Summary
وصفت طريقة بسيطة لتحليل الآثار المترتبة على الأنسجة الليفية في الخلايا الظهارية المرتبطة بها. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة وثلاثي الأبعاد زراعة الأنسجة تسهيل تحليل الخلايا بعد العزلة من 3D. هذه التقنية قابلة للتطبيق على خلايا مختلفة المحتملة الخبيثة، مما يسمح للدراسة منهجية للآثار ورم المرتبطة سدى على الخلايا السرطانية.
Protocol
1. تأسيس ثلاثي الأبعاد المشارك الثقافات
- قبل يوم من إقامة المؤسسات المشتركة في الثقافات، وإزالة Matrigel من الفريزر وذوبان الجليد على الجليد في الثلاجة 4 درجات مئوية خلال الليل.
- في يوم من التجربة، وإعداد وسيلة للثقافة المشتركة، والتي تتطابق مع متوسط للخلايا الظهارية لاستخدامها (وسط HMEC في هذا المثال: DME/F12 المتوسط مع 10٪ مصل العجل البقري، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين ، 1 ميكروغرام / مل الهيدروكورتيزون، و1 نانوغرام / مل EGF). الحفاظ على المتوسط في ساعة على الأقل 1 الجليد قبل الاختلاط مع Matrigel.
- لتخفيف Matrigel إذابة، وتحديد الكمية الإجمالية المطلوبة من Matrigel: متوسطة (300 ميكرولتر لكل بئر لمدة 24 جيدا لوحات)، ويضاف نصف هذا الحجم من الثلج الباردة المتوسطة HMEC إلى أنبوب معقم على الجليد. ثم يضيف نفس نصف مجموع حجم Matrigel إذابة للأنبوب لتحقيق تخفيف 1:1. الحفاظ على أنبوب على الجليد.
- مكان 50 ميكرولتر من Matrigel: خليط المتوسطة منتصف جيدا في الآبار المخصصة لوحة 24-جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية مع مرطب الهواء، و 5٪ CO 2.
- إضافة مبلغ إضافي 450 ميكرولتر من Matrigel: خليط المتوسطة إلى الآبار واحتضان لمدة 60 دقيقة.
- أثناء الحضانة، وإعداد وتعليق 01:01 من الخلايا الليفية (هنا لحد من الخلايا الليفية H-ثالثي خلد الثديية معربا عن GFP) والخلايا الظهارية (هنا الإنسان الثديية H-ثالثي خلد خط الخلايا الظهارية معربا عن RFP) بتركيز 0.5 × 10 5 خلايا في كل 0.5 مل من المتوسط HMEC.
- بعد الخطوة حضانة لمدة 60 دقيقة، وانخفاض بلطف تعليق الخلية على الجزء العلوي من هلام طدت، والعودة إلى ثقافة الحاضنة.
- لا تعكر صفو الثقافات لمدة 2 ايام. بعد هذا، يمكن تغيير كل 2-3 أيام المتوسط بواسطة الشفط جدا بلطف المتوسطة من جانب جيدا وبلطف مع استبدال المتوسطة HMEC الطازجة.
- رصد تشكيل كروي يوميا تحت المجهر. الثقافات عادة ما تكون ناضجة بعد 10-14 يوما. الصورة كماالمناسبة باستخدام ضوء الفلورسنت أو المجهري. ويمكن قياس حجم كروي وطول إسقاط تحت المجهر الضوئي.
2. عزل خلايا من الجسم الشبه الكروي المشارك الثقافات
- بلطف شديد، ماصة للثقافة صعودا ونزولا 10X باستخدام معقم ماصة الزجاج 2 مل. بدلا من ذلك، قطع غيض من طرف ميكروليتر 1000 ماصة بلاستيكية معقمة باستخدام مقص أو عن طريق جهاز الأوتوكليف الانغماس في الايثانول 70٪ من أجل ماصة للثقافة. نقل ثقافة إما مع ماصة الزجاج أو خفض رأس ماصة بلاستيكية معقمة إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 2000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. ستقوم الأجسام الشبه الكروية الخلوية الرواسب في القاع.
- استخدام معقم طرف ماصة باستير لإزالة بلطف Matrigel تعطلت من الجزء العلوي من أنبوب يتم طرده مركزيا.
