Biology

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

Published: April 30, 2012 doi: 10.3791/3760

¹Molecular Oncology Research Institute, Department of Medicine, Tufts Medical Center

Summary

השיטה פשוטה מתוארת לניתוח השפעות fibroblasts רקמה על תאים אפיתל הכרוכים בכך. השילוב של שיטה זו, תלת מימדי התרבות רקמת יכול להקל על ניתוח של תאים לאחר במנותק מן 3D. הטכניקה היא החלה על תאים שונים של פוטנציאל ממאיר, המאפשר לימוד שיטתי של השפעות stroma הגידול הקשורים על תאים סרטניים.

Abstract

למרות מאמצים אדירים הושקעו בזיהוי מסלולי איתות ומולקולות מעורבים בהתנהגויות סלולריים רגילים וממאירים ^1-2, את רוב העבודה הדבר נעשה באמצעות קלאסיות דו מימדי תרבות דגמים סלולריים, המאפשרים מניפולציה התא קל. זה הפך להיות ברור כי מסלולי איתות תאיים מושפעים על ידי כוחות תאיים, כולל ממדיות ואת שטח פני התא המתח ^3-4. גישות רבות ננקטו כדי לפתח דגמים תלת ממדיים, כי יותר נכון לייצג את הרקמה ביולוגית ארכיטקטורת ^3. בעוד המודלים האלה לשלב ממדיות רב מדגיש אדריכליים, חקר את ההשפעות הנובעות מכך על תאים הוא קליל פחות בתרבות דו מימדי רקמות בשל המגבלות של המודלים ואת הקושי להפיק תאים לצורך ניתוח מאוחר יותר.

תפקיד חשוב של microenvironment סביב גידולים tumorigenesis והתנהגות הגידול אניזה הופך מוכר יותר ויותר ^4. Stroma הגידול מורכב מספר רב של סוגי תאים ומולקולות תאיים. במהלך התפתחות גידולים קיימים אותות דו כיוונית בין תאים סרטניים ותאים סטרומה ^5. אף על פי כמה גורמים שהשתתפו האבולוציה שיתוף גידולים stroma זוהו, עדיין יש צורך לפתח טכניקות פשוטות באופן שיטתי לזהות וללמוד מערך מלא של אותות אלה ^6. Fibroblasts הם סוג התא הנפוץ ביותר ברקמות סטרומה רגילים או גידולים הקשורים, ולתרום בתצהיר ותחזוקה של קרום המרתף גורמי גדילה paracrine ^7.

קבוצות רבות השתמשו בשלוש מערכות תרבות מימדי כדי לחקור את תפקידה של fibroblasts על תפקודים תאיים שונים, לרבות תגובת הגידול לטיפולים, גיוס של תאים חיסוניים, מולקולות איתות, התפשטות, אפופטוזיס, אנגיוגנזה, ופלישה ^8-15. יש לנו אופטימיזציה שיטה פשוטה התחתessing את ההשפעות של fibroblasts החלב על תאים אפיתל החלב באמצעות מודל זמין מסחרית תאי מטריקס ליצור תלת ממדי תרבויות של אוכלוסיות תאים מעורבים (עמיתים תרבויות) ^16-22. עם תרבות משותפת המשך התאים יוצרים spheroids עם אשכולות fibroblasts בפנים ואת לתאי האפיתל בעיקר על הצד החיצוני של spheroids את ויוצרים רב תאיים תחזיות לתוך מטריקס. מניפולציה של fibroblasts שמוביל הפולשנות שינו תא אפיתל ניתן לכמת בקלות על ידי שינויים מספרים באורך של ²³ תחזיות אפיתל. יתר על כן, אנו פיתחו שיטה לבודד תאים אפיתל מתוך תרבות משותפת תלת מימדי המאפשר ניתוח של ההשפעות של חשיפה פיברובלסטים על התנהגות אפיתל. מצאנו כי ההשפעות של תרבות משותפת להימשך שבועות לאחר בידוד תא אפיתל, המתיר מספיק זמן כדי לבצע מבחני מרובים. שיטה זו ניתנת להתאמה של התאיםשינוי פוטנציאל ממאיר לא דורש ציוד מיוחד. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה של במודלים תאים במבחנה בתנאים רבים, את התוצאות המתאימות ניתן להשוות ברקמות ב vivo בבעלי חיים, כמו גם דגימות רקמה אדם.

