gjennom kolonnen med en hastighet på 1-2 dråper / sekund inntil tømt.
- Vask kolonnen to ganger med 1 ml destillert H 2 O og passere gjennom kolonnen ved 1-2 dråpe / sekund til luft kommer gjennom.
- Eluer kolonne med 1 ml 100% HPLC karakter metanol på en 1-2 dråpe / annenrangs samlet i et glass kyvette.
- Legg1 ml av Afla Test Developer til eluatet og bland godt. Plasser kyvetten inn kalibrert fluorometer og leste på 60 sek.
Merk: Når du bruker Aflatest FGIS protokollen, er målingen fra fluorometer beregnet basert på en innledende 50 gram prøve ut i 100 ml. Hvis du vurderer fortynning av prøven med vann, brukte 1 ml til en kolonne representerer 0,166 gram prøve. Så, når du endrer protokollen, må du ta hensyn til forskjeller i størrelsen på utvalget og den første utvinning løsning. For eksempel, er 2 gram kjerner ut i 20 ml 80% metanol. Dette er 0,1 gram / ml. Når 1 ml av denne prøven er blandet med 2 ml vann, er andelen av prøven i væsken nå 0,033 gram / ml. Hvis denne prøven gir en fluorometer lesning av 100 ppb, er den faktiske konsentrasjonen basert på andelen av prøven til 0.166, altså ppb = (0,166 gram X 100 ppb) / 0,1 gram), eller 166 ppb. For alternativ aflatoksin quantifisering metoder, se referanse 7.
4. Fumonisin B1 (FB1) Analyse
- Når sopp blir dyrket på mais kjerner, trekke ut prøvene over natten med 10 ml acetonitril / vann (50/50, v / v) ved romtemperatur uten omrøring. Deretter bland ekstraktet (2 ml) med avionisert vann (6 ml), og anvende denne blandingen (8 ml) direkte til C-18 fast fase ekstraksjon.
- Før du legger utvalget, forutsetning C-18 fast fase ekstraksjon kolonne ved å skylle med 2 ml acetonitril etterfulgt av 2 dl vann.
- Etter lasting prøven, blir kolonnen vaskes med 2 dl vann etterfulgt av 2 ml acetonitril / vann (15/85, v / v). Eksempel for HPLC analyse (som inneholder FB1) er elueres med 2 ml acetonitril / vann (70/30, v / v).
- Derivatize FB1 med o-phthaldehyde (OPA) ved å overføre 0,1 ml av kolonnen eluatet til en ampulle som inneholder 0,1 ml borate buffer (0.05 M borsyre acid/0.05 M natrium borate [50/50, v / v], pH 8,5) og 0,1 ml OPA (0,1 mg / ml i Acetonitrile med 0,5% - mercaptoethanol).
- Stopp reaksjonen etter 10 min ved å legge 0,5 ml acetonitrile/0.01 M borsyre (40/60, v / v).
- Analyser FB1 på en Shimadzu HPLC LC-20AT system utstyrt med en analytisk Zorbax ODS kolonne (4,6 150 mm) og en variabel bølgelengde Shimatzu RF-10Axl fluorescensdetektor (eksitasjon 335 nm / utslipp 440 nm).
- En lineær gradient er brukt (løsemiddel A: acetonitrile/0.1 M natriumfosfat (40/60), pH 3,3, løsemiddel B: acetonitril / 0,1 M natrium fosfat (60/40), 3,3 pH) og gradient Programmet er som følger: 100% A til 100% B i 10 min, 100% B for 5 min.
- Analyser FB1 standarder ved HPLC, og peak området målingene brukes til å generere standard kurve. Senere, kvantifisere FB1 nivå i en prøve ved å sammenligne peak områder med FB1 standardkurve.
5. Ergosterol Analyse
- Kultur soppen på korn kjerner for 7-14 dager.
- Etter inkubasjonstiden, tilsett 10 ml kloroform: methanol (2:1, v / v) i hvert hetteglass. Når lagt, riste prøvene godt og deretter inkuber hetteglassene i mørke ved romtemperatur i 24 timer.
- Etter 24 timer, sentrifuger prøvene, og samle supernatanten og filtrere det gjennom 0,45 um nylon membran.
- Injiser prøven direkte inn i en Shimadzu HPLC LC-20AT system utstyrt med en 4,6 U ODS-C18 kolonne (200 A, 250 ± 4,6 mm) og en Shimadzu SPD-20A UV / VIS-detektor satt til å overvåke på 282 nm.
- Bruk metanol (100%) ved en strømningshastighet på 1,5 ml / min som mobil fase. Bestem kvantifisering av ergosterol i prøvene ved å sammenligne topp områder av prøver til en standard kurve generert fra HPLC-grade ergosterol.