- إضافة 1 مل المتوسطة HMEC إلى مكعبات الأجسام الشبه الكروية، ماصة صعودا وهبوطا 2-3 مرات مع معقم 2 ماصة زجاج مل، ونقل الثقافة إلى بئر في بئر-24نسيج لوحة الثقافة.
- السماح للالأجسام الشبه الكروية لتعلقها على طبق ما لا يقل عن 48 ساعة قبل تغيير المتوسطة. مع مرور الوقت سوف الخلايا ترك الهياكل كروي وتنمو كما monolayers.
- مرور الخلية الثقافات عندما تصل إلى نقطة التقاء الخلايا بنسبة 50٪. أولا إظهار الثقافة إلى صحن 35 ملم (حوالي 2-4 أيام)، ثم إلى صحن 100 ملم (حوالي 3-5 أيام). مباشرة قبل مرور كل خطوة، واستخدام معقم باستور ماصة لإزالة يدويا كما كثير المتبقية "الأجسام الشبه الكروية الأشباح" قدر الإمكان.
- تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي لنقاء السكان الذين يستخدمون المناسبة علامات سطح الخلية، وكذلك فصل السكان خلية مختلفة عن طريق الفرز الخلية مضان إذا لزم الأمر. خلايا معزولة الآن على استعداد لمزيد من التحليل على النحو المرغوب فيه.
3. ممثل النتائج
في ثلاثي الأبعاد كروي شارك في الثقافات، والخلايا الليفية مع إسكات Tiam1 هندسيا لحث على غزو زيادة في درجة الماجستيرتريكس بواسطة الخلايا الظهارية الثديية (الشكل 1، مقارنة D، E، F إلى A، B، C). الليفية مع المهندسة الإفراط في التعبير عن Tiam1 حث انخفض غزو مصفوفة من قبل خلية خط سرطان الثدي SUM159 (الشكل 1، مقارنة J، K، L إلى G، H، I).
مرة واحدة وضعت التعاون مثقف الأجسام الشبه الكروية، يمكن عزل السكان خلية من الأجسام الشبه الكروية من قبل إعادة الطلاء في سياق ثنائي الأبعاد، كما هو مبين في الشكل 2. اعتمادا على معدلات النمو النسبي للخلايا اختبار، قد تظهر من خلال السكان محض مرور مسلسل (كما هو موضح في الشكل 3) أو يمكن فرز باستخدام علامات الخلية المناسبة. بعد عزلة من 3D المشترك والثقافة، والخلايا الظهارية الإبقاء على الخصائص التي تمنحها الثقافة بالتعاون مع الخلايا الليفية على مدى فترات طويلة من الوقت، مما يتيح فرصة واسعة للتحليل. في هذا المثال، التي يسببها التعرض للTiam1 التي تعاني من نقص الخلايا الليفية تزايد الهجرة في التعاون مثقف HMECs التي استمرت لأسابيعfter بمعزل عن ثقافة مشتركة 3D (الشكل 4).
الشكل 1. التصوير من وضع كروي شارك في ثقافات تحت المجهر الضوئي ومضان. وتنشأ الثقافات كروي مع الثدي خطوط الخلايا الظهارية والخلايا الليفية، وسمحت للنمو في الثقافة لمدة 10-14 يوما. AF: الظهارية = HMEC-mCherry الخلايا. GL: الخلايا الظهارية = SUM159-mCherry الخلايا. AC، GI: الليفية = سيطرة RMF-GFP الخلايا. DF: الليفية = RMF-GFP مع Tiam1 إسكات. JL: الليفية = RMF-GFP مع Tiam1 الإفراط في التعبير. الأسهم تشير التوقعات الظهارية الغازية في المصفوفة.
الشكل 2. تصوير المسلسل بين الثقافات تحت المجهر الضوئي ومضان بعد بمعزل عن ثقافة Matrigel. يوم 0 يمثل التصوير مباشرة بعد العزلة؛ أيام 1 و 2 و5 تبين بعد أيام من العزلة. الهالة من الخلايا ترك زيادات كروي على مر الزمن. في نهاية المطاف "الأشباح" كروي مع عدد قليل جدا من الخلايا لا يزال (السهم). الأجسام الشبه الكروية عدد قليل جدا من تبقى بعد إزالة شبح والمقطع الاول.
الرقم التدفق الخلوي 3. تحليل الخلايا بعد العزلة من Matrigel شارك في الثقافة. بعد كروي شارك في الثقافات قد نضجت، يتم عزل الخلايا من 3D التعاون مع ثقافة pipetting المسلسل والركض. ويتم تحليل عينة من aliquots التدفق الخلوي (في هذا المثال باستخدام مضان أخضر مضان والحمراء لتحديد GFP، معربا عن الخلايا الليفية وmCherry في التعبير عن الخلايا الظهارية على التوالي) لتحديد السكان النسبي الخلايا الطلائية والخلايا الليفية.
الشكل 4. Transwell هجرة HMECs استمرت بعد isolatiعلى من Matrigel شارك في الثقافة. مرة واحدة قد تم الحصول عليها من السكان من خلال ثقافة نقية أو مضان الفرز الخلية، يمكن تحليل الخلايا على النحو المرغوب فيه. هنا تم تقييم هجرة HMECs التعاون مع أي مثقف التحكم (C) أو Tiam1 ناقص (SHT) الليفية عبر transwells مثقب في الأسابيع 2 و 4 و 8 بعد بمعزل عن ثقافة مشتركة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة المعروضة هنا يمثل نهجا بسيطة لتحليل آثار الليفية اللحمية في الخلايا الظهارية، بما في ذلك الخلايا السرطانية. لأنها تتيح للتفاعل الخلية خلية مباشرة في سياق ثلاثي الأبعاد بدعم من خارج الخلية المصفوفة غشاء السرداب، في حين تمكن سهل الاستخراج من الخلايا من مصفوفة لمزيد من التحليل. ويمكن تطبيق هذا على دراسة ورم المرتبطة سدى، كما يمكن التلاعب بها خطوط الخلايا الليفية للتأثير على مسارات إشارات من خيار وخطوط الظهارية يمكن أن تختلف في إمكانية الغازية، كما هو مبين في الشكل رقم 1. و3D شارك في ثقافة نموذج يسمح للتحقق البصرية التي تم حدوث تغيرات في الخلية الغازية. بروتوكول العزلة يسمح لاستخراج الخلايا من الثقافات 3D مع حد أدنى من التعامل والابتعاد عن استخدام التربسين أو مصفوفة بحل العوامل التي قد تؤثر على خصائص الخلية. آثار التعرض إلى الخلايا الليفية في 3D شارك في ثقافة لا تزال قائمة في الخلايا الظهارية في الخلفإيه بمعزل عن ثقافة مشتركة 3D، وتسهيل تحليل لاحقة (الشكل 4). في حين أن المثال هو موضح هنا يصور الآثار المترتبة على هجرة الخلية، ويمكن استخدام أي فحص ينطبق على خلايا تنمو في 2D على خلايا معزولة. وقد استخدمنا هذه الطريقة لتحليل تأثيرات متفاوتة الليفية Tiam1 التعبير على سلوك الخلايا الظهارية المرتبطة الثديية. Tiam1 نقص في الخلايا الليفية يعزز الثديية غزو الخلايا السرطانية وورم خبيث في ثقافة 3D والنماذج الحيوانية ورم 23. وقد مكن هذا الأسلوب لنا لتحليل إمكانية استخدام الممرات المشتركة المقايسات الجزيئية، الكيمياء الحيوية، والوظيفية (ليو وBuchsbaum، تحت الطبع).
من المهم لاستخدام خطوط الخلايا فقط في حالة صحية ممتازة والالتزام تقنية معقمة صرامة من أجل منع تلوث الثقافات خلال هذه العملية. ويتم الحصول على أفضل النتائج باستخدام خلايا من المبكر بدلا من المقاطع في وقت متأخر (ودقيق عدد مرور تختلف تبعا لspecifIC خط خلوي)، والتي تحصد من الخلايا الموجودة بكثافة بين التقاء 50-80٪. دقة المناولة من Matrigel وفقا لبروتوكول هو المفتاح من أجل تسهيل كلا تسييله كاملة قبل وضع المشترك الثقافات وضمان ترسيخ شامل للمصفوفة قبل بالإضافة للخلايا. وكمية غير كافية أو التصلب من المصفوفة ينتج في الخلايا متزايد باعتباره أحادي الطبقة وليس في الأجسام الشبه الكروية في الثقافات. عند تأسيس أول كروي شارك في الثقافات، والتنسيب من المكونات الأولية 50 ميكرولتر في البئر يسمح لترسيخ الصلبة ترسيخ وموحدة أكثر من المصفوفة النهائية، وهو أمر أساسي لتكوين كروي موزعة بالتساوي. إزالة جميع الأجسام الشبه الكروية شبح في خطوات مرور ما بعد العزلة أمر بالغ الأهمية إذا الفرز الآلي الخلية لاستخدامها في فصل المختلطة السكان. الأمثلة المعروضة هنا استخدام الفينول الحمراء Matrigel الحرة مع تركيب البروتين حوالي 10 ملغ / مل. إعداد الفينول الحمراء الحرة تسمح للكشف عن اللون في أساYS، مثل مضان.