Protocol

1. הקמת תלת ממדי שיתופי תרבויות

יום לפני להקים את שיתוף תרבויות, הסר Matrigel מהמקפיא להפשרה על קרח במקרר 4 ° C למשך הלילה.
ביום הניסוי, להכין את המדיום לתרבות משותפת, אשר תואמים את המדיום של תאים אפיתל כדי להשתמש בהם (בינוני HMEC בדוגמה זו: DME/F12 בינוני עם 10% שור נסיוב של עגלים, 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין , 1 מיקרוגרם / מ"ל הידרוקורטיזון, ו 1 ng / mL EGF). שמור את המדיום על הקרח שעה לפחות 1 לפני ערבוב עם Matrigel.
כדי לדלל את Matrigel מופשר, לקבוע את הכמות הרצויה כולל של Matrigel: בינוני (300 μL לכל טוב 24 גם צלחות) ולהוסיף חצי נפח בינוני קר כקרח HMEC לצינור סטרילית על הקרח. לאחר מכן להוסיף את אותו נפח של חצי הכולל של Matrigel מופשר לצינור להשיג דילול 01:01. שמור את הצינור על הקרח.
מקום 50 μL של Matrigel: תערובת בינוני באמצע היטב בארות ייעודיים של צלחת 24 גם וגםדגירה של 10 דק 'ב 37 ° C החממה באוויר humidified ו 5% CO _2.
הוסף μL נוסף של 450 Matrigel: תערובת בינוני עד בארות דגירה עוד 60 דקות.
במהלך הדגירה, להכין את ההשעיה של fibroblasts 01:01 (כאן ה-טרט, הנציח Fibroblasts הפחתת החלב המבטאים GFP) ותאי אפיתל (כאן ה-טרט, הנציח קו אנוש החלב תא אפיתל להביע RFP) בריכוז של 0.5 x 10 ⁵ תאים כל אחד ב 0.5 מ"ל של מדיום HMEC.
אחרי שלב 60 דקות הדגירה, בעדינות ושחרר את ההשעיה על התא העליון של ג'ל הקרושה, ולחזור התרבות בחממה.
נא לא להפריע התרבויות של 2 ימים. אחרי זה, המדיום יכול להיות שונה בכל 2-3 ימים על ידי בעדינות רבה aspirating בינוני מצד הבאר בעדינות להחליף עם המדיום HMEC טרי.
מעקב אחר היווצרות אליפטית יום תחת מיקרוסקופ. תרבויות בדרך כלל בוגר לאחר 10-14 ימים. התמונה בתורהמתאים באמצעות אור או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גודל אליפטית ואורך הקרנת ניתן למדוד תחת מיקרוסקופ אור.

2. בידוד של תאים אליפטית שיתופי תרבויות

בעדינות רבה, פיפטה התרבות מעלה 10x למטה באמצעות פיפטה סטרילית 2-מ"ל זכוכית. לחלופין, לנתק את קצה קצהו 1000 פלסטיק microliter פיפטה באמצעות מספריים מעוקרות ידי מעוקר או טבילה באתנול 70% כדי פיפטה התרבות. מעבירים את התרבות עם טפטפת או כוס או לחתוך את קצה הצינורית פלסטיק צינור צנטריפוגות סטרילית 15 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 5 דקות על סל"ד 2000 בטמפרטורת החדר. את spheroids הסלולר יהיה משקעים בתחתית.
השתמש עצה סטרילית פיפטה פסטר בעדינות כדי להסיר את Matrigel שיבשו מהחלק העליון של הצינור centrifuged.
הוסף 1 מ"ל בינוני HMEC על spheroids pelleted, פיפטה למעלה ולמטה 2-3 פעמים עם סטרילית 2 מ"ל זכוכית פיפטה, ולהעביר את התרבות גם ב 24 גםתרביות רקמה צלחת.
אפשר spheroids את לצרף מנה לפחות 48 שעות לפני שינוי בינוני. במשך הזמן התאים יעזבו את המבנים spheroidal ולגדול כמו monolayers.
התא מעבר תרבויות כאשר התאים מגיעים למפגש 50%. ראשית להרחיב את התרבות לצלחת 35 מ"מ (כ 2-4 ימים), ואז לצלחת 100 מ"מ (כ 3-5 ימים). בסמוך לפני שלב המעבר, השתמש סטרילית פיפטה פסטר להסיר באופן ידני כמו רבים "spheroids רפאים" שיורית ככל האפשר.
לנתח את התאים על ידי זרימה cytometry על טוהר האוכלוסייה באמצעות המתאימים שטח פני התא סמנים נוספים אוכלוסיות נפרדות תאים שונים על ידי מיון התא הקרינה במידת הצורך. תאים בודדים מוכנים כעת לניתוח נוסף לפי הצורך.