6. Representative Resultater
Etter inokulasjon og inkubasjon i en fuktighet kammer for to til tre dager, bør soppvekst begynne å vises på kjerner. Sju dager etter behandling, vegetativ vekst på behandlede planter skal være godt synlig, while mock kontrollene skal være infisert (figur 1B, øverst). Perioder med lengre inkubasjonstid er bidrar til mer innholdsrik vegetativ vekst (figur 1B, nederst). Under de forholdene som er beskrevet i dette dokumentet (figur 2G), A. flavus villtype NRRL 3357 viste maksimale verdier av kolonisering, aflatoksin akkumulering, og conidia produksjon på 8, 6 og 8 dager, henholdsvis (figur 2, AC). Men når mykotoksin forurensning og conidiation ble sammenlignet per enhet av ergosterol, ble de største nivåene observert på 4 og 6 dager, henholdsvis (figur 2, DE). Figur 2F oppsummerer disse sopp-biomasse-avhengige maksimal verdi observasjoner. Interessant, mellom 4-6 dager etter inokulasjon, kjernene gjennomgå nukleinsyre nedbrytning, som sett av total RNA fra prøver på den tiden-kurset (Figur 2H, nederst).
Flere studier, inkludert vårt eget, har foretatt ened F. verticilliodies infeksjon på mais kjerner 2,8,9,10,11,12 og brukt 7-13 dager som time-poeng for observasjoner. Bruk metodene beskrevet her, fumonisin nivåer varierer fra 3,500-8,000 ng / g kernel 4,13 og ergosterol nivåer utvalg fra 5,000-10,000 ng / g kernel 14,13. Figur 3 viser representative topper for fumonisin (øverst) og ergosterol (nederst ) fra HPLC kromatogrammer. Måling av ergosterol kan også utføres via absorbans spektra 15.
Figur 1. Flytskjema for kvantifisering av sopp biomasse, sporogenesis, og mykotoksin produksjon og representative resultater for vegetativ vekst fra kjernen bioassay. A) Flytskjema som beskriver den beskrevne metoden for kvantifisering av fundamentale biologiske parametre brukt til å vurdere sopp patogenesen på mais kjerner. B) Representantresultater for kernel bioassay. Topp, A. flavus (NRRL3357) vegetativ vekst på mais kjerner i B73 genetisk bakgrunn. Frø ble inokulert med 200 mL av 10 6 sporer / ml og bildene ble tatt 7 dager etter inokulasjon. Bottom, F. verticillioides inokulert kjerner i B73 bakgrunnen 13 dager etter smitte. Kjerner ble inokulert med 200 mL av 10 6 sporer / ml.
Figur 2. Aspergillus flavus kernel bioassay tid-kurs. B73-kjerner ble inokulert med 200 mL av 10 6 sporer / ml Aspergillus flavus conidial fjæring og inkuberes 2-8 dager (G). Alle verdier ble fastsatt fra den tørre vekten i gjennomsnitt 4 kjerner (n = 3-4; gjennomsnitt ± SE). A) Colonization (basert på ergosterol), (B) aflatoksin, og (C) conidiation ble kvantifisert etter metoder beskrevet ovenfor. E) Aflatoxin og (F) conidiation visessom en funksjon av sopp biomasse målt gjennom h ergosterol. F) maksimumsverdier for ergosterol, aflatoksin akkumulering, og conidiation som en funksjon av sopp biomasse - maksimumsverdier for hver mengde observert ble satt til 100%. (H) 1 mikrogram per kjørefelt av total RNA fra tid-kurs.
Figur 3. Representative High Performance væskekromatografi (HPLC) kromatogrammer for fumonisin B1 (øverst) og ergosterol (nederst) isolert fra kjerner infisert med Fusarium verticillioides (M3125).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Brandon Hassett og Carlos Ortiz for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet ble støttet av NSF tilskudd IOB-0544428, IOS-0951272, og IOS-0925561 Dr. Michael Kolomiets, og av USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA), Afri planteforedling og utdanning Grant # 2010-85117 -20539 til legene. Seth Murray, Thomas Isakeit, og Michael Kolomiets.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientific | S71659A | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 | |
| Blender | Vicam | 20200 | |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 | |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 | |
| Afla Test column | Vicam | G1024 | |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 | |
| Methanol | Vicam | 35016 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | AC14952-0025 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC39769-0025 | |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientific | 60108-304 | |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma-Aldrich | 79760-5g | |
| Boric acid | Fisher Scientific | BP168-500 | |
| Sodium borate | Fisher Scientific | RDCS0330500 | |
| Mercapt–thanol | Fisher Scientific | 45-000-231 | |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Corporation | LC-20AT | |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 | |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Corporation | RF-10AXL | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | AC38987-0010 | |
| FB1 standards | Sigma-Aldrich | F1147-1mg | |
| Chloroform | VWR international | MK444410 | |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Corporation | 4426 | |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F | |
| Scintillation vials | VWR international | 66021-602 | |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
- Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
- Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
- Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
- Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
- Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
- Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
- Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
- Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
- Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
- Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
- Shim, W. -B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
- Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
- Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).
- Shin, J. -H., Shim, W. -B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
- Breivik, O. N., Owades, J. L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).