ويمكن تطبيق هذه التقنية لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا من أجل دراسة آثار الليفية في انسجة يرتبط بها من أورام الخلايا الظهارية أو على العكس من الآثار المترتبة على الخلايا السرطانية في الخلايا الليفية المرتبطة بها. هذا الأسلوب يسمح للتقييم السريع للفي نماذج خلية المختبر تحت ظروف متعددة، ويمكن بعد ذلك على نتائج المقابلة يمكن مقارنة النماذج الحية في الأنسجة الحيوانية، فضلا عن عينات الأنسجة البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Semin. Cancer Biol. 15, 365-377 (2005).
- Li, H., Fan, X., Houghton, J. Tumor microenvironment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem. 101, 805-815 (2007).
- Tse, J. C., Kalluri, R. Mechanisms of metastasis: epithelial-to-mesenchymal transition and contribution of tumor microenvironment. J. Cell Biochem. 101, 816-829 (2007).
- Bhowmick, N. A. TGF-beta signaling in fibroblasts modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science. 303, 848-851 (2004).
- Bhowmick, N. A., Moses, H. L.
- Havlickova, B., Biro, T., Mescalchin, A., Arenberger, P., Paus, R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions. Br. J. Dermatol. 151, 753-765 (2004).
- Kilani, R. T. Selective cytotoxicity of gemcitabine in bladder cancer cell lines. Anticancer Drugs. 13, 557-566 (2002).
- Seidl, P., Huettinger, R., Knuechel, R., Kunz-Schughart, L. A. Three-dimensional fibroblast-tumor cell interaction causes downregulation of RACK1 mRNA expression in breast cancer cells in vitro. Int. J. Cancer. 102, 129-136 (2002).
- Silzle, T. Tumor-associated fibroblasts recruit blood monocytes into tumor tissue. Eur. J. Immunol. 33, 1311-1320 (2003).
- Bartling, B., Demling, N., Silber, R. E., Simm, A. Proliferative stimulus of lung fibroblasts on lung cancer cells is impaired by the receptor for advanced glycation end-products. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 34, 83-91 (2006).
- Kunz-Schughart, L. A. Potential of fibroblasts to regulate the formation of three-dimensional vessel-like structures from endothelial cells in vitro. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290, C1385-C1398 (2006).
- Liu, T., Lin, B., Qin, J. Carcinoma-associated fibroblasts promoted tumor spheroid invasion on a microfluidic 3D co-culture device. Lab Chip. 10, 1671-1677 (2010).
- Zengel, P. Multimodal therapy for synergic inhibition of tumour cell invasion and tumour-induced angiogenesis. BMC Cancer. 10, 92-92 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Heyder, P., Schroeder, J., Knuechel, R. A heterologous 3-D coculture model of breast tumor cells and fibroblasts to study tumor-associated fibroblast differentiation. Exp. Cell Res. 266, 74-86 (2001).
- Djordjevic, B., Lange, C. S. Cell-cell interactions in spheroids maintained in suspension. Acta Oncol. 45, 412-420 (2006).
- Hirschhaeuser, F. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Hoevel, T., Macek, R., Swisshelm, K., Kubbies, M. Reexpression of the TJ protein CLDN1 induces apoptosis in breast tumor spheroids. Int. J. Cancer. 108, 374-383 (2004).
- Paduch, R., Kandefer-Szerszen, M. Vitamin D, tamoxifen and beta-estradiol modulate breast cancer cell growth and interleukin-6 and metalloproteinase-2 production in three-dimensional co-cultures of tumor cell spheroids with endothelium. Cell. Biol. Toxicol. 21, 247-256 (2005).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol. Med. 140, 141-151 (2007).
- Foty, R. A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720-e2720 (2011).
- Xu, K. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene. 29, 6533-6542 (2010).