3. נציג תוצאות

ב תלת מימדי אליפטית שיתוף תרבויות, fibroblasts עם ההשתקה Tiam1 מהונדסים לגרום לפלישה גדל לתוך MAטריקס על ידי תאים אפיתל החלב (איור 1, השווה D, E, F ל A, B, C). Fibroblasts עם מהונדסים יתר ביטוי Tiam1 לגרום לפלישה מטריקס ירד ב קו סרטן השד SUM159 התא (איור 1, להשוות J, K, L ל G, H, I).

לאחר שיתוף תרבותי spheroids הוקמו, אוכלוסיות תאים יכול להיות מבודד spheroids על ידי ציפוי מחדש בהקשר דו מימדי, כפי שמוצג באיור 2. בהתאם את שיעורי הצמיחה היחסי של תאים שנבדקו, אוכלוסיות טהור יכול לצאת דרך מעבר סדרתי (כפי שמוצג באיור 3) או ניתן למיין באמצעות סמנים סלולריים מתאימים. לאחר במנותק מן 3D שיתוף תרבות, לתאי האפיתל לשמור את המאפיינים שמעניקה התרבות בשיתוף עם fibroblasts על פרקי זמן ארוכים, המאפשר מספיק הזדמנויות לניתוח. בדוגמה זו, חשיפה Tiam1 לקוי fibroblasts גרמו להגירה מוגברת ושיתוף תרבותי HMECs שנמשכה שבועות ארוכיםחרי במנותק מן התרבות המשותפת 3D (איור 4).

באיור 1. הדמיה של אליפטית הוקמה שיתוף תרבויות תחת מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי. תרבויות אליפטית מבוססים עם החלב שורות תאים אפיתל פיברובלסטים ואיפשר לצמוח בתרבות של 10-14 ימים. AF: אפיתל = HMEC-mCherry תאים. GL: ותאי אפיתל = SUM159-mCherry תאים. AC, במערכת העיכול: = שליטה RMF-GFP תאים פיברובלסטים. DF: פיברובלסטים = RMF-GFP עם ההשתקה Tiam1. JL: פיברובלסטים = RMF-GFP עם Tiam1 יתר הביטוי. החצים מצביעים על תחזיות אפיתל הפולשים לתוך מטריקס.

איור 2. הדמיה סידורי של תרבויות תחת מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי לאחר במנותק מן התרבות Matrigel. יום 0 מייצג הדמיה מיד לאחר הבידוד, בימים 1, 2 ו5 עולה ימים לאחר הבידוד. הילה של תאים היוצאים עולה אליפטית לאורך זמן. בסופו של דבר, "רוח רפאים" אליפטית עם תאים מעט מאוד נשאר (החץ). Spheroids מעט מאוד נשאר לאחר הסרת שד ומעבר 1.

איור 3
3. תרשים זרימה cytometry ניתוח של תאים לאחר במנותק מן Matrigel שיתוף תרבות. לאחר אליפטית שיתוף תרבויות הבשילו, תאים מבודדים 3D שיתוף תרבות עם pipetting ו passaging סדרתי. Aliquots מדגם מנותחים על ידי cytometry זרימה (בדוגמה זו באמצעות הקרינה פלואורסצנטי ירוק ואדום לזהות GFP-להביע fibroblasts mCherry ו-לבטא בתאי אפיתל בהתאמה) כדי לקבוע אוכלוסיות יחסית של תאים אפיתל פיברובלסטים.

