Summary
Um método simples é descrita para analisar os efeitos da fibroblastos de tecido em associadas células epiteliais. A combinação deste método eo tridimensional de cultura de tecido pode facilitar a análise das células após o isolamento a partir de 3D. A técnica é aplicável a células de diferentes potencial maligno, permitindo estudo sistemático dos efeitos de estroma associado ao tumor em células tumorais.
Abstract
Enquanto os esforços enormes ter ido para identificar vias de sinalização e moléculas envolvidos em comportamentos de células normais e malignas 1-2, muito desse trabalho tem sido feito utilizando clássicos modelos bidimensionais de cultura de células, que permitem a manipulação de células fácil. Tornou-se claro que as vias de sinalização intracelulares são afetados por forças extracelulares, incluindo dimensionalidade e tensão da superfície da célula 3-4. Várias abordagens têm sido tomadas para desenvolver modelos tridimensionais que representam mais precisamente arquitetura biológica tecido 3. Embora estes modelos incorporam multidimensionalidade e sublinha arquitetônicas, estudo de consequentes efeitos sobre células é menos fácil do que no bidimensional cultura de tecidos, devido às limitações dos modelos e da dificuldade em extrair células para análise posterior.
O importante papel do microambiente em torno de tumores na tumorigênese e comportamento tumoral iEstá se tornando cada vez mais reconhecida 4. Estroma tumoral é composto por vários tipos de células e moléculas extracelulares. Durante o desenvolvimento do tumor existem sinais bidireccionais entre as células tumorais e células estromais 5. Apesar de alguns factores que participam no tumor-estroma co-evolução foram identificados, há ainda uma necessidade de desenvolver técnicas simples para identificar sistematicamente e estudar a matriz completa destes 6 sinais. Os fibroblastos são o tipo de célula mais abundante no normais ou associado ao tumor tecidos do estroma, e contribuir para a deposição e manutenção da membrana basal e factores de crescimento parácrinos 7.
Muitos grupos têm utilizado sistemas de cultura de três dimensões para estudar o papel de fibroblastos em várias funções celulares, incluindo a resposta do tumor à terapias, o recrutamento de células imunitárias, as moléculas de sinalização, a proliferação, a apoptose, angiogénese e invasão 8-15. Nós otimizamos um método simples para burroessing os efeitos de fibroblastos mamarias em células epiteliais mamárias utilizando um modelo de matriz extracelular comercialmente disponível para criar tridimensionais culturas de populações de células mistas (co-culturas) 16-22. Com continuada co-cultura das células formam esferóides com a aglomeração fibroblastos no interior e as células epiteliais em grande parte, no exterior dos esferóides e formando multicelulares projecções na matriz. Manipulação dos fibroblastos que leva a capacidade de invasão de células epiteliais alteradas pode ser facilmente quantificado por alterações no número e comprimento das projecções epiteliais 23. Além disso, desenvolveram um método para isolamento de células epiteliais de tridimensional co-cultura que facilita a análise dos efeitos da exposição de fibroblastos no comportamento epitelial. Verificou-se que os efeitos da co-cultura persistir durante semanas após o isolamento das células epiteliais, permitindo tempo suficiente para realizar os ensaios múltiplos. Este método é adaptável a células devariando potencial maligno e não requer equipamento especializado. Esta técnica permite a avaliação rápida em modelos de células in vitro sob várias condições, e os resultados correspondentes podem ser comparados com modelos animais in vivo de tecidos, bem como amostras de tecidos humanos.
Protocol
1. Estabelecer tridimensionais Co-culturas
- No dia anterior, que estabelece os co-culturas, remover o Matrigel do congelador e descongelamento em gelo em um 4 ° C frigorífico durante a noite.
- No dia da experiência, preparar o meio de co-cultura, o que corresponde à média para as células epiteliais para ser utilizados (HMEC médio neste exemplo: DME/F12 meio com 10% soro de vitelo, 5 ug / mL de insulina , 1 ug / mL de hidrocortisona, e 1 ng / mL EGF). Manter o meio em gelo horas, pelo menos, 1 antes da mistura com Matrigel.
- Para diluir o Matrigel descongelado, determinar a quantidade total desejado de Matrigel: médio (300 uL por poço de placas de 24 poços) e adicionar metade do volume que de gelado médio HMEC para um tubo estéril em gelo. Em seguida, adicionar o volume meia-mesmo total de Matrigel descongelado para o tubo para atingir uma diluição de 1:1. Manter o tubo em gelo.
- UL lugar 50 de Matrigel: mistura médio meados de bem em poços designadas de uma placa de 24 poços eincubar durante 10 min em um 37 ° C incubadora com ar humidificado e 5% de CO 2.
- Adicionar uma uL 450 adicional de Matrigel: mistura meio aos poços e incubar durante mais 60 minutos.
- Durante o período de incubação, preparar uma suspensão de 1:1 de fibroblastos (aqui Fibroblastos h-TERT-imortalizadas redução mamária que expressam GFP) e as células epiteliais (aqui h-TERT-imortalizada linha celular humana mamária epitelial expressando RFP) com um concentração de 0,5 x 10 5 células cada, em 0,5 ml de meio de HMEC.
- Após o passo incubação 60 minutos, cuidadosamente gota a suspensão da célula para a superfície do gel, solidificado, e voltar a cultura para a incubadora.
- Não perturbar as culturas de 2 dias. Depois disto, meio pode ser trocado a cada 2-3 dias por meio de aspiração muito suavemente a partir do lado do poço e suavemente substituindo com meio HMEC fresco.
- Monitorar formação esferóide diariamente sob microscopia. As culturas são geralmente madura após 10-14 dias. Imagem comoapropriada usando luz ou microscopia de fluorescência. Tamanho esferoidal e comprimento de projecção pode ser medido por microscopia óptica.
2. Isolamento de Células de esferoidal co-culturas
- Muito delicadamente, pipetar a cultura cima e para baixo 10x utilizando uma agulha estéril 2-mL pipeta de vidro. Alternativamente, cortou a ponta de uma ponta de pipeta de plástico 1000 microlitro com tesoura esterilizados por autoclave ou imersão em etanol a 70%, a fim de pipetar a cultura. Transferir a cultura quer com o vidro pipeta ou a ponta de pipeta de plástico cortada para um tubo de centrífuga estéril de 15 ml e centrifugar durante 5 min a 2000 rpm à temperatura ambiente. Os esferóides celular vai sedimento no fundo.
- Usar uma ponta de pipeta Pasteur estéril para remover suavemente o Matrigel interrompido a partir do topo do tubo centrifugada.
- Adicionar 1 ml de meio HMEC para os esferóides peletizadas, pipetar cima e para baixo 2-3 vezes com uma solução estéril de 2 mL de vidro pipeta, e transferir a cultura para um bem em um de 24 poçosplaca de cultura de tecido.
- Permita que os esferóides para anexar ao prato por pelo menos 48 horas antes de mudar o meio. Ao longo do tempo das células vai deixar as estruturas esferoidais e crescer como monocamadas.
- Passagem da célula culturas quando as células chegam confluência de 50%. Primeiro expandir a cultura para um prato de 35 mm (aproximadamente 2-4 dias), e depois para um prato de 100 mm (aproximadamente 3-5 dias). Imediatamente antes de cada etapa passagem, use uma pipeta de Pasteur estéril para remover manualmente como muitos residuais "esferóides fantasmas" quanto possível.
- Analise as células por citometria de fluxo para a pureza população usando marcadores de células apropriadas de superfície e separar ainda mais diferentes populações de células por separação de células por fluorescência, se necessário. As células isoladas são agora pronto para posterior análise, como desejado.
3. Os resultados representativos
Em tridimensional esférica co-culturas, fibroblastos com silenciamento Tiam1 engenharia induzir invasão aumentou em matrix por células epiteliais mamárias (Figura 1, compare D, E, F para A, B, C). Fibroblastos com engenharia a sobre-expressão de Tiam1 induzir invasão da matriz diminuiu a linha celular do cancro da mama SUM159 (Figura 1, compare J, K, L e G, H, I).
Uma vez que a co-cultura de esferóides foram estabelecidas, populações de células podem ser isoladas a partir de esferóides por re-plating num contexto bidimensional, como mostrado na Figura 2. Dependendo das taxas de crescimento relativo das células testadas, populações puras podem emergir através da passagem de série (como mostrado na Figura 3) ou podem ser classificados usando marcadores de células adequadas. Após o isolamento a partir de 3D co-cultura, células epiteliais reter as propriedades conferidas por co-cultura com fibroblastos ao longo de períodos de tempo prolongados, permitindo uma ampla oportunidade para análise. Neste exemplo, a exposição a Tiam1 deficientes em fibroblastos induzida o aumento da migração em co-cultivados HMECs que persistiu durante semanas umepois de isolamento a partir de 3D co-cultura (Figura 4).
Figura 1. Imagem de esferóide estabelecido co-culturas sob microscopia de luz e de fluorescência. Culturas esferóides são estabelecidos com mamárias linhas de células epiteliais e fibroblastos e deixadas a crescer em cultura durante 10-14 dias. AF: epiteliais = HMEC-mCherry células. GL: células epiteliais = SUM159-mCherry células. CA, GI: controle de fibroblastos = RMF-GFP células. DF: fibroblastos = RMF-GFP com Tiam1 silenciamento. JL: fibroblastos = RMF-GFP com Tiam1 sobre-expressão. As setas indicam projeções epiteliais invasoras na matriz.
Figura 2. Imagiologia Serial de culturas sob microscopia de luz e de fluorescência após o isolamento a partir de cultura de Matrigel. Dia 0 representa imagem imediatamente após o isolamento; dias 1, 2 e5 indicam os dias após o isolamento. A coroa de células que saem dos aumentos esferóides ao longo do tempo. Eventualmente, um "fantasma" esferóide com muito poucas células, permanece (seta). Esferóides muito poucos permanecem após a remoção do fantasma e da primeira passagem.
Figura 3. Análise de citometria de fluxo de células após o isolamento a partir de Matrigel co-cultura. Depois de esferóide co-culturas amadureceram, as células são isoladas a partir do 3D co-cultura com pipetagem e serial passaging. Alíquotas de amostra são analisadas por citometria de fluxo (neste exemplo, utilizando fluorescência de fluorescência e vermelho verde para identificar GFP-expressando fibroblastos e mCherry-expressando células epiteliais, respectivamente) para determinar as populações relativas de células epiteliais e fibroblastos.
Figura 4. Transwell migração de HMECs persiste após isolatia partir de Matrigel co-cultura. Uma vez que populações puras foram obtidos através da cultura ou separação de células por fluorescência, as células podem ser analisadas, como desejado. Aqui a migração de HMECs co-cultivadas com quer de controlo (C) ou Tiam1 deficientes (THA) fibroblastos em toda transwells perfuradas foi avaliada em 2 semanas, 4 e 8 após o isolamento a partir de co-cultura.
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Discussion
O método aqui apresentado representa uma abordagem simples para analisar os efeitos de fibroblastos estromais em células epiteliais, incluindo as células tumorais. Ela permite a interacção célula-célula directa dentro de um contexto tridimensional suportado por matriz extracelular da membrana basal, enquanto permite a extracção fácil de células a partir da matriz para análise posterior. Isto pode ser aplicada ao estudo de estroma associado ao tumor, como linhas de fibroblastos podem ser manipuladas para afectar as vias de sinalização de escolha e linhas epiteliais podem variar em potencial invasivo, como mostrado na Figura 1. O modelo de co-cultura 3D permite a verificação visual que as alterações na capacidade de invasão de células foram induzidas. O protocolo de isolamento permite a extracção de células a partir das culturas em 3D com um mínimo de manipulação e evita o uso de tripsina ou de matriz de dissolução agentes que podem afectar as propriedades da célula. Os efeitos da exposição a fibroblastos em 3D co-cultura persistir nas células epiteliais de popaer isolamento a partir de 3D co-cultura, facilitando a análise subsequente (Figura 4). Embora o exemplo mostrado aqui representa efeitos sobre a migração de células, qualquer ensaio aplicável a células que crescem em 2D pode ser usado nas células isolado. Temos utilizado este método para analisar os efeitos de diferentes expressão de fibroblastos Tiam1 sobre o comportamento dos associados células epiteliais mamárias. Tiam1 A deficiência em fibroblastos promova invasão de células de tumor mamário e metástase em cultura 3D e modelos animais de tumores 23. Este método permitiu-nos para analisar potenciais vias envolvidas utilizando ensaios molecular, bioquímica, e funcional (Liu e Buchsbaum, no prelo).
É importante a utilização de linhas de células apenas com excelente saúde e para aderir a uma técnica estéril rigorosa, a fim de evitar a contaminação das culturas durante o processo. Os melhores resultados são obtidos usando células de início em vez de passagens tardios (número exacto passagem irá variar dependendo da especicélulas ic linha celular) e de colhidas em densidades entre 50-80% confluência. Manipulação precisa de Matrigel acordo com o protocolo é a chave para facilitar tanto liquefação completa antes de estabelecer a co-cultura, para assegurar a solidificação completa da matriz antes da adição das células. Quantidade inadequada ou de solidificação da matriz irá resultar em células que crescem como uma monocamada em vez do que em esferóides nas culturas. Quando a primeira, que estabelece o esferóide co-cultura, o posicionamento de uma tampa 50 uL inicial no poço permite solidificação sólido ancoragem e mais uniforme da matriz final, que é a chave para uniformemente distribuída formação esferóide. Remoção de todos os esferóides fantasma na passos pós-isolamento de passagem é crítica se a classificação de células automatizado é para ser usado para separar populações mistas. Os exemplos mostrados aqui usar fenol vermelho-Matrigel livre com a composição de proteína de aproximadamente 10 mg / ml. A preparação fenol vermelho sem permite a detecção de cor em assays, tal como fluorescência.
Esta técnica pode ser aplicada a uma variedade de tipos de células, a fim de estudar os efeitos de fibroblastos estromais sobre associadas tumores de células epiteliais, ou inversamente os efeitos de células tumorais sobre os fibroblastos associados. Esta técnica permite a avaliação rápida em modelos de células in vitro sob várias condições, e os resultados correspondentes pode então ser comparado com modelos animais in vivo de tecidos, bem como amostras de tecidos humanos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
References
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