איור 4. ההגירה Transwell של HMECs נמשכת לאחר isolatiעל פי Matrigel שיתוף תרבות. אחת האוכלוסיות טהורים התקבלו באמצעות התרבות או מיון התא הקרינה, תאים ניתן לנתח לפי הצורך. כאן ההגירה של HMECs שיתוף תרבותי עם שליטה או (ג) או Tiam1 לקויה (shT) fibroblasts ברחבי transwells מחורר הוערך ב 2 שבועות, 4 ו -8 לאחר במנותק מן התרבות המשותפת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המוצגת כאן מייצגת גישה פשוטה לניתוח השפעות fibroblasts סטרומה בתאי אפיתל, כולל תאים סרטניים. היא מאפשרת אינטראקציה תאים תאים ישירה בהקשר תלת מימדי נתמך על ידי מטריקס במרתף תאי הממברנה, תוך מתן אפשרות חילוץ קל של תאים מהמטריצה לניתוח נוסף. זה יכול להיות מיושם על מחקר של stroma הגידול הקשורים, כמו קווי פיברובלסטים ניתן להשפיע כדי להשפיע על מסלולי איתות של בחירה קווי אפיתל יכול להשתנות פוטנציאל פולשני, כפי שמוצג באיור 1. מודל 3D שיתוף התרבות מאפשר אימות ויזואלי שינויים הפולשנות התא היה מושרה. פרוטוקול הבידוד מאפשר מיצוי של תאים מן התרבויות 3D עם מינימום של טיפול ימנע את השימוש של טריפסין-Matrix או המסת חומרים אשר עשויים להשפיע על מאפייני תא. את ההשפעות של החשיפה פיברובלסטים ב 3D שיתוף תרבות להתמיד לתאי האפיתל באחורי הספינהאה במנותק מן התרבות המשותפת 3D, להקל על ניתוח מאוחר יותר (איור 4). בעוד דוגמה המוצג כאן מתאר השפעות על נדידת תאים, assay כל החלים על תאים הגדלים 2D ניתן להשתמש בתאים מבודדים. השתמשנו בשיטה זו כדי לנתח את ההשפעות של שינוי Tiam1 ביטוי פיברובלסטים על התנהגות הקשורים לתאי האפיתל החלב. Tiam1 חסר fibroblasts מקדמת תא החלב הפלישה הגידול גרורות בתרבות 3D ו גידול בעלי חיים דגמים ^23. שיטה זו אפשרה לנו לנתח את המסלולים המעורבים פוטנציאליים בעזרת מבחני מולקולרית, ביוכימית, ופונקציונלי (ליו בוקסבאום, in press).

חשוב להשתמש רק שורות תאים במצב בריאותי מעולה לדבוק בטכניקה סטרילית קפדני על מנת למנוע זיהום של תרבויות במהלך התהליך. את התוצאות הטובות ביותר מושגות באמצעות תאים מן המוקדמות ולא מעברים המאוחרות (מספר המעבר המדויק משתנה בהתאם specifהכרוניות תאים סלולריים קו) ומ שנקטפו על צפיפות מפגש בין 50-80%. הטיפול המדויק של Matrigel פי הפרוטוקול היא המפתח על מנת לאפשר גם liquification מלאה לקראת הקמת שותף תרבויות ולהבטיח מיצוק יסודית של מטריקס, לפני כן של התאים. כמות בלתי מספקת או מיצוק של מטריקס תגרום התאים גוברת ככל monolayer ולא spheroids ב התרבויות. כאשר 1 הקמת אליפטית שיתוף תרבויות, את המיקום של התוספת הראשונה 50 μl בבאר מאפשר מיצוק עיגון מוצק ואחיד יותר של מטריקס הסופי, שהוא המפתח להיווצרות אליפטית יחולקו בצורה שווה. הסרת כל spheroids רפאים בבית אחרי בידוד צעדים המעבר הוא קריטי אם מיון התא אוטומטית היא לשמש כדי להפריד בין אוכלוסיות מעורבות. הדוגמאות שהובאו כאן להשתמש פנול אדום Matrigel חינם עם הרכב החלבון של כ 10 מ"ג / מ"ל. הכנה פנול אדום חינם מאפשר זיהוי צבע אסאי"ש, כגון הקרינה.

טכניקה זו ניתן ליישם במגוון רחב של סוגי תאים על מנת לחקור את ההשפעות של fibroblasts סטרומה על גידולים הקשורים תא אפיתל או לחילופין את ההשפעות של תאים סרטניים על fibroblasts הכרוכים בכך. טכניקה זו מאפשרת הערכה מהירה של במודלים תאים במבחנה בתנאים רבים, את התוצאות המתאימות אז יכול להיות לעומת ברקמות ב vivo בבעלי חיים, כמו גם דגימות רקמה אדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	Phenol-red free
Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30023.01
Hyclone Bovine Calf Serum	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH3007303
Insulin	EMD Millipore	407709	Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001	Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter